多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置及加載方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置及加載方法，加載裝置包括伺服電機(jī)、動作腔室、動作活塞、加壓腔室、活動壁板、傳動桿、壓力、溫度傳感器等，伺服電機(jī)通過PC由運(yùn)動控制卡控制，并與傳動桿連接，傳動桿與動作活塞連接，伺服電機(jī)通過傳動桿帶動活塞上下運(yùn)動。加壓腔室的前側(cè)壁設(shè)可開合活動壁板。該裝置經(jīng)消毒滅菌操作后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，將骨骼細(xì)胞懸液種植于多孔鈦合金，加壓系統(tǒng)對多孔鈦合金中的細(xì)胞進(jìn)行壓縮載荷的刺激。系統(tǒng)工作時的壓力、溫度和濕度傳感器將其實(shí)時采集的壓力、溫度等信號傳送至數(shù)據(jù)采集卡中，通過PC端在顯示器上實(shí)時顯示和存儲。
【專利說明】多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置及加載方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞加載壓縮應(yīng)力的裝置及壓縮應(yīng)力的加載方法，以實(shí)現(xiàn)對種植在多孔鈦合金表面的體外培養(yǎng)的骨骼細(xì)胞(包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨細(xì)胞)施加應(yīng)力載荷的刺激，并進(jìn)一步研究這些骨骼細(xì)胞的力學(xué)生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為應(yīng)力載荷協(xié)同多孔鈦合金對臨床上骨缺損的治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。
【背景技術(shù)】
[0002]骨缺損的修復(fù)和功能重建是骨科臨床的常見病和難治病，其中尤以長骨的大段骨缺損的修復(fù)最為困難。我國肢體不自由患者有1500萬人以上，其中由于缺乏重建手術(shù)和材料，已有約300萬人截肢；我國每年大約有350萬人因不同原因(包括交通和運(yùn)動事故、意外傷害、人口老齡化、病變等)出現(xiàn)骨缺損，而骨骼不健全的人數(shù)也有上千萬之多，且有日益增多的趨勢。不少骨缺損病人并未實(shí)施手術(shù)，特別是大段骨缺損患者不得不實(shí)施截肢手術(shù)或用假肢替代。骨缺損給患者帶來極大的痛苦，給家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。
[0003]臨床上對于小于6cm的節(jié)段性缺損可通過傳統(tǒng)的自體骨或人工骨移植恢復(fù)患肢的長度和功能。但大段骨缺損的修復(fù)治療則較復(fù)雜，運(yùn)用最廣泛的方法為帶血供的自體骨移植、同種異體骨移植和牽拉成骨技術(shù)等，但這些方法均存在各自的不足。帶血管的自體骨移植愈合快而牢固，但通常受到來源的限制，且取骨量有限，并會在供區(qū)造成新的骨缺損，且取骨區(qū)有感染、疼痛等并發(fā)癥發(fā)生。異體骨移植是替代自體骨移植的良好材料，多用于修復(fù)腫瘤切除所致的缺損，但其并發(fā)癥及失敗率較高，且還具有引發(fā)免疫排異反應(yīng)和疾病傳播等風(fēng)險(xiǎn)。牽拉成骨是 在牽引應(yīng)力作用下，逐漸牽開兩個有血供的骨表面，使骨表面之間形成新骨。但其具有時間長的缺點(diǎn)，而且感染、延遲愈合、肌肉攣縮和關(guān)節(jié)僵直等并發(fā)癥的發(fā)生率很高。
[0004]鈦合金憑借其優(yōu)良的生物相容性、抗腐蝕性、綜合力學(xué)性能和工藝性能已成為牙種植體、骨創(chuàng)傷產(chǎn)品以及人工關(guān)節(jié)等人體硬組織替代物和修復(fù)物的首選材料。而將鈦合金制備成多孔結(jié)構(gòu)后，在植入長骨中后不僅可形成體液傳輸通道，利于成骨細(xì)胞在鈦合金孔隙中的生長并礦化形成新生的骨組織，同時能夠在骨小梁水平上實(shí)現(xiàn)彈性模量的匹配，可以實(shí)現(xiàn)骨小梁與合金多孔結(jié)構(gòu)的機(jī)械鉚合，因此在骨缺損的修復(fù)治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。但在動物實(shí)驗(yàn)中人們發(fā)現(xiàn):骨組織在多孔材料的表層長入較好，但卻難以完全長入大體積多孔鈦合金材料內(nèi)部；在骨小梁水平上，骨組織與鈦合金材料不能達(dá)到完全骨整合。
[0005]大量研究證實(shí)外源性的施加適當(dāng)強(qiáng)度生理水平的周期載荷刺激可以顯著提高骨量和骨強(qiáng)度。生理水平的周期應(yīng)力載荷刺激能夠提高正常和骨質(zhì)疏松動物的骨量、改善松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的微結(jié)構(gòu)、提高骨的力學(xué)強(qiáng)度、促進(jìn)骨生成并抑制骨吸收。而對于骨折的實(shí)驗(yàn)動物，將骨折部位經(jīng)適當(dāng)固定后再施加周期性載荷刺激，能加速骨痂生長，促進(jìn)骨折愈合并增加愈合處的強(qiáng)度和剛度。臨床研究證實(shí)，力學(xué)載荷刺激(如有氧慢跑、中強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練等)可以有效提升絕經(jīng)后婦女的骨密度，抑制絕經(jīng)后的高骨代謝并降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。因此，我們提出一種將周期載荷與多孔鈦合金協(xié)同作用修復(fù)治療骨缺損的設(shè)計(jì)思想，為多孔鈦合金的修復(fù)區(qū)域構(gòu)建其原本缺失的力學(xué)微環(huán)境，有望在較大程度上提高骨缺損的修復(fù)效率。
[0006]針對以上設(shè)計(jì)思想，我們需要將周期載荷對植入種植體表面的骨骼細(xì)胞生物學(xué)影響進(jìn)行系統(tǒng)研究評估，從而明確周期載荷對于成骨細(xì)胞與鈦合金表面的生物兼容性的關(guān)系，為周期載荷對于改善鈦植入物的骨整合作用的相關(guān)機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為深入開展種植在多孔鈦合金表面的骨骼細(xì)胞力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，以及為應(yīng)力載荷協(xié)同多孔鈦合金對臨床上骨缺損治療提供科學(xué)理論依據(jù)，本發(fā)明的目的是提供一種對種植在多孔鈦合金表面的骨骼細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)壓縮載荷的空氣動態(tài)壓加載裝置及相應(yīng)的壓應(yīng)力加載方法，以實(shí)現(xiàn)對骨骼細(xì)胞在其適宜的生長環(huán)境下施加應(yīng)力載荷的刺激。
[0008]為達(dá)到以上目的，本發(fā)明是采取如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置，其特征在于，包括一個矩形的加壓腔室，其前側(cè)設(shè)有一可開合的活動壁板，加壓腔室上面連通一個筒形的動作腔室，其中設(shè)置動作活塞，該動作活塞上面連接一傳動桿，傳動桿通過傳動組件連接伺服電機(jī)，該伺服電機(jī)由一臺PC通過運(yùn)動控制卡控制該伺服電機(jī)通過傳動組件驅(qū)動傳動桿帶動動作活塞在動作腔室進(jìn)行上下運(yùn)動，進(jìn)而在加壓腔室中產(chǎn)生壓縮載荷，并最終作用于事先放置于加壓腔室中的多孔鈦合金骨骼細(xì)胞試樣，加壓腔室中至少設(shè)置有壓力傳感器和溫度傳感器。
[0010]上述方案中，所述的動作腔室和加壓腔室均由熱傳導(dǎo)性能良好、且透明的聚甲基丙烯酸甲酯材料制成。
[0011]一種多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載方法，采用前述多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置完成，其特征在于，包括下述步驟:
[0012](I)將壓應(yīng)力加載裝置用鈷60放射性消毒，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中；
[0013](2)將多孔鈦合金進(jìn)行消毒處理，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨后將經(jīng)傳代消化處理的骨骼細(xì)胞懸液滴入多孔鈦合金中，將細(xì)胞培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時待細(xì)胞完全粘附于多孔鈦合金表面；
[0014](3)隨后加入細(xì)胞培養(yǎng)液覆蓋多孔鈦合金，靜置12小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)板經(jīng)活動壁板放入加壓腔室中；
[0015](4)在PC端設(shè)置需要的周期載荷的加載強(qiáng)度、頻率和加載時間，通過運(yùn)動控制卡控制伺服電機(jī)，伺服電機(jī)按照設(shè)定參數(shù)通過傳動組件驅(qū)動傳動桿帶動動作活塞對加壓腔室內(nèi)的多孔鈦合金表面的骨骼細(xì)胞施加周期載荷；
[0016](5)PC端通過數(shù)據(jù)采集卡實(shí)時動態(tài)的采集各傳感器的信號，并通過顯示器將信號的變化以曲線形式顯現(xiàn)出來。
[0017]上述方法中，步驟(4)所述周期載荷的加載強(qiáng)度為60kPa，加載頻率為0.5Hz，加載時間為每天lh，連續(xù)3天。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，操作 簡單，能夠使種植在多孔鈦合金表面的骨骼細(xì)胞在其適宜的生長環(huán)境中對細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)的壓縮應(yīng)力載荷的刺激，可顯著提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，并可較真實(shí)的模擬骨骼細(xì)胞在其原位骨骼生長環(huán)境的受力狀況。對于細(xì)胞所受應(yīng)力及其周圍溫度、濕度的實(shí)時數(shù)據(jù)采集、監(jiān)測和存儲可以提高實(shí)驗(yàn)的精確性。該應(yīng)力加載系統(tǒng)可用于研究應(yīng)力載荷對種植在多孔鈦合金中的骨骼細(xì)胞的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)機(jī)制，為應(yīng)力載荷協(xié)同多孔鈦合金應(yīng)用于臨床治療修復(fù)骨缺損提供重要的理論依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為發(fā)明裝置的結(jié)構(gòu)圖。圖中:1、伺服電機(jī)；2、動作腔室；3、動作活塞；4、加壓腔室；5、活動壁板；6、傳動桿；7、傳感器(包括壓力、溫度和濕度傳感器)。
[0020]圖2為圖1加載裝置中多孔鈦合金骨骼細(xì)胞試樣應(yīng)力加載的信號采集、處理及控制的原理框圖。
[0021]圖3為實(shí)驗(yàn)組和對照組成骨細(xì)胞在多孔鈦合金中的細(xì)胞增殖情況(490nm下的吸光值)的比較。
[0022]圖4為圖1加載裝置進(jìn)行加壓的過程中加壓系統(tǒng)壓力傳感器與標(biāo)準(zhǔn)測壓計(jì)所測的壓力值的比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合附圖及具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0024]如圖1所示，本發(fā)明多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置包括一個矩形的加壓腔室4，其前側(cè)設(shè)有一可拆卸活動壁板5，可以方便細(xì)胞培養(yǎng)器皿的取放。加壓腔室上面連通一個筒形的動作腔室2，其中設(shè)置動作活塞3，該動作活塞上面連接一傳動桿6，傳動桿通過齒輪連接伺服電機(jī)I的轉(zhuǎn)動軸。伺服電機(jī)采用MCAC706-N全數(shù)字交流伺服型電機(jī)，由基于PC的LabVIEW軟件控制程序通過運(yùn)動控制卡DMC1380 (圖2)從而控制交流伺服電機(jī)，保證獲得精確的運(yùn)動控制。交流伺服電機(jī)通過齒輪驅(qū)動傳動桿進(jìn)而帶動動作活塞3在動作腔室2中進(jìn)行上下運(yùn)動，最后在加壓腔室4中產(chǎn)生壓縮載荷。動作腔室和加壓腔室均由熱傳導(dǎo)性能良好、且透明度高的聚甲基丙烯酸甲酯材料制成。加壓腔室中設(shè)有多個傳感器7(可包括壓力、溫度、濕度三個傳感器)，系統(tǒng)在工作時，壓力傳感器、溫度傳感器和濕度傳感器將其實(shí)時采集的電信號傳送至數(shù)據(jù)采集卡(NI USB-6008)，通過基于PC端的LabVIEW軟件控制程序在PC上實(shí)時顯示和存儲壓力、溫度、濕度信號。
[0025]參見圖1圖2，本發(fā)明多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力加載的方法，包括下述步驟:
[0026](I)將圖1裝置用鈷60放射性消毒，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中；
[0027](2)將多孔鈦合金(--2448)進(jìn)行高溫、高壓的消毒處理，置于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨后將經(jīng)傳代消化處理的離體鼠脛骨骨骼細(xì)胞懸液滴入多孔鈦合金中，將細(xì)胞培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時待細(xì)胞完全粘附于多孔鈦合金表面；
[0028](3)隨后加入細(xì)胞培養(yǎng)液覆蓋多孔鈦合金，靜置12小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)板經(jīng)活動壁板5放入加壓腔室4中；
[0029](4)在PC端通過LabVIEW軟件控制程序設(shè)置需要的周期載荷的加載強(qiáng)度、頻率和加載時間，通過控制運(yùn)動控制卡驅(qū)動交流伺服電機(jī)，保證獲得精確的運(yùn)動控制，交流伺服電機(jī)I按照設(shè)定參數(shù)通過傳動桿6帶動動作活塞3對加壓腔室內(nèi)的多孔鈦合金表面的骨骼細(xì)胞施加周期載荷；
[0030](5) PC端通過LabVIEW軟件控制程序由數(shù)據(jù)采集卡實(shí)時動態(tài)的采集壓力、溫度和濕度傳感器的信號，并通過顯示器將壓力、溫度和濕度信號的變化以曲線形式顯現(xiàn)出來。
[0031]加壓和不加壓的對比試驗(yàn)[0032]取新生乳鼠顱骨組織，采用組織塊法分離原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，加入10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，置于37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，通過測定堿性磷酸酶特異性表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)鑒定成骨細(xì)胞，取傳代2~4代的成骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。細(xì)胞分實(shí)驗(yàn)組和對照組，兩組均以2X 104/ml的密度接種于多孔鈦合金表面并分別置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)組放入圖1應(yīng)力加載裝置的加壓腔室中，該裝置置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中使細(xì)胞在5% CO2濃度，37°C條件下生長，實(shí)驗(yàn)組施加60kPa空氣動態(tài)周期壓縮載荷刺激，加壓頻率為0.5Hz。每天加壓lh，連續(xù)作用3天。對照組細(xì)胞放入加壓腔室中，但不給予應(yīng)力加載的刺激。3天后取出細(xì)胞，先用PBS洗去多孔鈦合金中未黏附的細(xì)胞，每孔加入5g/L的ΜΤΤ200μL，37°C孵育4h后吸棄上清，加入ImL的DMSO溶解生成結(jié)晶物，每孔吸取200 μ L溶解液轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使用酶標(biāo)儀測量490nm下的吸光值，結(jié)果參見圖3。
[0033]由圖3所示，相比于對照組，空氣動態(tài)周期壓縮載荷刺激下的細(xì)胞其在490nm下的吸光值顯著升高(η = 10,Ρ<0.05)，表明空氣動態(tài)周期壓縮載荷刺激對成骨細(xì)胞在多孔鈦合金中的細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用。
[0034]加載裝置加壓腔室壓力校準(zhǔn)方法:
[0035]將德國菲索AFRISO公司的手持式測壓儀放入圖1裝置的加壓腔室4中，通過動作腔室2、動作活塞3對加壓腔室施加載荷，伺服電機(jī)每旋轉(zhuǎn)25圈(動作活塞向下運(yùn)動)，PC端的LabVIEW軟件控制程序進(jìn)行一次壓力數(shù)據(jù)的采集，同時讀取手持式測壓所測量的壓力值，對所采樣的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行直線線性擬合，比較加載裝置進(jìn)行加壓的過程中加壓系統(tǒng)壓力傳感器與標(biāo)準(zhǔn)測壓計(jì)所測的壓力值。測量結(jié)果如圖4所示，由圖可見本發(fā)明的應(yīng)力加載系統(tǒng)與標(biāo)準(zhǔn)測壓計(jì)所測的壓力值具有良好的匹配性，證實(shí)了該加壓裝置的良好工作精確性。
【權(quán)利要求】
1.一種多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置，其特征在于，包括一個矩形的加壓腔室，其前側(cè)設(shè)有一可開合的活動壁板，加壓腔室上面連通一個筒形的動作腔室，其中設(shè)置動作活塞，該動作活塞上面連接一傳動桿，傳動桿通過傳動組件連接伺服電機(jī)，該伺服電機(jī)由一臺PC通過運(yùn)動控制卡控制該伺服電機(jī)通過傳動組件驅(qū)動傳動桿帶動動作活塞在動作腔室進(jìn)行上下運(yùn)動，進(jìn)而在加壓腔室中產(chǎn)生壓縮載荷，并最終作用于事先放置于加壓腔室中的多孔鈦合金骨骼細(xì)胞試樣，加壓腔室中至少設(shè)置有壓力傳感器和溫度傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置，其特征在于，所述的動作腔室和加壓腔室均由熱傳導(dǎo)性能良好、且透明的聚甲基丙烯酸甲酯材料制成。
3.—種多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載方法，采用權(quán)利要求1所述的多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載裝置完成，其特征在于，包括下述步驟: (1)將壓應(yīng)力加載裝置用鈷60放射性消毒，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中； (2)將多孔鈦合金進(jìn)行消毒處理，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，隨后將經(jīng)傳代消化處理的骨骼細(xì)胞懸液滴入多孔鈦合金中，將細(xì)胞培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時待細(xì)胞完全粘附于多孔鈦合金表面； (3)隨后加入細(xì)胞培養(yǎng)液覆蓋多孔鈦合金，靜置12小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)板經(jīng)活動壁板放入加壓腔室中； (4)在PC端設(shè)置需要的周期載荷的加載強(qiáng)度、頻率和加載時間，通過運(yùn)動控制卡控制伺服電機(jī)，伺服電機(jī)按照設(shè)定參數(shù)通過傳動組件驅(qū)動傳動桿帶動動作活塞對加壓腔室內(nèi)的多孔鈦合金表面的骨骼細(xì)胞施加周期載荷； (5)PC端通過數(shù)據(jù)采集卡實(shí)時動態(tài)的采集各傳感器的信號，并通過顯示器將信號的變化以曲線形式顯現(xiàn)出來。
4.如權(quán)利要求3所述的多孔鈦合金中骨骼細(xì)胞壓應(yīng)力的加載方法，其特征在于，步驟(4)所述周期載荷的加載強(qiáng)度為60kPa，加載頻率為0.5Hz，加載時間為每天lh，連續(xù)3天。
【文檔編號】C12N5/077GK103992947SQ201410228727
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】景達(dá), 羅二平, 劉戈, 佟世超, 翟明明, 申廣浩 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)