一種細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了細(xì)胞培養(yǎng)板及其的制備方法和應(yīng)用。所述在細(xì)胞培養(yǎng)板，表面涂覆有一層羧基丁腈膠乳膜，所述膜上偶聯(lián)有RGD多肽。本發(fā)明通過(guò)羧基丁腈在培養(yǎng)板表面引入羧基偶聯(lián)RGD短肽來(lái)改變細(xì)胞在培養(yǎng)板表面的貼壁能力。該細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)細(xì)胞板具備工藝簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，并且該培養(yǎng)板適用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，使細(xì)胞貼壁更加牢固并獲得更穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法和在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，屬于細(xì)胞培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一群具有多種分化潛能的多能干細(xì)胞，能最終分化成骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)和脂肪等組織，具有以下特點(diǎn):①來(lái)源較為廣泛，易于培養(yǎng)，能在宿主體內(nèi)外長(zhǎng)期存活，且具有自我更新和增殖能力；②低免疫源性，易于外源基因轉(zhuǎn)染和長(zhǎng)期表達(dá)
在適宜的環(huán)境中具有多項(xiàng)分化潛能等。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有抑制同種異體免疫反應(yīng)、減輕移植物抗宿主效應(yīng)的作用，以上發(fā)現(xiàn)使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程、器官移植及自身免疫性疾病領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外增殖較慢，因此，如何實(shí)現(xiàn)少量取樣批量體外培養(yǎng)增殖，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用研究的當(dāng)務(wù)之急。
[0003]文獻(xiàn)Villa-Diaz等報(bào)道稱(chēng)聚合物涂層PMEDSAH能夠支持人胚胎干細(xì)胞在多種不同的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期生長(zhǎng)。這種成分確定的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)于闡明人胚胎干細(xì)胞行為的內(nèi)在機(jī)制和最優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用條件有著重要意義(Luis G Villa-Diaz, HimabinduNandivadajJun Ding, et al.Synthetic polymer coatings for long-term growth ofhuman embryonic stem cells.Nature biotechnology28 (2010): 581-583.)。Blin 等米用不同交聯(lián)度的聚賴氨 酸/透明質(zhì)酸納米膜來(lái)調(diào)控鼠胚胎干細(xì)胞的納米環(huán)境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞在天然膜上的粘附程度最低，能夠較好地保持多功能性，隨著交聯(lián)度的增加，粘附程度增加(Guillaume Blinj Nassrine Lablackj Marianne Louis-Tisserandj etal.Nano-scale control of cellular environment to drive embryonic stem cellsselfrenewal and fate.Biomaterials31 (2010): 1742 - 1750.)。Hernandez 等為了簡(jiǎn)化人干細(xì)胞培養(yǎng)條件，采用CELLstart基質(zhì)和成分確定的培養(yǎng)基在無(wú)飼養(yǎng)層的條件下實(shí)現(xiàn)了人胚胎干細(xì)胞的自我復(fù)制。實(shí)驗(yàn)中采用的兩種人胚胎干細(xì)胞都能夠在該條件下傳代20多次，并且保持多功能性(Diana Hernandez, Ludmila Rub an, and Christopher Mason.Feeder-free culture of human embryonic stem cells for scalable expansion in areproducible manner.Stem Cells and Development〗。(2011): 1089-1099.) oMarkert 等設(shè)計(jì)了生物表面結(jié)構(gòu)陣列(BSSA)用于培養(yǎng)鼠胚胎干細(xì)胞，該陣列包括504種不同的表面微結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在一種特定的表面微結(jié)構(gòu)使得干細(xì)胞能在無(wú)飼養(yǎng)層的條件下增殖(LotteD’Andrea Markert, Jette Lovmand, Morten Foss,et al.1dentification of distincttopographical surface microstructures favoring either undifferentiatedexpansion or differentiation of murine embryonic stem cells.Stem Cells andDevelopmentl8 (2009):1331-1343.)。這些現(xiàn)有技術(shù)存在制備成本高，特別是使用動(dòng)物中提取的細(xì)胞外基質(zhì)可能含有一些致病物質(zhì)會(huì)損害細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，因而無(wú)法大規(guī)模生產(chǎn)。
[0004]羧基丁腈膠乳(XNBRL)是作為是丁二烯、丙烯腈和丙烯酸或甲基丙烯酸的三元共聚物。與未引入羧基的丁腈膠乳相比，XNBRL具有突出的機(jī)械穩(wěn)定性和凍解穩(wěn)定性，其黏合性和與其他高分子的相容性也得到較大改善，它可以用金屬氧化物進(jìn)行硫化，所得膠乳薄膜的機(jī)械強(qiáng)度和耐油性均優(yōu)于非羧化的丁腈膠乳。據(jù)大量文獻(xiàn)表示羧基丁腈膠乳具備天然膠乳的一些性能，羧基丁腈膠乳由丁二烯和甲基丙烯酸乳液共聚制得的橡膠膠乳，在分子主鏈上含有親水的強(qiáng)粘性集團(tuán)羧基，可避免生霉，蟲(chóng)蛀，產(chǎn)品質(zhì)量高且穩(wěn)定，有較好的柔順性、耐油性、耐化學(xué)性、耐刺穿性和耐磨性能，低可提物以及耐靜電性能，粘接性能較好且價(jià)格便宜。
[0005]有相關(guān)專(zhuān)利CN102911866 A發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，其包括:電極，在該電極表面上設(shè)置有通過(guò)電方式在親水性和疏水性之間變化的親水性/疏水性轉(zhuǎn)換物質(zhì)。在該情況中，電極設(shè)置于適合容納待培養(yǎng)細(xì)胞的區(qū)域中。使用該細(xì)胞培養(yǎng)裝置，向電極施加合適的電壓改變了親水性/疏水性轉(zhuǎn)換物質(zhì)的親水性/疏水性。因此，吸附至親水性/疏水性轉(zhuǎn)換物質(zhì)的原料被脫附，由此可以將原料供給至細(xì)胞。該技術(shù)使用電極裝置，工藝復(fù)雜，親水性和疏水性的轉(zhuǎn)換會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。本發(fā)明直接在細(xì)胞培養(yǎng)板表面涂抹羧基丁腈膠乳，相對(duì)于之前現(xiàn)有的專(zhuān)利發(fā)明，有著成本低，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞培養(yǎng)板及其制備方法，該細(xì)胞培養(yǎng)板表面涂覆羧基丁腈膠乳通過(guò)化學(xué)健合偶聯(lián)RGD短肽。。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，一種細(xì)胞培養(yǎng)板，在細(xì)胞培養(yǎng)板表面涂覆有一層羧基丁腈膠乳膜，所述膜上偶聯(lián)有RGD多肽。本發(fā)明還公開(kāi)了所述細(xì)胞培養(yǎng)板的制備方法，使用EDC (碳化二亞胺)和NHS (羥基琥珀酰亞胺)以及MES (2-嗎啉乙磺酸水合物)偶聯(lián)方法在培養(yǎng)板表面接枝引入多肽。所述多肽是RGD短肽，具體序列為RGDKKK。 [0008]具體的制備步驟如下:
[0009](I)將聚苯乙烯培養(yǎng)板用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗，真空干燥，備用；
[0010](2)將羧基丁腈膠乳滴加到步驟(1)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，然后將滴加過(guò)羧基丁腈膠乳的聚苯乙烯培養(yǎng)板放入60°C真空干燥箱中30分鐘；
[0011](3)用電子天平稱(chēng)取4.78~7.17克碳化二亞胺、3~4.604克羥基琥珀酰亞胺以及10~12.1875克2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用；
[0012](4)將(3)中所配的溶液滴加到步驟(2)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，放入30°C烘箱2小時(shí)；
[0013](5)將(4)中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將I~2g/L的RGD多肽溶液加入(4)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔I~2mL，并放在搖床上反應(yīng)24小時(shí)。
[0014](6)24小時(shí)過(guò)后，將(5)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用PH = 7.35的磷酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存封存制得本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0015]本發(fā)明還提供了所述細(xì)胞培養(yǎng)板在培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0016]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以5X IO3細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)7天并測(cè)試細(xì)胞活力(MTT試驗(yàn))，通過(guò)細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活性來(lái)顯示細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。
[0017]本發(fā)明采用在聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板表面涂覆羧基丁腈膠乳薄層并偶聯(lián)RGD短肽以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。相比其它復(fù)雜工藝方法而言，本工藝簡(jiǎn)單易行，采用羧基丁腈膠乳因其具備良好的親水性能，且具有較好的生物相容性，對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)板表面偶聯(lián)RGD短肽來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞貼壁能力，可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明直接在細(xì)胞培養(yǎng)板表面涂抹羧基丁腈膠乳，相對(duì)于之前現(xiàn)有的專(zhuān)利發(fā)明，有著成本低，操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為了更加完整的了解本發(fā)明的有點(diǎn)和特點(diǎn)，下面結(jié)合具體實(shí)施案例來(lái)進(jìn)一步介紹本發(fā)明。實(shí)施例一:涂覆羧基丁腈膠乳偶聯(lián)RGD短肽的細(xì)胞培養(yǎng)板的制備
[0019](I)將聚苯乙烯培養(yǎng)板用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗三遍，真空干燥，備用。
[0020](2)將羧基丁腈膠乳滴加到步驟⑴的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部(約8滴)，然后將滴加過(guò)羧基丁腈膠乳的聚苯乙烯培養(yǎng)板放入60°C真空干燥箱中30分鐘。
[0021](3)用電子天平稱(chēng)取7.17gEDC (碳化二亞胺)、4.604gNHS (羥基琥珀酰亞胺)以及12.1875gMES(2-嗎啉乙磺酸水合物)，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用。
[0022](4)將(3)中所配的溶液滴加到步驟(2)的培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部(約5滴)，放入30°C烘箱2小時(shí)。
[0023](5)將⑷中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將lg/L的RGD多肽溶液加入⑷中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2mL，并放在搖床上反應(yīng)24小時(shí)。
[0024](6)24小時(shí)過(guò) ，沖洗后烘干，封存。
[0025](7)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)MTT代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)上述處理的細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞增殖平均值高于未處理培養(yǎng)板6.2%。
[0026]實(shí)施例二:涂覆羧基丁腈膠乳偶聯(lián)RGD短肽的細(xì)胞培養(yǎng)板的制備
[0027](I)將聚苯乙烯培養(yǎng)板用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗三遍，真空干燥，備用。
[0028](2)將羧基丁腈膠乳滴加到步驟(1)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部(約8滴)，然后將滴加過(guò)羧基丁腈膠乳的聚苯乙烯培養(yǎng)板放入60°C真空干燥箱中60分鐘。
[0029](3)用電子天平稱(chēng)取4.78gEDC (碳化二亞胺)、6.906gNHS (羥基琥珀酰亞胺)以及18.28gMES (2-嗎啉乙磺酸水合物)，用100mL蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用。
[0030](4)將(3)中所配的溶液滴加到步驟(2)的培養(yǎng)板中液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部(約5滴)，放入30°C烘箱5小時(shí)。
[0031](5)將⑷中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將2g/L的RGD多肽溶液加入⑷中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔3mL，并放在搖床上反應(yīng)36小時(shí)。
[0032](6)36小時(shí)過(guò)后，將(5)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用大量的PH = 7.35的PBS(磷酸緩沖溶液)沖洗，沖洗后烘干，封存。
[0033](7)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)MTT代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)上述處理的細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞增殖平均值高于未處理培養(yǎng)板8.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)板，其特征在于，在細(xì)胞培養(yǎng)板表面涂覆有一層羧基丁腈膠乳膜，所述膜上偶聯(lián)有RGD多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)板，其特征在于按照以下方法制備得到: (1)將聚苯乙烯培養(yǎng)板用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗，真空干燥，備用； (2)將羧基丁腈膠乳滴加到步驟(1)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，然后將滴加過(guò)羧基丁腈膠乳的聚苯乙烯培養(yǎng)板放入60°C真空干燥箱中30分鐘； (3)用電子天平稱(chēng)取4.78~7.17克碳化二亞胺、3~4.604克羥基琥珀酰亞胺以及10~12.1875克2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用； (4)將(3)中所配的溶液滴加到步驟(2)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，放入30°C烘箱2小時(shí)； (5)將⑷中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將I~2g/L的RGD多肽溶液加入⑷中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔I~2mL，并放在搖床上反應(yīng)24小時(shí)。 (6)24小時(shí)過(guò)后，將(5)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用PH= 7.35的磷酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
3.一 種制備權(quán)利要求1所述細(xì)胞培養(yǎng)板的方法，其特征在于使用碳化二亞胺、羥基琥珀酰亞胺以及2-嗎啉乙磺酸水合物偶聯(lián)方法在培養(yǎng)板表面接枝引入多肽。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述多肽的序列為RGDKKK。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將聚苯乙烯培養(yǎng)板用無(wú)水乙醇、蒸餾水洗，真空干燥，備用； (2)將羧基丁腈膠乳滴加到步驟(1)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，然后將滴加過(guò)羧基丁腈膠乳的聚苯乙烯培養(yǎng)板放入60°C真空干燥箱中30分鐘； (3)用電子天平稱(chēng)取4.78~7.17克碳化二亞胺、3~4.604克羥基琥珀酰亞胺以及10~12.1875克2-嗎啉乙磺酸水合物，用50ml蒸餾水將其溶解，放入4°C冰箱，備用； (4)將(3)中所配的溶液滴加到步驟(2)的培養(yǎng)板中，液面要完全覆蓋培養(yǎng)板底部，放入30°C烘箱2小時(shí)； (5)將⑷中的培養(yǎng)板中的混合液體棄之，并將I~2g/L的RGD多肽溶液加入⑷中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔I~2mL，并放在搖床上反應(yīng)24小時(shí)。 (6)24小時(shí)過(guò)后，將(5)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中的液體棄置，并用PH= 7.35的磷酸緩沖溶液沖洗，沖洗后烘干，封存。
6.權(quán)利要求1所述細(xì)胞培養(yǎng)板在培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103966096SQ201410226720
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】朱沛志, 陳金帥, 趙陽(yáng), 李平 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)