一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，包括SEQIDNO.1～24。3.本發(fā)明針對(duì)G6PD基因6個(gè)高頻突變位點(diǎn)，提供了一種準(zhǔn)確及特異性好、檢出率高、成本低及推廣性好，且能區(qū)分雜、純合突變的快速的G6PD缺陷癥基因突變檢測(cè)試劑盒，在基因水平上為G6PD缺乏癥的及早診斷和預(yù)防提供快速可靠的分子診斷依據(jù),能在最短時(shí)間內(nèi)使患者確診，及時(shí)對(duì)癥處理，避免病情進(jìn)一步惡化，不僅對(duì)降低G6PD缺乏癥的危害，減少家庭的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)具有重要的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)意義，同時(shí)具有較高的臨床推廣應(yīng)用價(jià)值及廣泛的市場(chǎng)前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及診斷試劑盒，用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變的體外診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖_6_憐酸脫氧酶（Glucose-6-phosphatedehy Drogenase, G6PD)缺陷癥是一種常見(jiàn)的X連鎖不完全顯性遺傳病，也是人類(lèi)最常見(jiàn)的酶缺陷病之一。Gero缺陷癥在我國(guó)發(fā)病率約為4%~15%，個(gè)別地區(qū)高達(dá)40%以上，常見(jiàn)于我國(guó)西南（重慶、四川及貴州）和華南數(shù)省（廣東、廣西及海南等）。
[0003]G6ro是存在于所有細(xì)胞和組織中的磷酸戊糖旁路代謝的起始酶，它提供戊糖用于核酸合成，提供還原型輔酶II (NADPH)用于各種生物合成及維持血紅蛋白和紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。G6H)缺乏不僅影響NADPH的生物合成，防礙過(guò)氧化氫和成熟紅細(xì)胞的其他化合物的解毒作用；G6H)缺乏癥患者可由多種誘因如誤食蠶豆、氧化性藥物、感染性疾病等均可誘發(fā)急性溶血，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。Gero缺陷癥患者臨床表現(xiàn)變化大?；颊咴跓o(wú)誘因誘導(dǎo)情況下與常人無(wú)異，一旦經(jīng)接觸誘因常會(huì)導(dǎo)致急性溶血，起病急促，進(jìn)展迅速，從無(wú)癥狀到新生兒黃疽、藥物或感染造成的急性溶血、蠶豆病和重癥慢性非球形細(xì)胞血溶性貧血，嚴(yán)重者導(dǎo)致新生兒期重癥核黃疽，如不及時(shí)對(duì)癥處理常會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，造成永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷甚至死亡，極大威脅人民生命健康。
[0004]我國(guó)G6ro缺陷癥的輔助診斷經(jīng)歷了酶活性測(cè)定與基因分析等多種診斷方法。由于酶學(xué)法檢測(cè)影響因素眾多，準(zhǔn)確性低，尤其對(duì)于Gero缺乏癥基因攜帶者的“雜合子”女性患者（其酶活性變化范圍很大：既可表現(xiàn)為正常，也可低至半合子水平）酶活性檢測(cè)很難檢出，也是G6ro缺乏癥目前實(shí)驗(yàn)室漏檢的主要原因。由于已明確G6ro基因突變是G6ro缺陷癥的分子基礎(chǔ)，使得基因水平診斷成為G6ro缺陷癥臨床確診的最直接手段。
[0005]目前已存在一些獲得認(rèn)可且已推廣的方法。其中部分已有的一些方法如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（SSCP)，變性梯度凝膠電泳法（DGGE)，溫度梯度凝膠電泳（TGGE)、高效液相色譜分析法（DHPLC)、DNA直接測(cè)序等，檢測(cè)準(zhǔn)確度雖高，但由于費(fèi)用昂貴、手續(xù)復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等因素，限制了其在臨床推廣使用；而其他一些獲得認(rèn)可方法，如等位基因特異性擴(kuò)增法(ARMS-PCR)、PCR錯(cuò)配限制性酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交（ASO)法，也仍存在要么效率低下、漏檢率或假陽(yáng)性率高；要么檢測(cè)位點(diǎn)過(guò)少，無(wú)法區(qū)分雜合或純合突變等諸多的缺限，導(dǎo)致許多G6ro缺陷癥患者得不到及時(shí)診斷或誤診，限制了臨床上的及時(shí)救治，錯(cuò)過(guò)了早期干預(yù)的時(shí)機(jī)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)目前葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變的檢測(cè)現(xiàn)狀，提供一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，能夠一次區(qū)分G6H)基因中6個(gè)高頻突變位點(diǎn)中的正常與突變DNA，以及突變DNA中的純合突變與雜合突變狀況，達(dá)到準(zhǔn)確，快速，廉價(jià)的診斷目的。
[0007]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下措施實(shí)現(xiàn)的：
[0008]一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，包括SEQ IDN0.1~
24。所述序列分別針對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥（G6PD)致病相關(guān)的六個(gè)主要高頻原發(fā)突變位點(diǎn)G1388A、G1376T、A95G、C1004T、C1024T、G871A，針對(duì)每一個(gè)突變位點(diǎn)分別采用四條引物-兩條外引物和兩條內(nèi)引物，兩條外引物擴(kuò)增的片段作為PCR體系的內(nèi)對(duì)照，排除體系自身原因造成的誤診，兩條內(nèi)引物分別反向擴(kuò)增突變及正常的等位基因，能夠一次鑒定區(qū)分G6H)基因中正常與突變DNA，以及突變DNA中的純合突變與雜合突變狀況。
[0009]本發(fā)明試劑盒的診斷原理如圖I所示，Pl和P2為擴(kuò)增含有突變點(diǎn)基因片段的外引物，SI和S2為兩條特異性引物即內(nèi)引物，分別與DNA雙鏈的兩條單鏈互補(bǔ)，其3'端正好與SNP位點(diǎn)重合，由引物的3'端控制著引物的延伸反應(yīng)，根據(jù)延伸產(chǎn)物的長(zhǎng)度確定SNP類(lèi)型，并通過(guò)在引物的3'端區(qū)域引入一個(gè)人為不匹配堿基來(lái)提高延伸反應(yīng)的特異性。野生型(W)基因只能與相匹配的特異性引物S2發(fā)生延伸反應(yīng)。特異性引物SI由于其3'末端堿基與模板不配對(duì)，故不發(fā)生延伸反應(yīng)，因此PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物只有DNA片段P1P2和P1S2 ；同理，突變型（M)基因僅與其配對(duì)的特異性引物SI發(fā)生延伸反應(yīng)，特異性引物S2由于其3'末端堿基與模板不配對(duì)，故不發(fā)生延伸反應(yīng).因此PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物只有DNA片段P1P2和S1P2。
[0010]為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化檢測(cè)程序，降低檢測(cè)成本，并保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性和特異性，SEQ IDNO. I ~4 與 SEQ ID NO. 13 ~16，SEQ ID NO. 5 ~8 與 SEQ ID NO. 17 ~20，SEQ ID NO. 9 ~12與SEQ ID NO. 21~24分別在同一反應(yīng)體系。成功構(gòu)建了多重四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)（Mutiplex Tetra-primer-ARMS-PCR, MT-ARMS-PCR)，能在單管內(nèi)進(jìn)行將多種單個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，極大簡(jiǎn)化檢測(cè)程序，降低檢測(cè)成本，方便實(shí)用。同一樣本僅進(jìn)行三管PCR檢測(cè)，即可快速、準(zhǔn)確、高特異性的得到G6H)缺陷癥6個(gè)高頻位點(diǎn)突變的基因檢測(cè)結(jié)果。
[0011]上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥體外診斷試劑盒，SEQ ID NO. 9 ：SEQ ID NO. 10 ：SEQ ID NO. 11 ：SEQ ID NO. 12 ：SEQ ID NO. 21 ：SEQ ID NO. 22 ：SEQ ID NO. 23 ：SEQ ID NO. 24 = 2 —10 ： 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10，SEQ ID NO. 5 :SEQ ID NO. 6 ：SEQ ID NO. 7 ：SEQ ID NO. 8 ：SEQ ID NO. 17 ：SEQ ID NO. 18 ：SEQ ID NO. 19 ：SEQ IDNO. 20 = 2 ~10 ： 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10 : 2 ~10,SEQ ID NO. I ：SEQ ID NO. 2 ：SEQ ID NO. 3 ：SEQ ID NO. 4 ：SEQ ID NO. 13 ：SEQ ID NO. 14 ：SEQ IDNO. 15 ：SEQ ID NO. 16 = 7 ： 7 ： 7 ： 7 ： 12. 5 ： 12. 5 ： 5 ： 5，以摩爾比計(jì)。本試劑盒特定調(diào)整外引物與內(nèi)引物用量，其效果在于有效的平衡外側(cè)與內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增效率，提高結(jié)果的特異性，便于擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。
[0012]為了更簡(jiǎn)單方便的得到更清晰易辨的檢測(cè)結(jié)果，上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒的使用方法是將三組引物分別與DNA擴(kuò)增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95°C保溫lOmin，然后按95°C 30s、55°C~65°C 30s,72°C 30s的條件進(jìn)行35個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)，在72°C保溫IOmin進(jìn)行成像或測(cè)序檢測(cè)。優(yōu)選為95°C 30s,63°C 30s、72°C 30s。
[0013] 有益效果[0014]I.使用本發(fā)明的試劑盒，可直接通過(guò)PCR擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度，一次性鑒定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥G6H)基因中6個(gè)高頻突變位點(diǎn)中正常與突變DNA，以及其DNA突變是純合突變或雜合突變。
[0015]2.本發(fā)明可進(jìn)行6個(gè)單管PCR或三管雙重同時(shí)擴(kuò)增，一次電泳得到檢測(cè)結(jié)果，所需儀器簡(jiǎn)單，具有操作簡(jiǎn)單、觀察簡(jiǎn)單、耗費(fèi)低廉、檢測(cè)快速而準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，適合臨床推廣普及，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
[0016]3.本發(fā)明針對(duì)G6H)基因6種高頻突變位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出一種準(zhǔn)確及特異性好、檢出率高、成本低及推廣性好，且能區(qū)分雜、純合突變的快速的G6ro缺陷癥基因突變檢測(cè)試劑盒，在基因水平上為Gero缺乏癥的及早診斷和預(yù)防提供快速可靠的分子診斷依據(jù)，能在最短時(shí)間內(nèi)使患者確診，及時(shí)對(duì)癥處理，避免病情進(jìn)一步惡化，不僅對(duì)降低G6ro缺乏癥的危害，減少家庭的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)具有重要的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)意義，同時(shí)具有較高的臨床推廣應(yīng)用價(jià)值及廣泛的市場(chǎng)前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖I本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變的原理；
[0018]圖2實(shí)施例1①PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；
[0019]圖3實(shí)施例1②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；
[0020]圖4實(shí)施例1③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；
[0021 ]圖5實(shí)施例1④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；
[0022]圖6實(shí)施例1⑤PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；
[0023]圖7實(shí)施例1⑥PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果
[0024]圖8為實(shí)施例1①G1388A位點(diǎn)無(wú)突變的局部測(cè)序圖；
[0025]圖9為實(shí)施例1①G1388A位點(diǎn)為純合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為G突變?yōu)锳 ：
[0026]圖10為實(shí)施例1①G1388A位點(diǎn)為雜合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為G突變?yōu)锳 ；
[0027]圖11為實(shí)施例1②G1376T位點(diǎn)無(wú)突變的局部測(cè)序圖
[0028]圖12為實(shí)施例1②G1376T位點(diǎn)為純合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為G突變?yōu)門(mén)
[0029]圖13為實(shí)施例1②G1376T位點(diǎn)為雜合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為G突變?yōu)門(mén)
[0030]圖14為實(shí)施例1③A95G位點(diǎn)無(wú)突變的局部測(cè)序圖
[0031]圖15為實(shí)施例1③A95G位點(diǎn)為純合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為A突變?yōu)镚 ：
[0032]圖16為實(shí)施例1③A95G位點(diǎn)為雜合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為A突變?yōu)镚 ：
[0033]圖17為實(shí)施例1④C1004T位點(diǎn)無(wú)突變的局部測(cè)序圖
[0034] 圖18為實(shí)施例1④C1004T位點(diǎn)為純合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為C突變?yōu)門(mén)[0035]圖19為實(shí)施例1④C1004T位點(diǎn)為雜合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為C突變?yōu)棣?br> [0036]圖20為實(shí)施例1⑤C1024T位點(diǎn)無(wú)突變的局部測(cè)序圖
[0037]圖21為實(shí)施例1⑤C1024T位點(diǎn)為純合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為C突變?yōu)門(mén) ；
[0038]圖22為實(shí)施例1⑤C1024T位點(diǎn)為雜合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為C突變?yōu)門(mén) ；
[0039]圖23為實(shí)施例1⑥G871A位點(diǎn)無(wú)突變的局部測(cè)序圖
[0040]圖24為實(shí)施例1⑥G871A位點(diǎn)為純合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為G突變?yōu)锳 ：
[0041]圖25為實(shí)施例1⑥G871A位點(diǎn)為雜合突變的局部測(cè)序圖，在圖中顯示為G突變?yōu)锳 ：
[0042]圖26多重?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測(cè)A95G和G871A兩個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；
[0043]圖27多重?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測(cè)G1376T和C1024T兩個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果；圖28多重?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測(cè)G1388A和C1004T兩個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成像結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0044]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。
[0045]實(shí)施例1
[0046]I.樣本：人全血提取的DNA(50~100ng/ul)。樣本I和2為正常對(duì)照，是指擴(kuò)增模板來(lái)源于無(wú)下述6個(gè)高頻突變的正常人血DNA ;樣本3和4為純合突變體，是指擴(kuò)增模板來(lái)源于有下述6個(gè)高頻突變的G6H)缺陷癥病人全血DNA，且突變?yōu)榧兒献油蛔?；樣?和6為雜合突變，是指擴(kuò)增模板來(lái)源于有下述6個(gè)高頻突變的G6H)缺陷癥病人全血DNA，且突變?yōu)殡s合子突變。
[0047]2.試劑：（..io.l.aq ' Hot Start Green Master Mix, 2X ：包含 2XGreen Go TaqReaction Buffer(pH8. 5),400 μ M dATP、400 μ M GATP、400 μ M dCTP、400 μ M dTTP、4mMMgCl2> Nuclease-Free Water、DNA 聚合酶。
[0048]3. T-ARMS-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序
[0049]①G1388A采用以下引物、體系及程序?qū)Ω鳂颖具M(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果如圖2所示。
[0050]內(nèi)引物：S1 ：GACGAGCTCCGTGAGGCCTGTCA(SEQ ID NO. I)
[0051 ] S2 ： TGGTGCAGCAGTGGGGTGAAAAGAC(SEQ I D NO. 2)
[0052]外引物：P1：GCCCTACAGAGAAGGAGCAGTGTGGAG(SEQ ID NO. 3)
[0053]P2 ：CTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGGGGAT(SEQ ID NO. 4)
[0054]反應(yīng)體系
【權(quán)利要求】
1.一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，包括SEQ ID N0.1~24。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，SEQID N0.1 ~4 與 SEQ ID N0.13 ~16，SEQ ID N0.5 ~8 與 SEQ ID N0.17 ~20，SEQ ID N0.9 ~12與SEQ ID N0.21~24分別在同一反應(yīng)體系。
3.如權(quán)利要求2所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒，SEQID N0.9:SEQ ID N0.10:SEQ ID N0.11:SEQ ID N0.12:SEQ ID N0.21:SEQ ID N0.22:SEQ IDN0.23:SEQ ID N0.24=2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10，SEQID N0.5:SEQ ID N0.6:SEQ ID N0.7:SEQ ID N0.8:SEQ ID N0.17:SEQ ID N0.18:SEQ ID N0.19:SEQ ID N0.20=2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10:2 ~10，SEQ ID N0.1:SEQ ID N0.2:SEQ ID N0.3:SEQ ID N0.4:SEQ ID N0.13:SEQ ID N0.14:SEQ ID N0.15:SEQ IDN0.16=7:7:7:7:12.5:12.5:5:5，以摩爾比計(jì)。
4.如權(quán)利要求1~3所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥基因突變體外診斷試劑盒使用方法，將所述SEQ ID N0.1~24分別與DNA擴(kuò)增模板、DNA聚合酶、dNTP混合后在95 °C保溫lOmin，然后按95°C 30s、55°C~65°C 30s,72°C 30s的條件進(jìn)行35個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)，在72°C保溫1min進(jìn)行 成像電泳分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017862SQ201410180904
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】黃軼, 李陽(yáng), 宋利華 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院, 黃軼