一種熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種熒光假單胞菌TonB依賴外膜受體及其應(yīng)用。外膜受體為序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。重組外膜受體蛋白的制備方法具體為以熒光假單胞菌TSS1為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增,PCR產(chǎn)物與載體pET259連接，獲得質(zhì)粒pEP796，質(zhì)粒pEP796轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)即可表達含序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸的重組蛋白。本發(fā)明的TonB依賴型外膜受體重組蛋白作為疫苗能夠有效地保護大菱鲆抵御熒光假單胞菌侵染。
【專利說明】一種熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種熒光假單胞菌TonB依賴外膜受體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光假單胞菌是一種營專性需氧的革蘭氏陰性細菌，其在分類學(xué)上屬于假單胞菌屬。熒光假單胞菌具有多種鞭毛，生長環(huán)境非常廣泛，包括:動植物、土壤、以及水體表面等。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，熒光假單胞菌是多種魚類的病原菌，有報道其可以感染草魚、娃娃魚、羅非魚以及鲆蝶類等多種經(jīng)濟魚類，感染后的魚體會表現(xiàn)出赤皮病，表現(xiàn)為鱗片脫落和皮膚出血。
[0003]TonB依賴型外膜受體是跨細菌細胞間質(zhì)的一類蛋白，其能夠和位于內(nèi)膜上的TonB-ExbB-ExbDd蛋白復(fù)合相互作用來獲得能量。TonB依賴的外膜受體相互之間的晶體結(jié)構(gòu)非常相似，主要由位于C端的22個β折疊組成的β桶結(jié)構(gòu)域和位于N端的塞子結(jié)構(gòu)域組成。TonB依賴的外膜受體可以跟Fe3+_鐵載體復(fù)合物結(jié)合，結(jié)合后會引起受體空間構(gòu)象的變化，進而引起Fe3+_鐵載體復(fù)合物結(jié)合跨膜的轉(zhuǎn)運。但是目前TonB依賴的外膜受體在熒假單胞菌中的作用還不 甚清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體及其應(yīng)用。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體，外膜受體為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示。
[0007]熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體的制備方法，以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體pET259連接，獲得質(zhì)粒pEP796，質(zhì)粒pEP796轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)即可表達含序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸的重組蛋白。
[0008]所述弓丨物為Fl:5’ -GATATCATGTACCGAGACAAGGTCAAGC-3’和 Rl:5’ -GATATCCCAGTTGTAAGACACCGTACC-3，。
[0009]熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體的應(yīng)用，所述受體的重組蛋白用于制備疫苗中的應(yīng)用。
[0010]進一步的說，所述受體的重組蛋白用于制備抵御熒光假單胞菌的疫苗中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0012]1.有效保護性。本發(fā)明的TonB依賴型外膜受體P796作為疫苗對熒光假單胞菌的免疫保護效率達62%。
[0013]2.本發(fā)明的疫苗無需商業(yè)化佐劑。
【專利附圖】

【附圖說明】[0014]圖1為本發(fā)明實施例提供的純化的TonB依賴型外膜受體P796蛋白(泳道2)。泳道I，分子量標準。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法:
[0016]1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相
應(yīng)試劑盒。
[0017]2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress2001)；
[0018]3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。
[0019]實施例1
[0020]熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體P796為序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列所示(參見序列表1)。
[0021]序列表1
[0022]MTYGLQFITATTGVLLSTTVMAASATQHFAIAAGPLDNALSQFAAKANVILSFSPQQTARLNTPGLQ⑶YSVDQGFALLLQNSDLQAVAQAPGSYVLQPAPAGQMTLAPTTVSAYQQGGFNQEIGGDVGYKAQNSRIGTKTSTPLSETPRSVSVVTGQRIKDQKSQTLTEVLGYVPGIFAPPFAAGDGLA⑶LFFIRGFNATDYGYGLLRDGLRVQGNRYDTTSEPYGLERVEIFRGPSSLLYGENAPGGLVNLVSKHPTATPQGEVQVSYGSNNRRQLGVDISGPLNDSDNILGRVVMLGRKSDTQTDHVPDDRLYIAPSLTLNFDDYNTLTLLANYQKDHTNLELGPPAAGTLLTNPNGKLSKHTLLGNPDWNTFEREAWSTGYEFSHSFNDDWQFRQNSRYMQSRINRHETWPGTLNNGGFGTRLNMNAYDRYNKSMVYSLDNQLEGKFQVGGVENTVLLGASYDRTSFNQDWDAGFAGTIDVYNPVYLRDPLTPLAVQNTLLEQQMKGVYAQVQSKYDHWLFLLGGRQDWVDSDYRDKVQPSSNINSQDRKFTYQGGVMYQFDNGLTPYVSYSTAFVPVQQISNAGSPLKPITSSQYEVGVKYEPIGWDTAMTLSVYDLRKQDDTYLDATTNSYRQVGESRAKGVEVEVNSDISANFNVTAAYTYTDARITKDSATSLVEGRQMTGVPRNQASVWGKYRFLDGQLKGFSLGGGVRYFDSTFSYTAPTLYGKLDAGSVTLVDAALGYQINPHWSVDLNAKNLFDKEYVSGCNDAGRCYWGDSRTLLGTVSYNW
[0023](a)序列特征:
[0024]?長度:796
[0025]?類型:氨基酸序列
[0026]籲鏈型:單鏈
[0027]?拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0028](b)分子類型:蛋白質(zhì)
[0029](C)假設(shè):否
[0030](d)反義:否
[0031](e)最初來源:熒光假單胞菌TSSl
[0032](f)特異性名稱 :P796
[0033]結(jié)構(gòu)特征:該蛋白具有一個信號肽結(jié)構(gòu)(氨基酸I 一 25)和一個TonB依賴型受體功能域(氨基酸557-795)。
[0034]實施例2
[0035]重組TonB依賴型外膜受體P796的制備
[0036]步驟I) TonB依賴型外膜受體P796表達載體pEP796的構(gòu)建方法:
[0037]以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增。擴增的序列為編碼序列表SEQ ID N0.1中氨基酸539-795。PCR條件為:94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后 94°C 40s, 50°C 60s, 72°C 60s, 5 個循環(huán)；然后 94°C 40s, 58°C 60s, 72°C 60s, 25 個循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin。PCR產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達載體pET259(pET259構(gòu)建過程參見Hu YH, Zheng ffff, Sun L.1dentification and molecular analysisof a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus).Fish ShellfishImmunol2010; 28:678-86)用限制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 —24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pEP796。DNA測序表明pEP796含有編碼序列表SEQ IDN0.1中氨基酸539-795序列的基因。
[0038]所述LB組成成分按重量百分比計:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97.5%蒸餾水；所述菌株TSSl保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為:CGMCC N0.2329，分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。
[0039]所述弓丨物為Fl:5，-GATATCATGTACCGAGACAAGGTCAAGC-3，和 Rl:5，-GATATCCCAGTTGTAAGACACCGTACC-3，。
[0040]步驟2)重組TonB依賴型外膜受體P796的誘導(dǎo)表達和純化:
[0041]將上述的質(zhì)粒pEP796用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，挑取一個轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pEP796。將BL21/pEP796于含有Ap (100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液，加入100mL新鮮的含有Ap(100ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動培養(yǎng)至OD6tltl為0.6，加入終濃度為ImM的IPTG，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動培養(yǎng)4 一 5h,而后以5000g,4°C離心10min,收集菌液,加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動1-2小時，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4°C離心30min,回收上清。將上清中的蛋白用His Trap HP Columns (購于美國GE Healthcare公司)回收純化，純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(8v/cm電壓下電泳25 — 30min,隨后15v/cm電壓下電泳2 - 2.5h)，測定其分子量大小(參見圖1)。
[0042]所述裂解液含IOmM NaH2PO4, IOmM Tris 和 8M 尿素，ρΗ8.0。
[0043]實施例3
[0044]重組TonB依賴型外膜受體Ρ796作為疫苗的應(yīng)用
[0045]步驟I)佐劑及疫苗混合液的制備。
[0046]佐劑對照液的制備:將5% (質(zhì)量比)NaOH和5% (質(zhì)量比)Al2 (SO4) 3以2:5體積比混合，將混合物以10，OOOg離心5分鐘。將沉淀懸浮于PBS中至0.2mg/ml,即為佐劑。將PBS與佐劑等體積混合，即為佐劑對照液。
[0047]疫苗混合液制備:將上述實施例2純化的重組TonB依賴型外膜受體P796蛋白在PBS中稀釋至lOOug/ml，將稀釋后的蛋白與佐劑等體積混合。
[0048]所述PBS 組成成分按重量百分比計:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0? 024%NaH2P04，余量為水。
[0049]步驟2)疫苗的免疫應(yīng)用。將60條大菱鲆(每條重約12.9g)隨機分為2組，每組30條。將這2組分別命名為A和B組。將A組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的疫苗混合液，將B組的每條魚分別腹腔注射IOOul上述步驟I)的佐劑對照液。
[0050]步驟3)熒光假單胞菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)熒光假單胞菌TSSl至0D_為1，然后離心(5000g，4°C)10min。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為lxl07cfu/ml。
[0051]步驟4)疫苗免疫保護效應(yīng)檢測。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3)的熒光假單胞菌懸液腹腔注射步驟2)的2組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的 死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目:A組，8條；B組，21條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS):
[0052]RPS=100x(l 一免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)
[0053]根據(jù)此公式算出P796疫苗的免疫保護效率為62%。因此，重組TonB依賴型外膜受體P796作為疫苗能夠有效地保護大菱鲆抵御熒光假單胞菌侵染。
【權(quán)利要求】
1.一種熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體，其特征在于:外膜受體為序列表SEQ IDN0.1中的氨基酸序列所示。
2.按權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體的制備方法，其特征在于:以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物與載體pET259連接，獲得質(zhì)粒PEP796，質(zhì)粒pEP796轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)即可表達含序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸的重組蛋白。
3.按權(quán)利要求2所述的熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體的制備方法，其特征在于:所述引物為 Fl:5’ -GATATCATGTACCGAGACAAGGTCAAGC-3’ 和 Rl:5’ -GATATCCCAGTTGTAAGACACCGTACC-3，。
4.按權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體的應(yīng)用，其特征在于:所述受體的重組蛋白用于制備疫苗中的應(yīng)用。
5.按權(quán)利要求4所述的熒光假單胞菌TonB依賴型外膜受體的應(yīng)用，其特征在于:所述受體的重組蛋白用于制備抵御熒光假單胞菌的疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK103910785SQ201410140163
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】孫黎, 張書仁 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所