鑒定脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)相互作用的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供使用Fhit基因診斷、預后和治療癌癥相關(guān)疾患的方法和組合物。
【專利說明】鑒定脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)相互作用的方法及其用途
[0001]本申請是申請日為2008年10月27日、申請?zhí)枮?00880119206.9的同名申請的
分案申請。
[0002]對相關(guān)申請的交叉引用和關(guān)于資助研究的聲明
[0003]本發(fā)明要求2007年10月26日提交的臨時專利申請序列第60/000，480號的權(quán)益。本發(fā)明是在NCI資助號CA77738和CA78890的政府支持下進行的。政府在本發(fā)明中享有某些權(quán)利。
[0004]發(fā)明背景
[0005]HlIT基因包括染色體3pl4.2的最具活性的常見的脆性位點(1，2)。由于等位基因丟失、基因組重排、啟動子超甲基化或其組合，F(xiàn)hit表達在大多數(shù)類型的人腫瘤的大部分中是丟失的或降低的(3，4) Jhit敲除小鼠顯示對癌癥發(fā)展的增加的易感性(5，6)，并且HlIT基因治療在暴露于致癌原的Fhit-缺陷小鼠中預防腫瘤(7，8)。癌細胞中通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Fhit恢復在體外幾乎沒有作用，除非將細胞暴露于應激，包括體內(nèi)裸小鼠環(huán)境應激(9);病毒介導的Fhit恢復，一種同時提供應激和Fhit表達的過程，在體內(nèi)遏制腫瘤發(fā)生并在體外觸發(fā)許多類型的惡性細胞的凋亡(10 - 13)，所述惡性細胞包括肺癌細胞。
[0006]在肺增生病變中,DNA損傷關(guān)卡基因(checkpoint gene)已經(jīng)被激活,導致關(guān)卡蛋白中突變的選擇和腫瘤進展(14、15)。HlIT內(nèi)FRA3B處的DNA改變的證據(jù)伴隨增生和關(guān)卡激活。在其他抑制基因的表達發(fā)生病理變化或改變之前，F(xiàn)HIT等位基因的丟失發(fā)生于吸煙者的正常外觀的支氣管上皮細胞中(16 - 18)。
[0007]Fhit表達受到暴露于DNA損傷劑的下調(diào)(19)，并且Fhit在對此類劑的應答中起作用(20，21)，而Fhit-缺陷細胞逃避凋亡并積累突變。
[0008]雖然Fhit表達在幾種實驗模型中通過涉及外在和內(nèi)在凋亡途徑的半胱天冬酶(caspase)依賴性機制觸發(fā)凋亡，但是關(guān)于此過程的早期事件以及Fhit丟失如何參與腫瘤啟動仍知之甚少。
[0009]因此，存在對在需要其的受治療者中改變FHIT表達的方法的需要。還存在對可用于在需要其的受治療者中改變FHIT表達的組合物的需要。
[0010]發(fā)明概述
[0011]在廣泛的方面，提供了鑒定直接與Fhit相互作用以影響終點為凋亡的下游信號途徑的蛋白的方法。在一個實施方案中，在用AdFHIT-His6病毒感染肺癌細胞之后，細胞內(nèi)的蛋白被化學交聯(lián)。鑒定并表征了與Fhit連接的蛋白和受它們影響的途徑。
[0012]在另一廣泛的方面，本文提供了診斷受治療者是否具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展所述疾患的風險的方法，該方法包括測量受治療者的測試樣品中至少脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因的水平，其中相對于對照樣品中對應的Fhit基因產(chǎn)物的水平，測試樣品中所述Fhit基因產(chǎn)物的水平的改變指示受治療者具有癌癥相關(guān)疾患或處于發(fā)展所述疾患的風險。
[0013]當根據(jù)附圖理解下列優(yōu)選實施方案詳述時，本發(fā)明的各種目標和優(yōu)點將對本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。
[0014]附圖簡述[0015]本專利或申請文件含有至少一幅彩色附圖。含有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞嫉目截悓⒃谔岢稣埱蟛⒅Ц侗匾馁M用后由美國專利商標局提供。
[0016]圖1A-1H-Fhit蛋白在胞質(zhì)溶膠和線粒體中的亞細胞定位。
[0017]圖1A，以抗Fhit血清對用PonA處理48h的H1299細胞(Dl)進行免疫熒光顯微術(shù)；使用異硫氰酸熒光素(綠色)_軛合的抗兔免疫球蛋白(IgG)檢測Fhit染色；鑒定線粒體的Mito-Tracker Red染色顯示與Fhit的部分共定位。第四個圖(右下方)中的黃色顯示共定位點。
[0018]圖1B，以penta-His抗體進行的A549AdFHIT(左)或AdFHIT-His6-感染的細胞(右)的免疫電子顯微術(shù)顯示Fhit的線粒體定位(右)；以AdFHIT感染的A549細胞充當對照并顯示僅有少量分散的粒狀物(左圖)。
[0019]圖1C，使用抗Fhit對AdFHIT-感染的A549亞細胞級分的免疫印跡分析表明胞質(zhì)溶膠、膜、細胞骨架和線粒體中的Fhit蛋白分布。
[0020]圖1D，對用碳酸鈉(圖1E)和濃度增加的毛地黃皂苷(圖1F)處理后AdFHIT-His6感染的A549細胞的線粒體蛋白的免疫印跡分析表明，F(xiàn)hit主要分布于線粒體基質(zhì)中；用Fhit和CoxIV抗血清探測濾膜；圖1F中的泳道代表用0%、0.10%,0.15%和0.20%毛地黃皂苷處理后的上清液。
[0021]圖1G，使用抗Fhit對MKN74/E4和MKN74/A116細胞(穩(wěn)定表達外源Fhit)，和圖1H，HCTl 16 (內(nèi)源Fhit陽性克隆癌細胞系)的亞細胞級分的免疫印跡分析證實了 Fhit的線粒體定位；GAPDH和CoxIV抗血清充當對照。
[0022]圖2A-F-外源和內(nèi)源Fhit與內(nèi)源Hsp60、HsplO和Fdxr蛋白形成復合體。將用重組Fhit-His6蛋白分離的蛋白復合體在聚丙烯酰胺凝膠上分離，并用針對Hsp60(圖2A)、HsplO (圖2B)和Fdxr (圖2C)的抗血清探測；在后一圖中，其于線粒體分離后制備，顯示Fhit在線粒體中以時間依賴性方式募集Fdxr。以有或無DSP下用AdFHIT-His6感染A549細胞后分離的蛋白對濾膜進行上樣。
[0023]圖2D，用AdFHIT感染A549細胞后以抗Hsp60進行的免疫共沉淀；以Hsp60、Fhit和HsplO抗血清探測濾膜。
[0024]圖2E，用V5標簽的n)XR基因和HlIT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞；用抗V5進行免疫沉淀并用Fdxr和Fhit抗血清進行檢測。
[0025]圖2F，來自DSP處理的Fhit陽性HCT116細胞的內(nèi)源相互作用物蛋白(Fdxr和HsplO)的免疫沉淀和免疫印跡檢測。以針對每種靶蛋白的抗血清探測濾膜。內(nèi)源Fhit與HsplO和Fdxr共沉淀。
[0026]圖3A-D_Hsp60/Hspl0的敲低降低了線粒體中的Fhit水平。
[0027]圖3A，使用H6抗體對AdFHIT-His6感染的A549細胞的亞細胞級分(胞質(zhì)溶膠和線粒體)進行的鎳-H6下拉(pull down)實驗；將溶胞產(chǎn)物與鎳珠孵育以分離DSP交聯(lián)的Fhit-His6蛋白復合體并上樣至4 一 20%聚丙烯酰胺凝膠。感染后24h, Hsp60_Fhit復合體存在于兩個區(qū)室中；感染后48h，復合體在兩個區(qū)室中同樣是可檢測的，并且Fhit復合體蛋白的增加顯示與AdFHIT-His6感染后48h Fhit蛋白的增加相關(guān)，線粒體中有輕微增加(對輸入樣品進行光密度法分析)。
[0028] 圖3B，對 Hsp60/Hspl0 沉默 72h 后 Fhit 陽性 Dl 細胞中的 Hsp60、HsplO, Fhit 和GAPDH的免疫印跡分析，其顯示CHX追蹤(30 μ g/ml) I 一 12h后的Fhit、Hsp60和HsplO水平。
[0029]圖3C,用 Hsp60 和 HsplOsiRNA 轉(zhuǎn)染后 72h 和 m.0.1.1 的 AdFHIT 感染后 24h,使用Hsp60、HsplO, Fhit, GAPDH和CoxIV抗血清，對A549細胞的胞質(zhì)溶膠/線粒體蛋白級分的免疫印跡分析。Hsp60/10沉默未顯示影響Fhit胞質(zhì)溶膠水平,但與線粒體級分中Fhit的下降有關(guān)。零亂(Scrambled) (Scr) siRNA用作對照。
[0030]圖3D，“內(nèi)源"Fhit復合體蛋白的亞細胞分級和免疫沉淀。將有和無過氧化物處理的PonA-誘導的Dl和El細胞分級為胞質(zhì)溶膠和線粒體，并評估誘導后48h亞細胞級分中Fhit和相互作用物(左側(cè))的存在；每個泳道上樣25 μ g蛋白。內(nèi)源Hsp60共沉淀Fhit和Fdxr0
[0031]圖4A-F_Fhit表達誘導用過氧化物處理細胞后胞內(nèi)ROS產(chǎn)生。
[0032]圖4A，在有和無5小時H2O2處理下，用HlIT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h的A549細胞中ROS評估的熒光激活細胞分選儀(FACS)分析?？蛰d體轉(zhuǎn)染的細胞充當對照。根據(jù)氫化乙啡啶(hydroethidine)被O2氧化產(chǎn)生的乙啡啶的熒光確定胞內(nèi)超氧化物。M2指ROS陽性細胞的分數(shù)。
[0033]圖4B，通過Dl和El細胞中氫化乙啡啶氧化產(chǎn)生的熒光進行ROS評估的FACS分析；PonA處理后48h，將細胞用0.5和1.0mM H2O2處理5h，并測量氧化應激；％陽性指指示ROS的熒光細胞的分數(shù)。重復這些實驗三次，得到了相似的結(jié)果。
[0034]圖4C，應激條件下H1299Fhit表達細胞(Dl)中增加的綠色熒光DCF信號。Fhit誘導后48h和H2O2處理El和Dl細胞5小時后，將細胞與2’，7’ - 二氯二氫熒光素二乙酸酯孵育，2’，7’ - 二氯二氫熒光素二乙酸酯是在ROS存在下可被氧化為高度綠色熒光染料DCF的ROS指示物(放大率x40)。
[0035]圖4D，對El和Dl細胞進行MTS細胞存活測定。將細胞用PonA處理48h，然后用濃度增加的H2O2 (0.125,0.25和0.5mM)處理4h。在H2O2處理后24h進行分析。柱報告四個實驗的平均值土S.E。每個點測量四個重復，并計算標準偏差；認為p〈0.05是顯著的。
[0036]圖4E，氧化應激處理后48h，Dl和El細胞周期動力學的FACS分析。將細胞用PonA處理48h，然后用濃度增加的H2O2 (0.25和0.5mM)處理4h。在H2O2處理后48h進行分析。所有實驗以三個重復進行兩次。
[0037]圖4F，5mM PonA刺激和所示濃度下的5小時H2O2處理后H1299/D1和H1299/E1細胞的集落形成測定。
[0038]圖5A-H.-Fhit病毒轉(zhuǎn)導觸發(fā)的凋亡可通過其與Fdxr的相互作用介導。
[0039]圖5A，使用針對Fdxr、Fhit和GAPDH的抗血清的免疫印跡分析。蛋白是在用PonA處理后48h從El (對照)和Dl細胞提取的。
[0040]圖5B，用25 μ M蛋白酶體抑制劑MG132進行4小時處理后，Dl和El細胞中Fdxr表達的免疫印跡分析。GAPDH檢測顯示相等的蛋白上樣。
[0041]圖5C，Dl細胞和El細胞中Fdxr、Fhit和GAPDH的免疫印跡分析顯示CHX追蹤(30 μ g/ml) 4 - 12h后的Fdxr水平，所述Dl細胞表達Fhit?；贕APDH水平的光密度法顯示Fhit存在下增強的Fdxr穩(wěn)定性。
[0042]圖5D，用AdFHIT m.ο.1.50和100感染后FDXR+/+/+和FDXR+/+細胞周期動力學的FACS分析。實驗在感染后48h進行，并重復三次，得到相似結(jié)果。AdGFP-感染細胞的譜圖與非感染的細胞的譜圖(未顯示)相似。
[0043]圖5E，顯示用 AdFHIT m.0.1.50 和 100 感染 FDXR+/+/+ 和 FDXR+& 后 Fdxr、Fhit 和GAPDH的表達的免疫印跡分析。蛋白質(zhì)在感染后48h提取。
[0044]圖5F，AdFHIT m.0.1.50后48h的FDXR表達的實時RT-PCR分析。將PCR產(chǎn)物對GADPH和肌動蛋白表達進行標準化，并且每個點重復四次；對照和Fhit陽性樣品之間的差異不顯著。
[0045]圖5G,半胱天冬酶3和Parpl激活。使用Fhit、半胱天冬酶3、Parpl抗血清,對m.ο.1.50的AdFHIT和AdGFP感染后48、72和96h的HCT116FDXR+/+/+細胞的總細胞溶胞產(chǎn)物的免疫印跡分析。GAPDH和CoxIV充當內(nèi)部蛋白標志物。
[0046]圖5H，使用Fhit和細胞色素c抗血清，對m.ο.1.50的AdFHIT和AdGFP感染后48,72和96h的HCT116FDXR+/+/+細胞的胞質(zhì)溶膠/線粒體級分的免疫印跡分析。GAPDH和β-肌動蛋白充當內(nèi)部蛋白標志物。
[0047]圖6A-E_Fhit增強癌細胞對紫杉醇和順鉬的敏感性。
[0048]對El和Dl細胞進行MTS測定。將細胞用PonA處理48h，然后用紫杉醇(50 —500ng/ml)(圖6A)或順鉬(0.05 — 0.2mM)(圖6B)處理24或48h。條報告四個實驗的平均值土S.E。每個點測量四個重復并計算標準偏差；圖6A和圖6B中方括號旁邊的星號指示Dl和El細胞對藥物應答的統(tǒng)計學顯著的差異，p〈0.05。
[0049]圖6C和圖6D，圖顯示El和Dl細胞的流式細胞術(shù)分析的代表性結(jié)果。將細胞用PonA處理48h，然后用紫杉醇(50 — 500ng/ml)(圖6C)或順鉬(0.05 — 0.2mM)(圖6D)處理。每個數(shù)據(jù)點在24、48和72h測量三個重復(顯示了 48h的數(shù)據(jù))。
[0050]圖6E，半胱天冬酶3和Parpl切割:使用Fhit、半胱天冬酶3和Parpl抗血清，對用紫杉醇(50和100ng/ml)或順鉬(0.05和0.1mM)處理48h后PonA誘導的Dl細胞的總細胞溶胞產(chǎn)物的免疫印跡分析。GAPDH充當上樣對照。
[0051]圖7.表1通過質(zhì)譜法分離的候選Fhit蛋白配偶體。在A549AdFHIT-H6感染的細胞樣品中選擇性捕獲的蛋白質(zhì)。列出了鑒定的妝的氣基酸序列、Mascot評分和蛋白質(zhì)序列
覆蓋率。
[0052]圖8A-8C.Ad-His6 生物活性與 AdFHIT 相當。
[0053]圖8A，用Ad_His6、M0I20感染的A549細胞的蛋白質(zhì)印跡分析。通過抗pentaHis和抗Fhit血清檢測Fhit-His蛋白。Ad ΠΠΤ和Ad-His6 二者均攜帶通過ΠΠΤ下游的內(nèi)部核糖體進入序列受到CMV5啟動子調(diào)控的GFP cDNA。使用Y -微管蛋白對樣品上樣進行標準化。
[0054] 圖8B，用Ad-His6、M0I15感染后96hr的A549細胞的流式細胞術(shù)分析。上圖指示感染細胞的subGlDNA含量(實驗重復三次；subGl級分的平均值:Ad FHIT為22%+/_4.3，Ad-His6為29%+/-5 ;差異不是統(tǒng)計學顯著的；下圖顯示具有指示凋亡的成熟半胱天冬酶-3的細胞的百分比。用Ad-His6感染的A549細胞中細胞死亡的程度與在用Ad FHIT感染后獲得的結(jié)果相當。
[0055]圖8C，F(xiàn)hit_His6的體內(nèi)交聯(lián)。His6下拉和交聯(lián)逆轉(zhuǎn)條件后的細胞溶胞產(chǎn)物通過4-20%梯度SDS-PAGE分離的凝膠的銀染色。內(nèi)部陰性對照包括Ad HlIT感染的細胞(交聯(lián)的，CL)和Ad-His6感染的細胞(未交聯(lián)的，NT)的His6下拉。
[0056] 圖9A-9F.通過納米孔(nanobore) LC-MS/MS鑒定的候選Fhit蛋白配偶體的初步驗證。顯示了 AdFHIT_His6和對照樣品的選擇離子色譜圖(Selected ion chromatograms,SIC)。六個SIC對報告了下列六個m/z值的離子電流:1)672.8 (保留時間為30min的峰鑒定為屬于Hsp60的胰蛋白酶肽TVIIEQSWGSPK[SEQ ID NO: 5] )，2) 685.4 (保留時間為32min的峰鑒定為屬于Aldh2的胰蛋白酶肽LGPALATGNVVVMK[SEQ ID NO: 22] )，3) 617.3 (保留時間為39min的峰鑒定為屬于Mdh的胰蛋白酶肽IFGVTTLDIVR[SEQ ID NO: 10])，4) 658.4 (保留時間為26min的峰鑒定為屬于HsplO的胰蛋白酶肽VLQATVVAVGSGSK[SEQ ID NO: 19])，
5)551.7(保留時間為28min的峰鑒定為屬于Etfb的胰蛋白酶肽EIDGGLETLR[SEQ IDNO: 15]),6) 598.3 (保留時間為23min的峰鑒定為屬于Fdxr的胰蛋白酶肽FGVAPDHPEVK[SEQID N0:23])。用紅色箭頭指示的感興趣的肽專一地存在于Ad-His6樣品中。
[0057]圖10.表2，？11^在^(町4胃癌細胞中誘導ROS產(chǎn)生。ROS評估使用攜帶p53突變等位基因并表達外源Fhit的人胃癌細胞系MKN74A116進行；Fhit陰性MKN74E4細胞用作對照。為了誘導ROS產(chǎn)生，我們用0.5、1.0和2.0mM H2O2處理MKN74細胞5hr。結(jié)果表明與對照相比，表達外源Fhit的細胞中有顯著更高的ROS產(chǎn)生率；2mM H2O2處理后，在Fhit-表達細胞中觀察到毒性。數(shù)字報告四個實驗的平均值土S.E.。
[0058]優(yōu)選實施方案詳述
[0059]應理解，上面的一般描述和下面的詳細描述僅是示例性的和解釋性的，并不意圖限制本文的教導的范圍。在本申請中，除非另外指明，否則使用單數(shù)時包括復數(shù)。
[0060]在權(quán)利要求和/或說明書中，當與術(shù)語“包含(comprising)”聯(lián)合使用時，詞“一種(a)”或“一種(an)”的使用可意指“一種(one) ”，但其也與“一種或多種”、“至少一種”
和“一種或多于一種” 一致。
[0061]另外，“包含(comprise) ”、“含有(contain) ”和“包括(include) ”或這些根詞的修飾形式，例如但不限于“包含(comprises) ”、“含有(contained) ”和“包括(including)”,并不意圖是限制性的。術(shù)語“和/或”意指前后的術(shù)語可以是一起的或單獨的。出于例證目的，但不是作為限制，“X和/或Y”可意指“X”或“Y”或“X和Y”。
[0062]如本文所用的術(shù)語“其組合”指在該術(shù)語之前所列的條目的所有排列和組合。例如，“A、B、C或其組合”意圖包括以下的至少一種:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及，如果在具體環(huán)境中順序是重要的，還包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。
[0063]如本文可交換使用的，“基因產(chǎn)物”、“DNA”和“基因”在本文可交換使用。
[0064]本文可使用以下縮寫詞:GAPDH，甘油醛_3_磷酸脫氫酶；DSP，二硫代二(琥珀酰亞胺丙酸酯);LC-MS/MS，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；Fdxr，鐵氧還蛋白還原酶；PonA，松留酮A ；m.ο.1.,感染復數(shù)；R0S,活性氧簇(reactive oxygen species) ;FU, 5-氟尿嘧卩定；DCFH_DA,二氯熒光素二乙酸酯；DCF，2’，7’_ 二氯熒光素；CHX，環(huán)己酰亞胺；siRNA，小干擾RNA ；RT，反轉(zhuǎn)錄酶；MTS，3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑。
[0065]本文使用的各部分的標題僅是為了組織目的，而不應以任何方式視為限制所描述的主題。本申請中引用的所有文獻和相似材料，包括專利、專利申請、文章、專著、論文和互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)頁，出于任何目的而通過引用明確地整體并入。如果所并入的文獻和相似材料中的一種或多種以與本申請中的術(shù)語定義矛盾的方式定義或使用了該術(shù)語，則以本申請為準。
[0066]Fhit蛋白在大多數(shù)癌癥中是丟失的，其恢復抑制腫瘤發(fā)生，并且病毒介導的ΠΠΤ基因治療在臨窗前模型中誘導凋亡并抑制腫瘤。使用蛋白質(zhì)交聯(lián)和蛋白質(zhì)組學方法表征參與觸發(fā)Fhit-介導的凋亡的Fhit蛋白復合體。該復合體包括介導Fhit穩(wěn)定性并可影響向線粒體的輸入的Hsp60和HsplO,在線粒體中，該復合體與鐵氧還蛋白還原酶相互作用，鐵氧還蛋白還原酶負責經(jīng)由鐵氧還蛋白將電子從NADPH轉(zhuǎn)移給細胞色素P450。病毒介導的Fhit恢復增加胞內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)生，然后是氧化應激條件下肺癌細胞凋亡的增加；相反，F(xiàn)hit-陰性細胞逃避了凋亡，其攜帶可促成增加的突變率的嚴重氧化型DNA損傷。Fhit相互作用蛋白的表征鑒定了 Fhit-介導的凋亡途徑的直接效應物，由于Fhit的丟失，該途徑在大多數(shù)癌癥中是丟失的。
[0067]對Fhit-相互作用蛋白的更早檢索指出了幾種候選蛋白，其中沒有一個可通過免疫共沉淀實驗被我們確認為相互作用物，這些候選蛋白包括Ubc9、α -微管蛋白和Mdm2(35 - 37)。為了重新著手于Fhit蛋白相互作用物的問題，使用了如下:用于交聯(lián)后Fhit復合體純化的腺病毒轉(zhuǎn)導的Fhit-His6，并鑒定了 Fhit-連接蛋白、Hsp60、HsplO和Fdxr ;這些蛋白的亞細胞定位暗示線粒體可能是Fhit活性的焦點。Hsp “應激蛋白”作為分子伴侶蛋白執(zhí)行諸如蛋白易位、折疊和裝配的功能(38)。AdFHIT感染后Fhit與Hsp60/HsplO相互作用的發(fā)現(xiàn)暗示，在激活凋亡途徑之前，Hsp復合體對Fhit穩(wěn)定性以及可能地對于它的正確折疊以輸入到線粒體，可能是重要的，我們通過敲低AdFHIT-感染的肺癌細胞中的Hsp60、Hspl0或二者表達研究了這一暗示；CHX追蹤后評估了表達可誘導的Fhit的肺癌細胞系H1299D1細胞中的Fhit穩(wěn)定性。敲低Hsp60和HsplO 二者后，分離的線粒體中的Fhit蛋白降低，強化了 Fhit-Hsp60/10相互作用參與Fhit穩(wěn)定性和/或正確折疊以輸入到線粒體的提議。
[0068]HCTl 16結(jié)腸癌細胞中FDXR基因的靶向破壞顯示其是存活必需的；基因拷貝數(shù)的降低造成對5-氟尿嘧啶-誘導的凋亡的敏感性的降低(29)，而FDXR是p53家族的靶基因
(30)。Fdxr的過表達使結(jié)腸癌細胞對H202、5-氟尿嘧啶和阿霉素-誘導的細胞死亡敏感，表明Fdxr通過在線粒體中產(chǎn)生氧化應激促成p53-介導的凋亡。因此，激活的p53部分是通過ROS誘導響應于細胞應激的凋亡，并且p53同時增加FDXR基因的轉(zhuǎn)錄，這通過增加ROS-誘導的凋亡依次增強了 P53功能(29，30)。
[0069]現(xiàn)在本文顯示了 Fhit在線粒體級分中的存在；當Fhit被過表達或Fhit-表達細胞受到應激時，F(xiàn)hit可保護Fdxr不受蛋白體降解，導致Fdxr蛋白水平的增加，這與ROS的產(chǎn)生有關(guān)并跟隨有凋亡。Fhit不影響FDXR轉(zhuǎn)錄水平但可影響蛋白的穩(wěn)定性。在缺乏Fhit和p53 二者的H1299細胞中，F(xiàn)dxr過表達增加對ROS-誘導的細胞死亡的敏感性，表達可誘導的Fhit或p53的H1299細胞對ROS-誘導的細胞死亡敏感；缺乏Fhit、p53或二者的癌細胞將缺乏增加Fdxr表達的方式，并將對氧化損傷更不敏感，并將存活。
[0070]Fhit在凋亡中通過與Fdxr相互作用的線粒體功能的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在延伸了在大多數(shù)癌癥中順序丟失的并參與對DNA損傷的應答的重要腫瘤抑制物Fhit和p53的功能平行物，并闡明它們的差異，p53充當轉(zhuǎn)錄水平的Fdxr調(diào)控物,而Fhit充當轉(zhuǎn)錄后Fdxr調(diào)控物。對Fhit抑制途徑的直接下游效應物的描繪將導致對可影響激活Fhit途徑的預防和治療策略的Fhit功能的機制研究。[0071]ROS產(chǎn)生對Fhit-介導的凋亡至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)強調(diào)了 Fhit丟失作為陰性預后因子在不同臨床環(huán)境中的重要性；例如，評估腫瘤發(fā)生前或腫瘤病癥中的Fhit狀態(tài)可預測對抗氧化劑治療的應答。
[0072]為了鑒定與Fhit相互作用以實現(xiàn)下游凋亡途徑的蛋白，本文中本發(fā)明人在肺癌細胞中于病毒介導的Fhit過表達后交聯(lián)了細胞內(nèi)的蛋白，并表征了與Fhit相關(guān)的蛋白和它們所影響的途徑。
[0073]結(jié)果
[0074]Fhit蛋白復合體的分離-為了鑒定Fhit-相互作用蛋白，我們產(chǎn)生了攜帶在其3’端用編碼His6表位標簽的序列修飾的ΠΠΤ cDNA的腺病毒(AdFHIT-His6)。A549細胞中表達的該標簽的Fhit蛋白的生物活性與野生型Fhit活性相當(圖8)。
[0075]對Fhit-誘導的凋亡易感的A549肺癌衍生細胞(10)用AdFHIT或AdFHIT-His6進行感染，并用DSP處理，DSP是橫穿 膜并于體內(nèi)固定復合體中的蛋白的交聯(lián)劑。裂解細胞，并用對His6表位標簽親和的鎳珠分離蛋白。用二硫蘇糖醇處理純化蛋白以切割DSP并使復合體解離，并通過胰蛋白酶消化；通過LC-MS/MS鑒定蛋白成分(圖7-表1和圖9)。
【權(quán)利要求】
1.一種能夠分離Fhit-His6的腺病毒， 該腺病毒包括攜帶FHIT-His6cDNA的腺病毒。
2.一種分離外源過表達的Fhit-His6的方法，該方法包括使用攜帶raiT-His6cDNA的腺病毒，其中通過His標簽分離所述Fhit-His6。
3.—種重組腺病毒，該重組腺病毒攜帶在其3’用編碼六組氨酸表位標簽的序列修飾的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit) FHIT cDNA (AdFHIT-His6)。
4.一種在至少一個細胞中介導凋亡過程的方法，該方法包括使所述細胞暴露于足以在所述細胞中介導所述凋亡過程的量的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因產(chǎn)物。
5.一種在細胞中誘導凋亡過程的方法，該方法包括使所述細胞暴露于足以在所述細胞中引起活性氧簇(ROS)產(chǎn)生的量的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因產(chǎn)物。
6.一種在至少一個細胞中介導凋亡過程的方法，該方法包括:使所述細胞暴露于足量的脆性組氨酸三聯(lián)體(Fhit)基因產(chǎn)物，以允許Fhit進入所述細胞中的線粒體，與所述細胞中的Fdxr蛋白相互作用并引起與ROS產(chǎn)生相關(guān)的Fdxr蛋白水平的增加,從而引起所述細胞中的凋亡過程的變化。
7.一種制備野生型FDXR(鐵氧還蛋白還原酶)cDNA的方法，該方法包括:使用引物序列 5，-CTgTTCCCAgCCATggCTTCgCgCTg-3’ (正向)[SEQ ID NO:28]和 5，-TCAgTggCCCAggAggCgCAgCATC-3’ [SEQ ID NO:29]進行PCR擴增；和亞克隆擴增產(chǎn)物至pcDNA3.l/V5_HisT0P0TA載體。
8.一種制備V5標簽的FDXR(鐵氧還蛋白還原酶)cDNA的方法，該方法包括:用引物序列:正向:5’-CTgTTCCCAgCCATggCTTCgCgCTg-3’ [SEQ ID NO: 30]，反向:5’-gTggCCCAggAggCgCAgCATC-3’ [SEQ ID NO: 31]進行 PCR 擴增；和亞克隆擴增產(chǎn)物至 pcDNA3.l/V5_HisT0P0TA載體。
9.一種產(chǎn)生重組腺病毒的方法,該方法包括:制備攜帶野生型ΠΠΤ cDNA的重組腺病毒(AdFHIT);和使用以下列寡核苷酸進行的PCR產(chǎn)生His標簽的HlIT cDNA:5’ -ACgTggATCCCTgTgAggACATgTCgTTCAgATTTggC-3’(正向)[SEQ ID NO: 26]，和 5’-TTgTggATCCTTATCAgTgATggTgATggTgATgCgATCCTCTCTgAAAgTAgACCCgCAg-3’ [SEQ ID NO:27]。
10.一種在癌癥細胞中觸發(fā)凋亡的方法，該方法包括恢復所述癌癥細胞中的Fhit蛋白的表達。
【文檔編號】C12N15/861GK103898069SQ201410137410
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2008年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2007年10月26日
【發(fā)明者】C·M·克羅斯, F·特拉帕索 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會