一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法，主要步驟為：在糟醅中加入細(xì)胞培養(yǎng)所用的PBS緩沖液進(jìn)行多次漩渦震蕩、離心分離糟醅及洗脫液，再離心所有洗脫液獲得菌泥；然后將收集得到的菌泥進(jìn)行預(yù)凍和真空冷凍干燥。通過對(duì)原糟醅和處理后的各樣品中微生物損失率及微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：采用本發(fā)明的處理方法，細(xì)菌與真菌總量的損失率在2.0%以內(nèi)，單菌株的損失率在2.5%以內(nèi)，且收集的菌泥具有生物活性，微生物結(jié)構(gòu)與原糟醅一致。運(yùn)用該預(yù)處理方法收集得到的菌泥，便于將其裝入安瓿管內(nèi)冷凍干燥及后期真空融封，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，該方法可廣泛應(yīng)用于其它欲分離、收集群體微生物且保持生物活性的用途，為微生物多樣性分析的群體損失率估算提供重要依據(jù)。
【專利說明】一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種活性微生物的收集方法，特別涉及一種基于冷凍干燥技術(shù)保藏糟醅中群體微生物的處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物是國(guó)家的重要資源，微生物保藏是微生物學(xué)研究及相關(guān)生產(chǎn)應(yīng)用的必要技術(shù)手段。真空冷凍干燥技術(shù)兼具低溫、干燥和隔絕空氣三個(gè)菌種保藏的主要因素，是目前公認(rèn)的長(zhǎng)期保存微生物菌種的最安全、可靠的方法之一，適用范圍廣，保藏期長(zhǎng)，成活率高。目前微生物保存主要以單菌株為研究對(duì)象，而對(duì)于結(jié)構(gòu)性的群體微生物保藏的研究報(bào)道甚少。
[0003]糟醅富含微生物生長(zhǎng)繁殖所需各種營(yíng)養(yǎng)條件，它經(jīng)歷了一定發(fā)酵時(shí)間且網(wǎng)絡(luò)大量微生物，糟醅的堆積發(fā)酵有二次制曲的作用，其發(fā)酵的好壞，直接影響白酒的風(fēng)味及質(zhì)量。不同白酒的發(fā)酵糟醅有其獨(dú)有的微生物結(jié)構(gòu)，白酒風(fēng)格香型的不同很大程度上源于其群體微生物類別、結(jié)構(gòu)的差異。對(duì)于其中的微生物進(jìn)行群體性保藏，便于微生物的研究及特征性群體微生物在生產(chǎn)、工業(yè)上的應(yīng)用。
[0004]本研究人員在對(duì)糟醅中群體微生物結(jié)構(gòu)、活性、收集等研究中發(fā)現(xiàn)，如果直接將糟醅附基質(zhì)進(jìn)行保藏，由于糟醅顆粒的存在，將延長(zhǎng)冷凍干燥時(shí)間，不利于凍干劑的均質(zhì)有效保護(hù)，也不利于后續(xù)的真空融封保藏，從而降低了微生物的存活率，縮短了微生物的保藏時(shí)間?，F(xiàn)有技術(shù)中，洗脫法轉(zhuǎn)移樣品微生物的主要目的是提取微生物基因組進(jìn)行多樣性分析，此過程中部分微生物已失活,且未分析微生物損失率,微生物信息的整體代表性無法估算。因此如何完整的轉(zhuǎn)移出其中的群體微生物且不影響活性將成為關(guān)鍵。本研究人員通過不同的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)將糟醅運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)所用的緩沖液進(jìn)行多次漩渦振蕩、洗脫，離心分離糟醅及微生物，最后獲得了與糟醅微生物結(jié)構(gòu)一致的活性菌泥；然后將收集的菌泥進(jìn)行冷凍干燥，與直接將糟醅進(jìn)行凍干保藏相比，不僅減少了冷凍干燥的時(shí)間，還提高了微生物的存活率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明提供一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法，該方法是基于真空冷凍干燥技術(shù)來對(duì)糟醅中群體微生物進(jìn)行保藏，目的是將糟醅中的微生物盡可能完整的轉(zhuǎn)移出來，且不損傷其活性，以提高其存活率、便于后期真空融封保藏和延長(zhǎng)保藏時(shí)間，使糟醅中微生物的群體保藏可行。
[0006]為實(shí)現(xiàn)該目的，技術(shù)方案如下:
[0007]一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法，步驟如下:
[0008]1)洗脫、轉(zhuǎn)移步驟:
[0009]a、稱取 糟醅于無菌離心管中，加入無菌玻璃珠及細(xì)胞培養(yǎng)用的無菌PBS緩沖液，漩禍震蕩4~6min,在離心機(jī)內(nèi)離心5~7min,收集洗脫液,備用；[0010] b、將步驟a中洗脫的剩余糟醅加入無菌PBS緩沖液,鏇潤(rùn)震蕩3~4min,在離心機(jī)內(nèi)離心5~7min,收集洗脫液,備用；
[0011 ] C、上述步驟b重復(fù)2次，共計(jì)震蕩洗脫糟醅4次，總計(jì)加入無菌PBS緩沖液150~255ml ；
[0012]d、合并上述a、b、c的洗脫液,在離心機(jī)內(nèi)離心6~8min,收集上清液及菌泥；
[0013]2)真空凍干步驟:
[0014]a、將步驟I)中收集到的菌泥加入混合保護(hù)劑，菌泥與混合保護(hù)劑的質(zhì)量體積比為1:1~1: 2，混勻，置于安瓿管內(nèi)，在-80~4°C溫度條件下預(yù)凍6~8h ;
[0015]b、將上述預(yù)凍樣品在-50~_40°C溫度條件下真空冷凍干燥19_23h，凍干結(jié)束后，檢測(cè)微生物存活率，即得。
[0016]上述處理方法，步驟I) a中無菌玻璃珠加入量為3~5顆，直徑6mm ；
[0017]步驟I) a、b中離心機(jī)的工作參數(shù)為:4°C、300~500rpm ;步驟I) d中離心機(jī)的工作參數(shù)為:4°C、6000 ~7000rpm ；
[0018]步驟I)中 PBS 緩沖液的配制方法為:將 8gNaCl、0.2gKCl、3.63gNa2HP04.12H20、0.24gKH2P04溶入IL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH為7.4，即得。 [0019]上述處理方法，步驟2)a中混合保護(hù)劑的配方為:16~18%的脫脂奶，8~10%的葡萄糖，2~3%的甘油；
[0020]步驟2) a中預(yù)凍程序?yàn)?在4°C冷藏Ih，_20°C冷凍2h，_80°C冷凍3~5h ;
[0021]步驟2) b中真空冷凍干燥程序?yàn)?主干燥設(shè)置參數(shù)為-50°C、18~20h,后干燥設(shè)置參數(shù)為_40°C、1~3h。優(yōu)選主干燥設(shè)置參數(shù)為_50°C、19h,后干燥設(shè)置參數(shù)為_40°C、2h。
[0022]具體地，一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法，步驟如下:
[0023]I)洗脫、轉(zhuǎn)移步驟:
[0024]a、稱取10~15g糟醅于無菌離心管中，加入3~5顆6mm的無菌玻璃珠及細(xì)胞培養(yǎng)用的無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩4~6min，在4°C離心機(jī)內(nèi)300~500rpm離心5~7min，收集洗脫液，備用；
[0025]b、將步驟a中洗脫的剩余糟醅加入無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩3~4min，在4°C離心機(jī)內(nèi)300~500rpm離心5~7min,收集洗脫液,備用；
[0026]C、上述步驟b重復(fù)2次，共計(jì)震蕩洗脫糟醅4次，總計(jì)加入無菌PBS緩沖液150~255ml ；
[0027]d、合并上述a、b、c的洗脫液，在4i5C離心機(jī)內(nèi)以6000rpm~7000rpm離心6~8min,收集上清液及菌泥；
[0028]2)真空凍干步驟:
[0029]a、將收集到的菌泥加入混合保護(hù)劑，菌泥與混合保護(hù)劑的質(zhì)量體積比為1:1~1:2，混勻，置于安瓿管內(nèi)，進(jìn)行如下預(yù)凍程序:在4°C冷藏lh，-20°C冷凍2h，-80°C冷凍3-5h ;所述混合保護(hù)劑的配方為:16~18%的脫脂奶、8~10%的葡萄糖、2~3%的甘油；
[0030]b、將上述預(yù)凍樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥時(shí)間為19~23h，主干燥設(shè)置參數(shù)為-50°C、18~20h,后干燥設(shè)置參數(shù)為-40°C、1~3h ；
[0031]C、干燥結(jié)束后，運(yùn)用平板稀釋法，檢測(cè)微生物存活率，即得。
[0032]為檢測(cè)該技術(shù)方法的可行，對(duì)糟醅在洗脫過程中微生物損失率進(jìn)行分析，具體方法如下:
[0033]a、原糟醅中微生物檢測(cè):稱取IOg糟醅，加入含90ml無菌水的三角瓶中，搖床震蕩30min，運(yùn)用平板稀釋法檢測(cè)原糟醅中所含細(xì)菌、真菌的種類及數(shù)量。
[0034]b、洗脫、轉(zhuǎn)移步驟獲得菌泥中微生物的檢測(cè):將步驟I)收集到的菌泥，加入含100mL無菌水的三角瓶中，運(yùn)用平板稀釋法檢測(cè)菌泥所含細(xì)菌、真菌的種類及數(shù)量。
[0035]C、洗脫、轉(zhuǎn)移步驟剩余糟醅中微生物的檢測(cè):將步驟I)洗脫完的剩余糟醅，加入含90ml無菌水的三角瓶中，運(yùn)用平板稀釋法檢測(cè)剩余糟醅中所含細(xì)菌、真菌的種類及數(shù)量。
[0036]d、洗脫、轉(zhuǎn)移步驟獲得上清液中微生物的檢測(cè):將步驟I)收集菌泥后的離心上清液，運(yùn)用平板稀釋法檢測(cè)其所含細(xì)菌、真菌的種類及數(shù)量。
[0037]上述洗脫過程中糟醅的微生物損失率的計(jì)算方法為:洗脫完的剩余糟醅所含微生物數(shù)量/原糟醅的微生物數(shù)量；
[0038]上述離心過程中糟醅的微生物損失率的計(jì)算方法為:收集菌泥后離心上清液的微生物數(shù)量/原糟醅的微生物數(shù)量；
[0039]二者損失率之和為該預(yù)處理方法的總微生物損失率。
[0040]上述各微生物檢測(cè)中，運(yùn)用平板稀釋法檢測(cè)微生物時(shí)，每個(gè)稀釋度均重復(fù)3次；所用的細(xì)菌培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基，其成分為:氯化鈉10%、蛋白胨10%、牛肉膏5%、瓊脂20%，pH為7.0，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為 37°C，時(shí)間24h ;所用真菌培養(yǎng)基為YEH)培養(yǎng)基，其成分為:葡萄糖10%、蛋白胨10%、酵母膏5%、瓊脂20%，pH自然，培養(yǎng)溫度為28°C，時(shí)間48h。
[0041]本發(fā)明將糟醅運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)所用的緩沖液進(jìn)行多次漩渦振蕩、洗脫，離心分離糟醅及微生物，結(jié)果表明:細(xì)菌與真菌總量的損失率在2.0%以內(nèi)，單菌株的損失率在2.5%以內(nèi)，且收集的菌泥具有生物活性，微生物結(jié)構(gòu)與原糟醅一致。將收集的菌泥進(jìn)行冷凍干燥，與直接將糟醅進(jìn)行凍干保藏相比，不僅減少了冷凍干燥的時(shí)間，還提高了微生物的存活率。因此，采用本發(fā)明的處理方法，既保持了糟醅中群體微生物的活性，且損失率低、微生物存活率高，還便于后期真空融封保藏和延長(zhǎng)保藏時(shí)間。該處理方法還可廣泛應(yīng)用于其它欲分離、收集群體微生物且保持生物活性的用途，為微生物多樣性分析的群體損失率分析提供重要依據(jù)。
[0042]具體的實(shí)施方式
[0043]實(shí)施例1:
[0044]—種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法，步驟如下:
[0045]I)洗脫、轉(zhuǎn)移步驟:
[0046]a、稱取IOg糟醅于無菌離心管中,加入3顆6mm的無菌玻璃珠、50ml細(xì)胞培養(yǎng)用的無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩4min，在4°C離心機(jī)內(nèi)以500rpm離心5min，收集洗脫液，備用；
[0047]b、將步驟a中洗脫的剩余糟醅加入40ml無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩3min，在4°C離心機(jī)內(nèi)以500rpm離心5min,收集洗脫液,備用；
[0048]C、上述步驟b重復(fù)2次，第1次無菌PBS緩沖液用量為40ml，第2次20ml，共計(jì)震蕩洗脫糟醅4次，總計(jì)加入無菌PBS緩沖液150ml ；
[0049]d、合并上述a、b、c的洗脫液,共計(jì)150ml,在4°C離心機(jī)內(nèi)以6500rpm離心7min,
收集上清液及菌泥；[0050]所述PBS 緩沖液配制方法為:將 8gNaCl，0.2gKCl，3.63gNa2HP04.12H20，
0.24gKH2P04溶入IL雙蒸水，調(diào)節(jié)PH為7.4 ;
[0051]2)真空凍干步驟:
[0052]a、將收集到的菌泥加入混合保護(hù)劑，菌泥與混合保護(hù)劑的質(zhì)量體積比為1: 1，混勻，置于安瓿管內(nèi)，進(jìn)行如下預(yù)凍程序:在4°C冷藏lh，-20°C冷凍2h，-80°C冷凍3h ;所述混合保護(hù)劑的配方為:16%的脫脂奶、8%的葡萄糖、2%的甘油；
[0053]b、將上述預(yù)凍樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥時(shí)間為21h，主干燥設(shè)置參數(shù)為_50°C、19h,后干燥設(shè)置參數(shù)為-40°C、2h ；
[0054]C、干燥結(jié)束后，運(yùn)用平板稀釋法，檢測(cè)微生物存活率，即得。
[0055]另外，稱取IOg糟醅2份，一份運(yùn)用平板稀釋法，檢測(cè)原糟醅中所含細(xì)菌、真菌的種類及數(shù)量；另外1份同上述步驟I)洗脫方法，將收集到的離心后的上清液、菌泥及洗脫完的糟醅，運(yùn)用平板稀釋法，檢測(cè)剩余糟醅、收集菌泥及上清液的微生物結(jié)構(gòu)。同法稱取IOg糟醅，按照步驟2)的方法進(jìn)行凍干，得干糟醅，運(yùn)用平板稀釋法，檢測(cè)微生物結(jié)構(gòu)。
[0056]糟醅在洗脫轉(zhuǎn)移過程中微生物損失率的分析結(jié)果及冷凍干燥后微生物存活率的對(duì)比結(jié)果如下:
[0057]表1糟醅在洗脫轉(zhuǎn)移過程中微生物損失率分析
【權(quán)利要求】
1.一種凍干保藏糟醅中群體微生物的處理方法，步驟如下: 1)洗脫、轉(zhuǎn)移步驟: a、稱取糟醅于無菌離心管中，加入無菌玻璃珠及細(xì)胞培養(yǎng)用的無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩4~6min,在離心機(jī)內(nèi)離心5~7min,收集洗脫液,備用； b、將步驟a中洗脫的剩余糟醅加入無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩3~4min，在離心機(jī)內(nèi)離心5~7min,收集洗脫液,備用； C、上述步驟b重復(fù)2次，共計(jì)震蕩洗脫糟醅4次，總計(jì)加入無菌PBS緩沖液150~255ml ； d、合并上述a、b、c的洗脫液,在離心機(jī)內(nèi)離心6~8min,收集上清液及菌泥； 2)真空凍干步驟: a、將步驟I)中收集到的菌泥加入混合保護(hù)劑，菌泥與混合保護(hù)劑的質(zhì)量體積比為1:1~1: 2，混勻，分別 置于安瓿管內(nèi)，在-80~4°C溫度條件下預(yù)凍6~8h ;。 b、將上述預(yù)凍樣品在-50~_40°C溫度條件下真空冷凍干燥19~23h，凍干結(jié)束后，檢測(cè)微生物存活率，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的處理方法，其特征在于:步驟I)a中無菌玻璃珠加入量為3~5顆，直徑6mm。
3.如權(quán)利要求1所述的處理方法,其特征在于:步驟I)a、b中離心機(jī)的工作參數(shù)為:40C>300~500rpm ;步驟l)d中離心機(jī)的工作參數(shù)為:4°C>6000~7000rpm。
4.如權(quán)利要求1所述的處理方法，其特征在于:步驟2)a中混合保護(hù)劑的配方為:16~18%的脫脂奶，8~10%的葡萄糖，2~3%的甘油。
5.如權(quán)利要求1所述的處理方法，其特征在于:步驟2)a中預(yù)凍程序?yàn)?在4°C冷藏lh, -20°C冷凍 2h，-80°C冷凍 3 ~5h ; 步驟2) b中真空冷凍干燥程序?yàn)?主干燥設(shè)置參數(shù)為-50°C、18~20h，后干燥設(shè)置參數(shù)為-40。。、I ~3h。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的處理方法，其特征在于:步驟如下: 1)洗脫、轉(zhuǎn)移步驟: a、稱取10~15g糟醅于無菌離心管中，加入3~5顆6mm的無菌玻璃珠及細(xì)胞培養(yǎng)用的無菌PBS緩沖液,鏇潤(rùn)震蕩4~6min,在4°C離心機(jī)內(nèi)300~500rpm離心5~7min,收集洗脫液，備用； b、將步驟a中洗脫的剩余糟醅加入無菌PBS緩沖液，漩渦震蕩3~4min，在4°C離心機(jī)內(nèi)300~500rpm離心5~7min,收集洗脫液,備用； C、上述步驟b重復(fù)2次，共計(jì)震蕩洗脫糟醅4次，總計(jì)加入無菌PBS緩沖液150~255ml ； d、合并上述a、b、c的洗脫液,在4°C離心機(jī)內(nèi)以6000rpm~7000rpm離心6~8min,收集上清液及菌泥； 2)真空凍干步驟: a、將收集到的菌泥加入混合保護(hù)劑，菌泥與混合保護(hù)劑的質(zhì)量體積比為1:1~1:2，混勻，置于安瓿管內(nèi)，進(jìn)行如下預(yù)凍程序:在4°C冷藏lh，-20°C冷凍2h，-80°C冷凍3~5h ;所述混合保護(hù)劑的配方為:16~18%的脫脂奶、8~10%的葡萄糖、2~3%的甘油；b、將上述預(yù)凍樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥時(shí)間為19~23h，主干燥設(shè)置參數(shù)為-50°C、18~20h,后干燥設(shè)置參數(shù)為-40°C、1~3h ； C、干燥結(jié)束后，運(yùn) 用平板稀釋法，檢測(cè)微生物存活率，即得。
【文檔編號(hào)】C12N1/04GK103966098SQ201410157467
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】姚翠萍, 楊帆, 王和玉, 汪地強(qiáng), 王莉 申請(qǐng)人:貴州茅臺(tái)酒股份有限公司