一種miRNA在治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種miRNA在治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病中的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA是miRNA-133a。這一功能的發(fā)現(xiàn)對于高脂血癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病的診斷和治療都有著極其重要的意義。
【專利說明】一種miRNA在治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域,具體涉及一種miRNA、miRNA的前體RNA、miRNA反義寡核苷酸序列及其表達載體，以及在診斷和治療心血管疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]心血管疾病是危害人類健康的嚴重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我國居民的死亡譜中，心血管疾病已經(jīng)成為僅次于惡性腫瘤的第二號殺手，并且每年另有數(shù)以萬計的人因患該病導(dǎo)致殘疾。該病種類繁多、病因復(fù)雜。人們在日常生活中，由于多種原因造成過多的脂肪在血管內(nèi)壁沉積，導(dǎo)致血管壁增厚，影響血液流動。更為危險的是，血液中過多的脂質(zhì)會逐步侵蝕血管壁，造成動脈硬化。隨著動脈硬化病情的加深，血管壁會進一步硬化,血管壁上的脂質(zhì)沉積也會逐漸 增加；同時，由于此時體內(nèi)含有過多脂質(zhì)的血液比較粘稠，因此會造成血管的阻塞，使血液不能正常通過而形成血栓。血栓如出現(xiàn)在大腦中、或腦動脈硬化破裂，可造成大腦局部缺血壞死，即中風(fēng)；視壞死腦區(qū)不同，輕則口眼歪斜、半身不遂，重者死亡。血栓如發(fā)生在心臟里，則造成心臟局部缺血壞死，發(fā)生心肌梗塞，預(yù)后不良。心血管疾病發(fā)展到后期，由于心臟長期泵血不良，全身器官都可能淤血缺氧而遭到不同程度的損害。肺部淤血造成易發(fā)肺部感染，肝臟長期淤血缺氧可出現(xiàn)肝硬化，高血壓造成腎衰等多種并發(fā)癥，這些癥狀又反過來加重心血管疾病病情。如心血管疾病合并高血壓、糖尿病等疾病，將對身體產(chǎn)生更為嚴重的危害。
[0003]心血管疾病發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多，嚴重威脅人類的生命和健康。因此，世界各國對心腦血管疾病的研究、預(yù)防及治療均十分重視。
[0004]微小RNAOniRNA或microRNA)是一種長度為18~25個核苷酸單鏈的內(nèi)源性非編碼性小RNA，是由前體在酶的加工下生成，前體的序列一般為70~120個核苷酸。通過與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)芐基因表達，參與多種生物學(xué)過程，進化過程保守。最初發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性miRNA是lin24和let27，它們參與基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，通過與靶mRNA的3'端非編碼區(qū)或編碼區(qū)相結(jié)合而發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。近年來已經(jīng)鑒定出超過400種miRNA,但仍有很多種尚未被發(fā)現(xiàn)[Berezikov E, Thuemmler F, van LaakeLff, et al.Diversity of microRNAs in human and chimpanzee brain [J].Nat Genet, 2006,38 (12):1375-1377.]。對miRNA空間表達的系統(tǒng)性分析表明，很多miRNAs以組織特異性方式表達[ffienholds E, KloostermanffP, Miska E, et al.MicroRNA express1n in zebrafishembryonic development [J].Science, 2005, 309 (5732):310-311.]。每一種 miRNA 可以定位于很多種mRNA，使其轉(zhuǎn)錄抑制或降解，因此很多種轉(zhuǎn)錄子可能受到miRNA的精細調(diào)節(jié)，使轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)有效運轉(zhuǎn)，進而細胞得以快速而有效地控制閾值依賴性的細胞事件。目前普遍認為miRNA的功能是參與生命的一些基本過程如生長發(fā)育、器官形成、造血、細胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤生成等。
[0005]最初科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)miRNA與細胞的癌變有著極為密切的關(guān)系，對腫瘤抑制基因起作用的miRNA下降或者缺失會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已發(fā)現(xiàn)的的miRNA與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、慢性淋巴細胞白血病等多種癌癥密切相關(guān)。2006年末，科學(xué)家開始注意到miRNA在心臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中所起的重要作用[Van Rooij E, Sutherland LB, L iu N, et al.A signaturepattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heartfailure [J].PNAS，2006，103:18255-18260.]，并在心律失常、心力衰竭等疾病的研究中取得了一系列重要進展，使miRNA成為國際心血管研究領(lǐng)域的熱點。
[0006]心血管疾病相關(guān)miRNA的發(fā)現(xiàn)可能對該疾病的相關(guān)基因治療產(chǎn)生重大的影響。通過對心血管疾病患者和正常人群的miRNA差異表達分析，可以鑒定得到相關(guān)的敏感miRNA，進而通過引入特異性的miRNA互補的反義核苷酸抑制或者通過病毒載體或質(zhì)粒載體過表達的方法，調(diào)控相關(guān)miRNA或其前體的表達量，從而達到治療心血管疾病的目的。因此，發(fā)現(xiàn)特異性表達的miRNA對于心血管疾病的診斷和治療具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA對于治療和診斷高脂血癥及動脈硬化疾病新用途。本發(fā)明人經(jīng)潛心研究，發(fā)現(xiàn)如下SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4能夠用于治療和診斷高脂血癥及動脈硬化疾病，尤其是作為醫(yī)藥組合物，對于治療和診斷高脂血癥及動脈硬化疾病取得了意想不到的技術(shù)效果，從而完成了本發(fā)明。
[0008]具體的說，本發(fā)明所提供的人源miRNA-133a(has-miRNA-133a)和鼠源miRNA-133a (mmu-miR-133a)均包含如下序列:
[0009]5，-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG-3’ (SEQ ID5)。 [0010]本發(fā)明所提供的人源miRNA_133a的前體RNA有2種，包含如下序列:
[0011]hsa-mir-133a-l (M10000450)
[0012]5，-ACAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGC腳AGCUAUGCAUUGA-3，
[0013]SEQIDl
[0014]hsa-mir-133a-2 (M10000451)
[0015]5，-GGGAGCCAAAUGCUUUGCUAGAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGACUGUCCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGUGCAUUGAUGGCGCCG-3’ SEQ ID2
[0016]本發(fā)明所提供的鼠源miRNA-133a的前體RNA有2種，包含如下序列:
[0017]mmu-mir-133a-l (M10000159)
[0018]5，-GCUAAAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCGCCUCUUCAAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGC-3，
[0019]mmu-mir-133a-2 (M10000820) SEQ ID3
[0020]5，-AGAAGCCAAAUGCUUUGCUGAAGCUGGUAAAAUGGAACCAAAUCAGCUGUUGGAUGGAUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGUAGCUGCGCAUUGAUCACGCCGCA-3’ SEQ ID4
[0021]本發(fā)明所提供的人源miRNA-133a(has-miRNA_133a)和鼠源miRNA-133a(mmu-miR-133a)的反義寡核苷酸均包含如下序列:
[0022]5，-CAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3，(SEQ ID6)。
[0023]本發(fā)明所提供的人源miRNA-133a的前體hsa-mir-133a_l在人染色體上定位于18qll.2，前體 hsa-mir-133a_2 定位于人染色體 20ql3.33。
[0024]本發(fā)明以人外周血單核細胞、C57/BL6J野生型小鼠(WT小鼠)，高脂血癥模型ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)心臟、大動脈血管為材料進行miRNA分子的克隆分析。采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，從細胞和組織中提取總RNA，經(jīng)過特異性的引物進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測結(jié)果表明，miRNA_133a在高脂狀態(tài)下其表達量明顯降低；運用特異性互補的反義核苷酸抑制miRNA-133a及其前體的表達，由大動脈血管分離所得的血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和分化受到明顯的抑制。而運用合成的miRNA-133a前體RNA增加細胞內(nèi)miRNA-133a的表達，可以明顯的促進VSMC的增殖和分化。
[0025]高脂血癥、動脈粥樣硬化的病人由于血管中的血脂含量極高，而受損的血管壁細胞正常的增殖和分化受到抑制，不能及時地修補受損的血管從而造成脂質(zhì)積聚和動脈硬化加速發(fā)展，最終導(dǎo)致中風(fēng)、心肌梗死等嚴重后果。高脂血癥、動脈粥樣硬化病人外周血單核細胞內(nèi)的miRNA-133a的表達量特異性的降低，利用這一特征性的表現(xiàn)可以將其作為診斷高脂血癥和動脈硬化的指征；由于miRNA-133a對于血管細胞的增殖和分化有明顯的調(diào)節(jié)作用，因此能夠運用病毒載體或質(zhì)粒載體過表達的方法，將病人血管細胞中的miRNA-133a表達量增加，使其能夠正常的增殖和分化，及時修補受損的血管壁進而有效的控制高脂血癥和動脈硬化病情的發(fā)展。miRNA-133a這一功能的發(fā)現(xiàn)對于高脂血癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病的診斷和治療都有著極其重要的意義。
[0026]因此本發(fā)明提供一種miRNA在治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病中的應(yīng)用，其特征在于,所述miRNA是miRNA-133a。所述miRNA的序列為SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3或SEQ ID4。
[0027]并且，將SEQ IDU SEQ ID2、SEQ ID3和SEQ ID4分別應(yīng)用于受試體時，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將人源序列SEQ IDU SEQ ID2與鼠源序列SEQ ID3、SEQ ID4混合后再使用，與單獨使用所述4段序列相比，其對血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和分化的促進效果更為顯著。雖然，目前對于不同來源的miRNA-133a序列的混合作用為什么效果更顯著的機理還不是十分清楚，但是本發(fā)明人認為不同來源的序列，對于作用的靶標的特異性位點有協(xié)同效果，或者起到相互競爭的關(guān)系，導(dǎo)致與靶基因序列特異性相互作用起到正相關(guān)效果，從而在轉(zhuǎn)錄水平更加調(diào)芐基因表達，其結(jié)果更加有效和快速地修復(fù)了受損的血管壁，進而更加有效地控制了高脂血癥和動脈硬化的發(fā)展。使得miRNA在治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病中取得更加顯著的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1.高脂血癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病人外周血單核細胞內(nèi)miRNA_133a的表達量明顯降低。*:p〈0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義
[0029]圖2.高脂血癥和動脈硬化疾病模型ApoE-/-小鼠血管中miR_133a的表達量明顯降低。*:p<0.05,與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義
[0030]圖3.WT小鼠和ApoE-/-小鼠動脈血管平滑肌細胞(VSMC)的分離和免疫熒光鑒定
[0031](DAPI為細胞核熒光染料，TRITC為VSMC特異性抗體所帶熒光)
[0032]上:為陰性對照；非VSMC細胞不能觀測到熒光，只有細胞核被染色，前兩張圖片疊加后只能觀測到細胞核熒光。[0033]中:為WT小鼠VSMC的免疫熒光照片；VSMC既可以觀測到細胞核熒光，也可以觀測到抗體所帶的紅色熒光。第三張圖片為前兩張圖片的疊加。
[0034]下:為ApoE-/-小鼠VSMC的免疫熒光照片；VSMC既可以觀測到細胞核熒光，也可以觀測到抗體所帶的紅色熒光。第三張圖片為前兩張圖片的疊加。
[0035]圖4.高脂狀態(tài)(oxLDL50ug/ml)培養(yǎng) WT 和 ApoE-/-小鼠 VSMC 細胞內(nèi) miR_133a的表達量。*:p〈0.05,與相應(yīng)的對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0036]圖5.運用miRNA_133a的反義寡核苷酸序列ant1-miR_133a,可以降低細胞內(nèi)miRNA-133a的表達。*:p<0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0037]圖6.降低細胞內(nèi)miRNA_133a的表達水平將抑制VSMC細胞的增殖和分化(普通光學(xué)顯微鏡觀察細胞數(shù)量和形態(tài))
[0038]圖7.降低細胞內(nèi)miRNA_133a的表達水平將抑制VSMC細胞的增殖和分化(熒光顯微鏡觀察細胞數(shù)量和形態(tài))
[0039]圖8.運用 miRNA-133a 的前體 RNA pre_miR-133a，可以增加細胞內(nèi) miRNA_133a 的表達。*:p<0.05，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0040]圖9.增加細胞內(nèi)miRNA_133a的表達水平將促進VSMC細胞的增殖和分化(熒光顯微鏡觀察細胞數(shù)量和形態(tài)) [0041]圖10.不同方式培養(yǎng)的野生型WT小鼠VSMC細胞生長曲線
[0042]圖11.不同方式培養(yǎng)的ApoE-/-基因敲除小鼠VSMC細胞生長曲線
【具體實施方式】
[0043]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步闡述。
[0044]本發(fā)明所公開的RNA序列均能夠以人工合成的方法或其它生物學(xué)方法獲得。
[0045]實施例1
[0046]健康人與高脂血癥動脈硬化病人外周血單核細胞內(nèi)miRNA_133a表達量比較。
[0047](I)人外周血單核細胞分離
[0048]采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單核細胞，具體操作方式如下:
[0049]I)在離心管中加入適量Ficoll分離液。
[0050]2)取肝素抗凝靜脈血與2倍體積的磷酸緩沖液(PBS)充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心SOOgX30分鐘。
[0051]3)離心后管內(nèi)分為三層，上層為血漿和PBS，下層主要為紅細胞和粒細胞。在上、下層界面處有一以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外,還含有血小板。
[0052]4)用吸管插到云霧層，吸取單個核細胞。置入另一離心管中，加入5倍以上體積的PBS，室溫離心800gX5分鐘，洗滌細胞兩次。
[0053]5)重懸細胞后加入紅細胞裂解液，室溫放置3分鐘后離心800gX 5分鐘。
[0054]6)離心后棄上清，加入不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞。室溫離心800gX5分鐘，不含血清RPMI1640洗滌細胞兩次。最后加入含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液
重懸細胞。
[0055]7)取一滴細胞懸液與一滴0.2%臺盼蘭染液混合，于血球計數(shù)板上，計數(shù)細胞總數(shù)并檢測細胞活力。用本法分離PBMC，純度在90 %以上，收獲率可達80~90 %，活細胞百分率在95%以上
[0056](2)細胞總 RNA 提取(TRIzol 法)
[0057]I)收獲細胞1-5X107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。
[0058]2)加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。
[0059]3) 4°C 離心，12000gX 15min,取上清。
[0060]4)加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置1min。
[0061]5) 4°C離心，12000gX 1min,棄上清。
[0062]6)加入lml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4°C，7500gX 5min，棄上清。
[0063]7)晾干，加入適量的DEPC H20溶解(65°C促溶10_15min)。測定0D260和0D280
值，初步斷定RNA質(zhì)量。
[0064]8)總RNA提取采用無RNA酶的D NA酶I處理，QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，詳細操作原理和方法見試劑盒說明書。
[0065](3) qRT-PCR檢測細胞內(nèi)miRNA_133a的表達量。
[0066]以人單核細胞總RNA作為模板，用miR_133a特異性的mirVana qRT-PCR弓丨物(AM30032, Amb1n)擴增miR_133a基因。使用實時TaqMan miRNA分析檢測試劑盒(ABI)進行定量PCR檢測細胞內(nèi)miRNA-133a的表達量，詳細操作原理和方法見試劑盒說明書。
[0067]實施例2
[0068]WT小鼠和ApoE-/-小鼠不同組織miRNA_133a表達量的差異。
[0069]1.常規(guī)方法分離WT小鼠和ApoE-/-小鼠的心臟(Heart)和主動脈血管(Aorta)。
[0070]2.組織總 RNA 提取(TRIzol 法)
[0071]取50-100mg組織置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置5min。后續(xù)步驟參照實施例1中步驟(2)中的2)-8)。
[0072]3.qRT-PCR檢測不同組織中miRNA_133a的表達量
[0073]以小鼠心臟和主動脈血管總RNA作為模板，進行qRT-PCR檢測。(方法步驟同實施例I中步驟(3))
[0074]實施例3
[0075]WT小鼠和ApoE-/-小鼠動脈血管平滑肌細胞(VSMC)的分離和免疫熒光鑒定
[0076]I)小鼠動脈血管平滑肌細胞(VSMC)的分離
[0077]I)常規(guī)方法分離小鼠主動脈。在顯微鏡下用鑷子主動脈周圍附著的結(jié)締組織露出肌層。將主動脈沿縱軸剪開后再將其剪成I X Imm的小塊。
[0078]2)將7.5mg膠原蛋白酶(II型)溶解在5.5ml的無血清的新鮮DMEM細胞培養(yǎng)液中，將其用0.22um的微孔濾膜過濾后備用。
[0079]3)將剪好的血管組織塊放入含有膠原酶的DMEM培養(yǎng)液中。將其置入37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4-6小時。
[0080]4)從孵箱中取出孵育后的消化組織，加入3ml含血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化過程。
[0081]5)將組織消化液移入15ml離心管中，室溫離心，300gX 5min，棄上清。加入5ml含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液重懸細胞。
[0082]6)將細胞混懸液加入48孔細胞培養(yǎng)板，將其置于標準的細胞培養(yǎng)箱中孵育5天后正常傳代培養(yǎng)。
[0083](2)小鼠動脈血管平滑肌細胞(VSMC)的免疫熒光鑒定
[0084]I)細胞爬片后用4%多聚甲醛固定1min ;PBS漂洗5min ；
[0085]2)0.5% Triton 穿孔 15min ；PBS 漂洗 2 次，每次 5min ；
[0086]3) I % BSA 封閉 30min ；
[0087]4)加入 I % BSA 稀釋的一抗 Ant1- a -SM-actin，于 37°C雜交 2h ；PBS 漂洗 2 次，每次 5min ；
[0088]5)加入I % BSA稀釋的二抗，于37°C雜交Ih ；PBS漂洗2次，每次5min ；
[0089]6) 5ug/ml DAPI 染色 2min ；
[0090]7)抗淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡觀察
[0091]實施例4
[0092]檢測VSMC細胞內(nèi)miR_133a的表達量以及細胞增殖分化情況
[0093](I)檢測高脂狀態(tài)培養(yǎng)WT和ApoE-/-小鼠VSMC細胞內(nèi)miR_133a的表達量
[0094]I)細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)4X 104。
[0095]2)在不含脂質(zhì)的DMEM培養(yǎng)液中加入οχ-LDL使其濃度達到50ug/ml。
[0096]3)將其放入標準的細胞培養(yǎng)箱中孵育72小時。
[0097]4)收集細胞總RNA進行qRT_PCR檢測細胞內(nèi)miRNA_133a的表達量。具體方法參照實施例2。
[0098](2)運用miRNA_133a的反義寡核苷酸序列anti_miR-133a和前體RNApre-miR-133a 調(diào)節(jié)細胞內(nèi) miRNA_133a 的表達
[0099]I)細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)4X 104。
[0100]2)將 Iul 的轉(zhuǎn)染試劑 siPORT NeoFX (AM4510，Amb1n)和 25ul 的 0ΡΤΙ-ΜΕΜ I 培養(yǎng)液(Invitrogen)混合放置于室溫孵育10分鐘。
[0101]3)將反義寡核苷酸序列ant1-miR_133a(或者前體RNA pre_miR-133a)用OPT1-MEM I培養(yǎng)液稀釋，兩者混勻后放置于室溫孵育10分鐘。運用無功能的miRNA序列處理細胞(Scrambled miRNA,無關(guān)序列miRNA)作為對照組。
[0102]4)混勻稀釋好的ant1-miR_133a (或者pre-miR_133a)和轉(zhuǎn)染試劑，放置于室溫孵育10分鐘使其形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
[0103]5)將含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)液加入細胞培養(yǎng)板，與細胞共同孵育72小時。顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)。動脈平滑肌細胞分化標志性蛋白a-SM-actin熒光染色，具體方法參照實施例2。
[0104]6)收集細胞總RNA進行qRT-PCR檢測細胞內(nèi)miRNA_133a的表達量，具體方法參照實施例2。
[0105](3)不同方式培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞繪制細胞生長曲線
[0106]I)細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞數(shù)I X 104。
[0107]2)用含有
[0108]正常血清、[0109]高脂血清(50ug/ml ox-LDL,含有量下同)、
[0110]ant1-miR-133a (或者 pre_miR-133a) (10ng/ml 的 miR 溶液，取 10 μ 1，下同)、
[0111]高脂血清和anti_miR-133a (或者 pre_miR-133a)、
[0112]高脂血清和SEQID1、
[0113]高脂血清和SEQ ID2、
[0114]高脂血清和SEQ ID3、
[0115]高脂血清和SEQ ID4、
[0116]高脂血清和不同比例混合的SEQ IDl和SEQ ID3)(取10ng/ml的miR溶液混合，總量為10 μ 1，下同)、
[0117]高脂血清和不同比例混合的SEQ ID2和SEQ ID4
[0118]的DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)細胞。
[0119]3)分別制作以上種培養(yǎng)方式作用下VSMC細胞生長曲線。一次取3孔細胞，常規(guī)消化計數(shù)，求其平均值，連續(xù)7天，記錄結(jié)果以及制作VSMC生長曲線。
[0120]統(tǒng)計學(xué)處理
[0121]所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差(元士S)表示，兩樣本之間比較用t檢驗，以ρ〈0.05具有
統(tǒng)計學(xué)意義。
[0122]結(jié)果:
[0123]1.高脂血癥、動脈粥樣硬化等心血管疾病人外周血單核細胞內(nèi)miRNA_133a的表達量與正常健康人相比明顯降低(圖1)。該結(jié)果提示:檢測外周血中單核細胞內(nèi)miRNA-133a表達量的方法可以作為診斷高脂血癥、動脈粥樣硬化的指針。
[0124]2.作為高脂血癥及動脈硬化研究模型的ApoE-/-小鼠，其主動脈血管的miRNA-133a表達量明顯低于正常野生型WT小鼠(圖2)。而心臟組織的miRNA_133a表達量沒有明顯差異。該結(jié)果表明miRNA-133a的表達和調(diào)控存在有一定的組織特異性。
[0125]3.平滑肌細胞分化標志性蛋白a -SM-actin只在成熟的平滑肌細胞中表達，由WT小鼠和ApoE-/-小鼠主動脈分離所得到的平滑肌細胞均可觀察到專門針對該蛋白的抗體所產(chǎn)生特異性熒光，細胞分離方法可靠方便(圖3)。
[0126]4.高脂狀態(tài)(ox_LDL50ug/ml)培養(yǎng) WT 和 ApoE-/-小鼠 VSMC 細胞內(nèi) miR_133a 的表達量明顯降低(圖4) ;miRNA-133a反義寡核苷酸可以抑制miRNA-133a在細胞內(nèi)的表達水平(圖5)，隨著miRNA-133a表達量的降低，顯微鏡觀察細胞的增殖和分化受到抑制，細胞數(shù)量和形態(tài)與相應(yīng)對照組相比均發(fā)生明顯的變化(圖6和圖7)。而miRNA-133a的前體RNA pre-miR-133a可以增加miRNA-133a在細胞內(nèi)的表達水平(圖8)，促進細胞的增殖和分化，細胞數(shù)量和形態(tài)與相應(yīng)對照組相比均發(fā)生明顯的變化(圖9)。
[0127]5.根據(jù)繪制的細胞生長曲線，ApoE-/-小鼠的細胞增殖速度要低于同樣方式培養(yǎng)的WT小鼠細胞；高脂和miRNA-133a反義寡核苷酸單獨作用時均可抑制細胞的增殖，兩者共同作用時效果更為明顯。而miRNA-133a的前體RNApre_miR-133a可以促進細胞的增殖，在一定程度上消除高脂對細胞增殖的影響(圖10，圖11)。
[0128]6.各種不同條件下培養(yǎng)的小鼠血管平滑肌細胞結(jié)果如下表1 (僅顯示第5和第7天的結(jié)果)，結(jié)果顯示本發(fā)明的SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3和SEQ ID4均能幫助恢復(fù)小鼠血管平滑肌細胞的增長，并且將不同來源的上述miRNA-133a序列混合使用時，效果更為顯著。[0129]表1培養(yǎng)第5天和第7天時的小鼠血管平滑肌細胞數(shù)
[0130]
【權(quán)利要求】
1.一種miRNA在治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病中的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA 是 miRNA-133a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述 miRNA 的序列為 SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3 或 SEQ ID4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于， 將SEQ IDl與SEQ ID3、或者將SEQ ID2與SEQ ID4混合應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中， 所述SEQ IDl與SEQ ID3、以及所述SEQ ID2與SEQ ID4在應(yīng)用時的混合比例為1: 9~9: I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述miRNA能夠促進血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖和分化。
6.一種制備治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病的藥物組合物，其特征在于，含有藥學(xué)上可接受的載體和有效量的miRNA序列SEQ IDU SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，含有SEQIDl與SEQ ID3、或者SEQID2與SEQ ID4的混合序 列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其中， 所述SEQ IDl與SEQ ID3、以及所述SEQ ID2與SEQ ID4在所述藥物組合物中的混合比例為1: 9~9:1。
9.一種治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病的探針，其特征在于所述探針的序列為SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4 的互補序列。
10.一種治療或診斷高脂血癥及動脈硬化疾病的試劑盒，其特征在于含有如權(quán)利要求9所述的探針。
【文檔編號】C12N15/11GK104027820SQ201410196638
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】聶瑛潔, 高松, 耿永健, 陳輝, 安宇 申請人:貴州省人民醫(yī)院