Yep非特異性核酸酶、基因、載體、工程菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Yep非特異性核酸酶、基因、載體、工程菌及應用，所述Yep非特異性核酸酶，所述酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；本發(fā)明所述的Yep非特異性核酸酶能降解各類PCR擴增產(chǎn)物，單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA，且具有廣泛的適用性：耐酸堿、耐冷熱、耐化學物質(zhì)，為該核酸酶的工業(yè)化應用打下基礎。
【專利說明】Yep非特異性核酸酶、基因、載體、工程菌及應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸酶，特別涉及一種Yep非特異性核酸酶、編碼基因、載體、工 程菌及應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 核酸酶是以核酸為底物，催化磷酸二酯鍵水解的一類酶。核酸酶可以分為DNA酶、 RNA酶和非特異性核酸酶三類，其中非特異性核酸酶是一類高活性的水解酶，能非特異性 地降解幾乎所有形式的核酸，包括單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA，且對 核酸的序列沒有要求。非特異性核酸酶具有許多重要功能，主要體現(xiàn)在以下許多方面：首 先，在遺傳機制方面，例如避免突變、DNA修復、DNA復制和重組、為生長代謝清除核苷和磷 酸、防御外源核酸侵入、參與細胞凋亡等；其次，在疾病的診斷和治療上，非特異性核酸酶參 與細胞成熟、細胞凋亡、抗炎治療、血管血栓及宿主防御等過程，表現(xiàn)出重要的應用價值；另 夕卜，非特異性核酸酶在工業(yè)上主要用于生物制品中外源核酸的去除，減少過敏反應，提高安 全性。與此同時，非特異性核酸酶還能應用于研制新型的環(huán)保生物消毒劑，其能作用于細菌 和病毒的遺傳物質(zhì)，裂解DNA或RNA，從而達到殺滅細菌和病毒的目的，與化學消毒劑相比， 在理論上對機體無任何毒副作用，不污染環(huán)境，是一種理想的潛在的綠色環(huán)保抗病毒制劑。
[0003] 目前，國內(nèi)外使用的非特異性核酸酶主要來源于Merck公司的Benzonase endonuclease，Benzonase核酸酶是來自Serratia marcescens，經(jīng)基因工程改進的核酸 內(nèi)切酶，在廣泛條件范圍下都能保持很高的活性：在PH6-10及0-42°C保持較高的活性；在 l.OmM PMSF、1.0mM EDTA及尿素中保持活性。但該重組蛋白具有信號肽，部分以包涵體形式 存在，復性困難，導致其價格昂貴，使其大規(guī)模應用受到限制。為此非常有必要開展非特異 性核酸酶的相關研究工作。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種Yep非特異性核酸酶、編碼基因、載體、工程菌及應用，替 代現(xiàn)有非特異性核酸酶，降低成本，擴大了使用范圍。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種來源于小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica subsp. Palearctica)(簡稱為Y. e. p或Yep)的Y. e. p非特異性核酸酶（或者Yep非特異性 核酸酶），所述酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO :2所示氨基酸序列的多肽的片段或 其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該多肽的片段或多肽變體與前述氨 基酸序列同源性在95%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的，所述改變可包括氨基酸 序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與 原氨基酸相似的結構或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變， 如用色氨酸替換甘氨酸。
[0008] 本發(fā)明涉及一種編碼所述核酸酶的基因，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO :1所示多核苷酸的變體，只要其與該多核 苷酸具有90%以上同源性，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。所述多核苷酸的變體是指一種具 有一個或多個核苷酸改變的多核苷酸序列。此多核苷酸的變體可以使生的等位變異體或非 生的變異體，包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是 一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上 改變其編碼的氨基酸的功能。
[0010] 本發(fā)明還涉及一種含所述編碼基因的重組表達載體，所述重組表達載體為在質(zhì)粒 PET24a(+)的Nde I和Xho I酶切位點插入SEQ ID N0:1所示核苷酸序列得到的重組表達 載體 PET24a_nuc。
[0011] 本發(fā)明還提供一種由所述重組表達載體轉化得到的重組基因工程菌，所述重組基 因工程菌命名為Escherichia coli BL21starTM(DE3)plysS-SL312,保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏日期2014年5月12日，保藏編號為CCTCC Μ 2014198,保藏地址為中國武 漢武漢大學。
[0012] 本發(fā)明所述Y. e. ρ非特異性核酸酶編碼基因在制備Y. e. ρ非特異性核酸酶中的應 用，所述的應用為：構建含有所述Y. e. p非特異性核酸酶基因的重組載體，將所述重組載體 轉化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導培養(yǎng)（通常以IPTG為誘導劑），培養(yǎng)液 分離得到含有Y. e. ρ非特異性核酸酶的菌體細胞。
[0013] 本發(fā)明涉及一種所述Y. e. ρ非特異性核酸酶在降解核酸中的應用，所述核酸為超 螺旋DNA、線狀雙鏈DNA、線狀單鏈DNA、環(huán)狀單鏈DNA、或單鏈RNA的一種（見圖1，圖2)。
[0014] 本發(fā)明所述Y. e. ρ非特異性核酸酶核苷酸序列的獲取及高產(chǎn)菌株的構建，具體包 括以下步驟：
[0015] (1)以Y. e. ρ基因組為模板，利用已知小腸腸炎耶爾森菌（Yersinia, enterocolitica subsp. Enterocolitica)(簡稱Υ· e. e)非特異性核酸酶基因的保守序列 設計簡并引物，通過PCR技術擴增出包含Y. e. ρ非特異性核酸酶的基因片段，進行測序，得 到Y. e. ρ非特異性核酸酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO: 1所示，其對應的氨基酸序列如SEQ ID N0:2 所示。
[0016] (2)將Y.e.p非特異性核酸酶基因用Nde I和Xho I進行雙酶切，并與同樣雙酶切 的PET24a (+)連接，轉化至大腸桿菌BL21starTM (DE3) plysS表達載體，構建基因工程菌，在 培養(yǎng)基中加入IPTG誘導表達重組蛋白，即為本發(fā)明所述的含Y. e. ρ非特異性核酸酶的菌 體細胞。
[0017] 本發(fā)明所述Y. e. ρ非特異性核酸酶的酶學性質(zhì)研究主要包括：用Ni-NTA resin親 和層析分離純化Y. e. ρ非特異性核酸酶，以小牛胸腺DNA為底物，研究Y. e. ρ非特異性核酸 酶的最適溫度、最適pH和不同離子溫度、pH、EDTA和SDS對其活性的影響。研究結果表明： Y. e. ρ非特異性核酸酶的最適溫度為35-40°C;最適pH為7. 0 ;對其酶活影響最大的離子為 鎂離子，其次為鋇離子，鈣離子、鈉離子、銅離子，低濃度的鐵離子、鉀離子對其活性也有一 定的影響；該酶耐熱性較好，80°C處理5h后仍有25%左右的殘余酶活；酶的酸堿穩(wěn)定性較 好，在酸性條件下，酶活基本不變，在PH9. 8的條件下處理5h后仍有83. 3%的殘余酶活；低 濃度的EDTA和SDS對該酶的穩(wěn)定性影響較小。
[0018] 本發(fā)明提供了來源于 Yersinia enterocolitica subsp. Palearctica(簡稱為 Y. e. p)的非特異性核酸酶基因，并構建了 Y. e. p非特異性核酸酶的高產(chǎn)菌株。Y. e. p非特 異性核酸酶不僅具有非特異性，而且具有廣泛的適用性，可以耐酸堿、耐冷熱、耐化學物質(zhì)， 是一種理想的新型工業(yè)化核酸酶。
[0019] 本發(fā)明所述的Y.e.p非特異性核酸酶能降解各類PCR擴增產(chǎn)物，單鏈、雙鏈、線狀、 環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA (參見實施例2- (2)底物特異性），且具有廣泛的適用性：耐 酸堿（pH3. 8-9. 8均有較高的酶活，在pH3. 8的緩沖液中保溫5h后，酶活殘留96 %，在pH9. 8 的緩沖溶液中保溫5h后，酶活殘留83% )、耐冷熱（0-KKTC均具有酶活，100°C保溫5h仍有 15%以上的殘留酶活）、耐化學物質(zhì)（120mMEDTA中放置5h殘余酶活達87%，6M尿素中有 酶活，100mM鹽酸胍中保留5h酶活力殘留95% )，為該核酸酶的工業(yè)化應用打下基礎。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為Y. e. p非特異性核酸酶對含有不同金屬離子的各種底物的凝膠電泳圖，圖 中a-表示底物為雙鏈線性DNA，b-表示底物為單鏈的線性DNA，c-表示底物為環(huán)狀雙鏈 DNA，d-表示底物為RNA ;字母a、b、c、d后的數(shù)字1-5分別表示：1表示金屬離子為20mM MgCl2,2表不金屬離子為20mM MnS04,3表不金屬離子為20mM CoC12,4表不沒有金屬離子， 5表示添加了 2 μ 1蒸餾水代替酶液。
[0021] 圖2為在Mg2+促進下Y. e. ρ非特異性核酸酶對各種底物的作用結果圖，a-表示雙 鏈線性DNA, b-表示單鏈線性DNA, c-表示單鏈環(huán)狀DNA，其中1表示加入酶液，2表示加入 蒸餾水代替酶液。
[0022] 圖3為Y. e. ρ非特異性核酸酶酶液的SDS-PAGE凝膠電泳分析圖（0 :Marker，1 :對 照/空載體，2 :未破碎之前的濕菌體，3 :破碎后的沉淀，4 :破碎后的上清，5 :鎳柱吸附lh后 吸附液，6 :洗脫液C的流出液，7 :洗脫液D的流出液，8 :洗脫液E的流出液）。
[0023] 圖4為Y. e. ρ非特異性核酸酶在不同溫度下的電泳圖。
[0024] 圖5為Y. e. ρ非特異性核酸酶在不同pH條件下的活性曲線圖。
[0025] 圖6為Y. e. ρ非特異性核酸酶溫度耐受性曲線圖，A為37、50、65、80°〇下隨時間的 變化曲線，B為KKTC隨時間的活力變化曲線（灰色、黑色和白色柱體分別表述3次平行）。
[0026] 圖7為Y. e. ρ非特異性核酸酶酸堿穩(wěn)定性曲線圖。
[0027] 圖8為EDTA對Y. e. ρ非特異性核酸酶穩(wěn)定性影響的曲線圖。
[0028] 圖9為SDS對Y. e. ρ非特異性核酸酶穩(wěn)定性影響的凝膠電泳圖，其中1:2. OmM， 2:4. OmM，3:6. OmM，4:8. OmM，5:10mM，6:20mM，7:50mM，8:100mM，9:250mM，10:350mM， ll:500mM，對照a :加入未經(jīng)SDS處理的核酸酶，對照b :不加核酸酶。 (五）

【具體實施方式】
[0029] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0030] 實施例1Y. e. ρ非特異性核酸酶核苷酸序列的獲取及高產(chǎn)菌株的構建
[0031] 1、Y. e. ρ非特異性核酸酶核苷酸序列的獲取
[0032] 利用已知Y. e. e非特異性核酸酶基因（基因登錄號為YP_001007112)的側翼序 列，做同源分析，蛋白質(zhì)序列比對，找到保守序列，設計簡并引物，YE2923nucl(5' -GCTACAC AATCGATGTAAGCG-3'）和 YE2923nuc2(5' -CGGTTTTCGTTGTTCCATTG ACT-3'），以 Υ· e. p 全基 因組為模板，進行PCR擴增（擴增體系及條件同2. (1)中Y.e.p非特異性核酸酶基因的擴 增），獲得包含Y. e. p非特異性核酸酶的基因片段，通過與已知Y. e. e非特異性核酸酶的序 列比對，找出起始密碼子和終止密碼子，確定Y. e. P非特異性核酸酶的核苷酸序列，結果如 SEQ ID NO: 1所示，其對應的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0033] 2、Y. e. p非特異性核酸酶高產(chǎn)菌株的構建
[0034] (1)Y. e. P非特異性核酸酶基因的擴增
[0035] 根據(jù)Y. e. p非特異性核酸酶基因及載體pET24a(+)的序列特征設計引物，上游引 物 NucF 含 Ndel 位點和 6 個組氨酸標簽序列（5'-TTAATTATTCATATGTCCGCGCCCAAAACC-3，）， 不擴增原始信號肽（1-23個氨基酸切除，總長為783bp)，下游引物NucR含Xhol位點（5'-A ATATACTCGAGATCGCATCCAATTGT-3'），Y. e. p 非特異性核酸酶基因 （SEQ ID NO: 1 所示）為模 板，進行PCR擴增。20 μ 1 PCR反應體系為：DNA模板1. 0 μ L，上游引物NucF (10 μ Μ) 1. 0 μ L， 下游引物恥。1?(1(^]\〇1.(^1^，2\丁&9?0?5七&-1叉1(^1^，（1(1!1 207.(^匕？0?循環(huán)程序： 94°C預變性 2· Omin ;94°C變性 30sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，共 35 個循環(huán)；72°C 延伸 5. Omin。
[0036] (2) Υ· e. p非特異性核酸酶基因的克隆
[0037] 米用 GenStar 的 StarPrep Gel Extraction Kit 回收步驟（1) PCR 擴增產(chǎn)物， 經(jīng)Ndel和Xhol雙酶切，回收目的基因片段，與同樣雙酶切、去磷酸化、回收的表達載體 pET24a (購自Novagen)經(jīng)T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a (購自 Novagen)，將轉化菌株接種在含終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過 夜，隨機挑取單菌落，37°C振搖培養(yǎng) 12h，用 GenStar 的 StarPrep Plasmid Miniprep Kit 提取質(zhì)粒，送上海桑尼測序鑒定，表明SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列已經(jīng)重組至表達載體 pET24a中，獲得含Y. e. p非特異性核酸酶基因的大腸桿菌DH5a。連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸 桿菌DH5a的方法為：向100 μ lDH5a感受態(tài)細胞中加入10 μ 1連接液，于無菌的離心管中混 勻，冰上放置30min。開始轉化實驗，42°C水浴60s后冰浴2min，每管加入800 μ 1 LB培養(yǎng) 基，37°C搖床培養(yǎng)lh。最后稍加離心，去上清，取100 μ 1轉化液涂布至含終濃度50 μ g/ml 卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-16h出現(xiàn)單菌落。
[0038] (3) Y. e. p非特異性核酸酶表達載體的構建
[0039] 將上述鑒定正確的質(zhì)粒轉化到表達載體大腸桿菌BL21Star?(DE3)PlySs (購自 Novagen)中，挑取20個單菌落，轉接于含有終濃度50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上， 37 °C培養(yǎng)24h，挑取菌落再轉接于LB液體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)5h，獲得培養(yǎng)液，取培養(yǎng)液過濾， 收集濕菌體用GenStar的StarPrep Plasmid Miniprep Kit提取質(zhì)粒，測序。LB液體培養(yǎng) 基質(zhì)量濃度組成：酵母粉〇. 5%，胰蛋白胨1 %，氯化鈉1 %，溶劑為水，自然pH ;LB瓊脂平板 是在LB液體培養(yǎng)基加質(zhì)量終濃度2 %瓊脂粉配制而成，自然pH。
[0040] ⑷Y. e. p非特異性核酸酶的誘導表達
[0041] 將步驟（3)序列鑒定正確（即含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列）的菌體接種至LB 液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至0D6(KI約為0. 8-1. 0時，加入終濃度1. OmM的IPTG，37°C繼續(xù)振 蕩培養(yǎng)22h，離心（4°C，8000rpm，5min)，收集沉淀，獲得含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列編 碼Y. e. p非特異性核酸酶的菌體細胞。
[0042] (5) Y. e. p非特異性核酸酶的分離純化
[0043] 用變性劑（終濃度100mM NaH2P04,終濃度8M尿素，溶劑10mMTris-HCl (ρΗ8· 0))溶 解步驟（4)制備的沉淀（即濕菌體），振蕩溶解至溶液澄清后，lOOOOrpm離心25min，獲得上 清液和沉淀，分離出上清液進行Ni-NTA resin親和層析（lcmNi柱，購自QIAGEN)，分別用 洗脫液C (即終濃度100mM NaH2P04，終濃度8M尿素，溶劑10mM Tris-HCl (pH6. 3)，洗脫液體 積8ml)、洗脫液D (即終濃度lOOmM NaH2P04，終濃度8M尿素，溶劑10mM Tris-HCl (pH5. 9)， 洗脫液體積2ml)、洗脫液E (即終濃度100mM NaH2P04，終濃度8M尿素，溶劑10mM Tris-HCl (pH4. 5)，洗脫液體積2ml)各洗滌4次后（見圖3)，收集洗脫液E的流出液，并用 20mM Tris-HCl (pH7. 0,含終濃度20mM MgCl2)溶液稀釋10倍，超濾3h (再生醋酸纖維素 膜，孔徑lOKDa，壓力0. 02MPa)，收集濾液，獲得純酶液，即Y. e. p非特異性核酸酶酶液，保存 于-20°C，用于酶學性質(zhì)研究。
[0044] 取樣進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，經(jīng)鎳柱吸附lh后流出的流出液（圖3中 泳道5所示）、洗脫液C洗脫后收集的流出液（圖3中泳道6所示）、洗脫液D洗脫后收集 的流出液（圖3中泳道7所示）、洗脫液E洗脫后收集的流出液（見圖3中泳道8)。
[0045] 對照：同時以不含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的空載體轉化到表達載體大腸桿 菌BL21Star?(DE3)PlySs獲得的轉化體同樣條件下培養(yǎng)獲得的濕菌體作為對照（圖3中 泳道1所示），步驟（4)制備的未破碎濕菌體（見圖3中泳道2)，用pH8. 0的變性劑溶解步 驟（4)制備的濕菌體后的沉淀（見圖3中泳道3)，用pH8. 0的變性劑溶解步驟（4)制備的 濕菌體后的上清液（見圖3中泳道4)。
[0046] 結果表明：Ni-NTA resin親和層析柱分離效果很好，洗脫液E洗脫后得到純度達 到90%以上的蛋白。
[0047] 實施例2Y. e. p非特異性核酸酶的酶學性質(zhì)研究
[0048] (1) Y. e. p非特異性核酸酶的底物特異性
[0049] 底物溶液終濃度組成為：100ng/ μ L的底物，20mM金屬鹽，溶劑為20mM Tris-HCl (pH7. 0)，底物為不同形式的DNA[(環(huán)狀雙鏈DNA (質(zhì)粒，plasmid)、環(huán)狀單鏈 DNA( λ -DNA)、線狀雙鏈dsDNA和線狀單鏈ssDNA]及RNA，金屬鹽為分別為MgCl2、MnS04、 CoCl2。
[0050] 在38 μ L底物溶液中加入2. 0 μ L核酸酶稀釋液（實施例1制備的Y. e. p非特異 性核酸酶酶液用含終濃度20mM金屬鹽的20mM Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液稀釋500倍）構成 反應體系40 μ L，將此體系置于40°C條件下反應5min，加入8. 0 μ L6 X Loading buffer (購 自上海生工）終止反應，以加2. OyL蒸餾水替代核酸酶酶液作為對照。反應結束后，分別 取反應液，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳測定酶活。
[0051] 結果如圖1，圖中a-表示底物為雙鏈線性DNA，b-表示底物為單鏈的線性DNA， c-表示底物為環(huán)狀雙鏈DNA，d-表示底物為RNA ;字母a、b、c、d后的數(shù)字1-5分別表示：1 表不金屬尚子為20mM MgCl2,2表不金屬尚子為20mM MnS04,3表不金屬尚子為20mM CoC12,4 表示沒有金屬離子，5表示添加了 2 μ 1蒸餾水代替酶液；例如al表示底物為雙鏈線性DNA， 金屬離子為20mM MgCl2，其中a2表示底物為雙鏈線性DNA，金屬離子為20mM MnS04，其中a3 表示底物為雙鏈線性DNA，金屬離子為20mM C〇Cl2，其中a4表示底物為雙鏈線性DNA，沒有 金屬離子，其中a5表示底物為雙鏈線性DNA，但添加了 2μ 1蒸餾水代替酶液。
[0052] 圖2 (a-表示雙鏈線性DNA，b-表示單鏈線性DNA，c-表示單鏈環(huán)狀DNA，其中1表 示加入酶液，2-表示加入蒸餾水代替酶液）所示。表明Y. e. p非特異性核酸酶的作用底物 非常廣泛，能降解各種形式的DNA及RNA，金屬鹽MgCl2、MnS0 4、C〇Cl2的存在能提高酶活，沒 有金屬鹽的存在，Y. e. p非特異性核酸酶扔具有酶活。
[0053] ⑵Y. e. p非特異性核酸酶的最適溫度
[0054] 底物溶液終濃度組成為：100ng/ μ L小牛胸腺DNA (購自Sigma)，20mM MgCl2，溶劑 為 20mM Tris-HCl(pH7. 0)。
[0055] 在38 μ L底物溶液中加入2· 0 μ L核酸酶稀釋液（實施例1制備的Y. e. p非特異 性核酸酶酶液用含終濃度20mM MgCl2的20mM Tris-HCl (pH7. 0)稀釋500倍）構成反應體 系40μ L，將此體系分別置于溫度為0、4、22、30、35、40、45、50、60、70、80、90、1001：條件下 反應5min，分別加入8. 0 μ L6 X Loading buffer (購自上海生工）終止反應，以加2. 0 μ L蒸 餾水替代核酸酶酶液作為對照。反應結束后，分別取反應液，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳測 定酶活。結果如圖4所示。Y.e.p非特異性核酸酶的最適溫度為35-40°C，低溫對酶活影響 不大，55°C后隨著溫度升高酶活逐漸降低，溫度越高，酶活損失越大。該核酸酶的作用范圍 為 0-100。。。
[0056] ⑶Y. e. p非特異性核酸酶的最適pH
[0057] 配制不同 pH 的 1. 0M Tris-HCl 緩沖液，pH 梯度為：3· 8、4· 8、5· 8、6· 4、6· 8、7· 0、 7· 2、7· 4、7· 6、7· 8、8· 8、9· 8 共 12 個梯度。再用不同 pH 的 Tris-HCl 與小牛胸腺 DNA，MgCl2 配制成不同pH的底物溶液（底物溶液的終濃度組成：100ng/l·! L小牛胸腺DNA，20mM MgCl2， 溶劑為20mMTris-HCl (不同pH))，并將實施例1制備的Y. e. p非特異性核酸酶酶液用含終 濃度20mM MgClJ^]20mM Tris-HCl(pH7.0)稀釋500倍。分別取2yL核酸酶稀釋液與38yL 底物溶液構成40 μ L反應體系，反應體系在40°C反應5min，分別加入8. 0 μ L6XLoading buffer終止反應。以加 2. 0 μ L的蒸餾水代替Y. e. p非特異性核酸酶酶液為對照。反應結 束后，取反應液采用1.0%凝膠電泳測定酶活。結果如圖5所示。該酶的最適pH為7.0,過 酸或過堿條件下酶活均有酶活，PH3. 8-9. 8對其酶活影響不大，殘余酶活均在50%以上。該 酶能在PH3. 8-9. 8范圍內(nèi)作用。
[0058] (4) Y. e. p非特異性核酸酶的離子依附性
[0059] 底物溶液終濃度組成：100ng/y L小牛胸腺DNA，0. 010?100mMMgCl2，溶劑為20mM Tris-HCl (ρΗ7· 0)，MgCl2 的終濃度分別為 0· 010、0· 10、1. 0、3· 0、10、20、30、50、100mM。
[0060] 分別用 ZnCl2、BaCl2、CaCl2、NaCl、CuS04、ZnS0 4、MnS04、NiS04、CoCl2、KC1、FeCl 2 替 代MgCl2制備不同的底物溶液。
[0061] 將實施例1制備的Y.e.p非特異性核酸酶用含終濃度20mM MgCl2的20禮 Tris-HCl (pH7. 0)稀釋500倍，取2 μ L核酸酶稀釋液與38 μ L上述不同底物溶液構成 40 μ L反應體系，在40 °C反應5min，向反應液中加入8. 0 μ L6XLoading buffer終止反 應。以不加金屬離子的底物溶液（即終濃度組成dOOng/yL小牛胸腺DNA，溶劑為20mM Tris-HCl (pH7.0))為對照。反應結束后，取反應液采用1.0%凝膠電泳測定酶活。結果如 表1所示。MgCl2對核酸酶酶活有明顯的激活作用，最佳濃度為10-50mM，BaCl 210-20mM， CaCl2 ^ lOmM, NaCl < lOmM, CuS04 ^ 3mM, MnS040. ImM, NiS04 ^ 0. ImM, CoCl2 ^ 0. ImM, KC1彡lmM，F(xiàn)eCl30. OlmM對酶活均有激活作用，但KC1濃度大于ImM時，NaCl濃度大于20mM 時就能完全抑制核酸酶的酶活。
[0062] 表1Y. e. p非特異性核酸酶的離子依耐性
[0063]

【權利要求】
1. 一種Yep非特異性核酸酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2. -種編碼權利要求1所述核酸酶的基因。
3. 如權利要求2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
4. 一種含權利要求2所述編碼基因的重組表達載體。
5. 如權利要求4所述重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為在質(zhì)粒 PET24a(+)的Nde I和Xho I酶切位點插入SEQ ID N0:1所示核苷酸序列得到的重組表達 載體 PET24a_nuc。
6. -種由權利要求4所述重組表達載體轉化得到的重組基因工程菌，所述重組基 因工程菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2014年5月12日，保藏編號為 CCTCCM2014198,保藏地址為中國武漢武漢大學。
7. -種權利要求1所述Yep非特異性核酸酶在降解核酸中的應用。
8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于所述核酸為超螺旋DNA、線狀雙鏈DNA、線狀單 鏈DNA、環(huán)狀單鏈DNA或單鏈RNA的一種。
【文檔編號】C12N15/55GK104195122SQ201410226606
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權日:2014年5月26日
【發(fā)明者】石陸娥, 唐振興, 李珍華, 方秀娟 申請人:杭州師范大學