一株高產乳酸菌及其發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產乳酸菌，為蒙氏腸球菌（Enterococcus?mundtii）HNMD-25，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC--NO.8699。本發(fā)明還公開了所述高產乳酸菌在發(fā)酵鈣源制備乳酸鈣中的應用及一種利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，本發(fā)明提供的乳酸鈣制備方法，蛋殼利用率高，達到77.98%，每1kg蛋殼可制備約2.5kg的五水乳酸鈣；葡萄糖轉化率高，最高可達79.3%，優(yōu)于工業(yè)常用菌種的葡萄糖轉化率；乳酸鈣純度高，發(fā)酵產物經精制，乳酸鈣純度可達到99%以上。
【專利說明】一株高產乳酸菌及其發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一株高產乳酸的乳酸菌及其發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣的方法。
【背景技術】
[0002]腸 球菌(Enterococcus)是自然界及人和動物體內廣泛分布的革蘭氏陽性球菌，蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)是一種多被報道為產細菌素的腸球菌,能殺滅或抑制一些病原菌的生長，其中Enterococcus mundtii ST4SA已被列為國內保藏的益生菌菌種，蒙氏腸球菌產抗菌素和抗病毒肽的報道非常常見，有報道用蒙氏腸球菌Enterococcusmundtii ST4SA和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum423以嬰兒奶粉配方為基質作為益生菌。腸球菌具有產乳酸的能力，但目前尚無利用腸球菌發(fā)酵制備乳酸的報道。
[0003]近年來，蛋殼的綜合利用研究在不斷深入。將蛋殼的鈣轉化成易吸收的有機鈣是蛋殼綜合利用的一個重要方面。其中乳酸鈣因其具有鈣含量高、溶解度較大、吸收率高、安全性高、價格合理等優(yōu)點而備受關注。在目前的研究中，蛋殼制備乳酸鈣主要采用化學方法，研究較多的為煅燒法，煅燒法耗能大，成本高，煅燒產生大量的二氧化碳和粉塵，對環(huán)境造成了污染。水熱法和直接中和法避免了高溫煅燒蛋殼所造成的環(huán)境污染，但這兩種方法需大量購買乳酸，成本較高。微生物法制備乳酸鈣是一個可以減少污染且增加經濟效益降低成本的有效途徑，目前還沒有用微生物發(fā)酵的方法將蛋殼直接制備成乳酸鈣的文獻報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的第一個目的是提供一株高產乳酸菌。
[0005]本發(fā)明所提供的高產乳酸菌為蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii),命名為HNMD-25，于2014年I月9日送交位于中國科學院微生物研究所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCC N0.8699。
[0006]本發(fā)明所提供的高產乳酸菌分離自長期深埋的廢棄蛋殼土樣中。
[0007]本發(fā)明所提供的高產乳酸菌獲得方法為:
[0008](1)采樣。樣品采自蛋品加工場地長期深埋蛋殼的土壤中。
[0009](2)分離初篩。采用MRS培養(yǎng)基為底物，并進行厭氧培養(yǎng)，在MRS培養(yǎng)基上反復劃線分離純化，觀察菌落形態(tài)，選取針尖大小的乳白色透明、濕潤且具有光澤的菌落，進一步用顯微鏡鏡檢觀察菌體形態(tài)，篩選出革蘭氏陽性小球菌X株繼續(xù)進行劃線分離，分別獲得純培養(yǎng)。
[0010](3)復篩。在MC培養(yǎng)基上點樣,挑選產乳酸并形成溶鈣圈的菌株。
[0011](4)誘變及高產乳酸菌株的獲得。通過紫外(UV)和亞硝基胍(NTG)誘變并以MC培養(yǎng)基中的溶鈣圈為標準，得到乳酸高產菌株:將培養(yǎng)18_24h后的菌液離心收集菌體并用無菌水洗漆幾次后加無菌水制成菌懸液，以0.3mg/mL加入NTG,于搖床上振蕩處理40min,多次離心洗滌菌體，并制成菌懸液，取0.1mL菌液涂布于MRS固體平板并厭氧培養(yǎng)18_24h后，將平板置于20W紫外燈下誘變，照射距離為30cm，1.5min,繼續(xù)厭氧培養(yǎng)18_24h后取菌體在MC平板上點樣，選取溶鈣圈大于對照的菌落，進行傳代，獲得穩(wěn)定的純培養(yǎng)菌株，將其命名為 Enterococcus mundtii HNMD-25。
[0012](5)鑒定。生理生化性質鑒定。糖發(fā)酵試驗顯示，菌株可以利用蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、棉籽糖、水楊苷、七葉苷、山梨醇發(fā)酵產酸，不能利用纖維二糖，能部分利用松三糖和蜜二糖；石蕊牛奶試驗、乙酰甲基甲醇V-P試驗、甲基紅(M.R.)試驗、檸檬酸鹽試驗顯示為陽性，過氧化氫酶試驗，淀粉水解試驗，酪素水解試驗，明膠液化試驗，厭氧硝酸鹽產氣試驗，硫化氫產生試驗，吲哚試驗等各生化性質均顯示陰性；耐溫度、酸堿、鹽性試驗顯示在43°C下仍能生長，在低鹽和偏酸性環(huán)境下均能生長，但在10%的較高鹽濃度和pH4.3的較酸性環(huán)境不再生長。
[0013]菌株16S rDNA序列鑒定。采用CTAB法提取菌體總DNA并進行16S PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳純化后切膠測序，將序列與GenBank中核酸數(shù)據(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast)進行blast比對,與一株蒙氏腸球菌ATCC43186的同源性達到99%,結合生理生化性質結果與伯杰細菌鑒定手冊、常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊與乳酸細菌分離鑒定及實驗方法等判斷，最終確認分離獲得的菌株為蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)。
[0014](6)產乳酸能力。采用搖床液體培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵液中的乳酸含量可達60.375-72.064g/L，葡萄糖轉化率(被發(fā)酵的葡萄糖占葡萄糖總量的比例)為66.4-79.3%。
[0015]本發(fā)明的另一個目的，是提供所述的高產乳酸菌在發(fā)酵鈣源制備乳酸鈣中的應用，尤其是在發(fā)酵蛋殼制備乳酸鈣中的應用。
[0016]本發(fā)明進一步提供了一種利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，該方法是向含有葡萄糖和蛋殼粉的培養(yǎng)基中接種權利要求1所述的乳酸菌，進行發(fā)酵，然后精制分離乳酸鈣。
[0017]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中蛋殼粉和葡萄糖的重量比為0.2-1.5: I。
[0018]最佳的，所述培養(yǎng)基中蛋殼粉和葡萄糖的重量比為0.6: I。
[0019]進一步優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基由下述重量配比的成分組成:
[0020]蛋白胨0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母提取物1%，葡萄糖10%，蛋殼粉6%，CaCl20.008%,MgSO40.192%, K2HPO40.04%, KH2PO40.04%, NaHCO30.4%, NaCl0.08%，蒸餾水為余量。
[0021]優(yōu)選的，每100g培養(yǎng)基中接種IO5-1O8Cfu的乳酸菌。
[0022]優(yōu)選的，在溫度為32-37°C，搖床速度為150_200r/min的條件下發(fā)酵，發(fā)酵時間為60-84h。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:
[0024]I)本發(fā)明中分離獲得的乳酸菌，其自然發(fā)酵產乳酸性能優(yōu)于目前許多常見菌株；且菌株易培養(yǎng)，繁殖速度快，耐性強。
[0025]2)本發(fā)明提供的乳酸鈣制備方法，蛋殼利用率高，達到77.98%，每Ikg蛋殼可制備約2.5kg的五水乳酸鈣；葡萄糖轉化率高，最高可達79.3%，優(yōu)于工業(yè)常用菌種的葡萄糖轉化率；乳酸鈣純度高，發(fā)酵產物經精制，乳酸鈣純度可達到99%以上。
[0026]3)與中和法相比，本發(fā)明不需要購買乳酸，能節(jié)省成本，同時也克服了煅燒法制備蛋殼源乳酸鈣的環(huán)境污染和破壞蛋殼生物活性的問題?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0027]圖1為初篩得到的M-25菌株在100倍油鏡下鏡檢圖片。
[0028]圖2為復篩后M-25菌株在MC培養(yǎng)基中點樣形成的溶鈣圈。
[0029]圖3是實施例2中不同紫外照射時間對溶鈣圈大小的影響曲線圖。
[0030]圖4是實施例2中不同亞硝基胍處理時間對溶鈣圈大小的影響曲線圖。
[0031 ]圖5為誘變后得到的HNMD-25菌株16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0032]圖6 是 HNMD-25 菌株的 16S rDNA 序列。
[0033]圖7是發(fā)酵時間對乳酸鈣產量和殘留葡萄糖的影響曲線圖。
[0034]圖8是發(fā)酵時間對葡萄糖轉化率和蛋殼粉轉化率的影響。
【具體實施方式】
[0035]以下結合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0036]實施例1菌株的分離
[0037]分離培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基購自青島海博生物科技有限公司，成分含有:蛋白胨10.0g,牛肉粉8.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖20.0g,乙酸鈉5.0g,磷酸氫二鉀2.0g,檸檬酸氫二銨2.0g,吐溫801.0g,硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.04g,瓊脂14g，蒸餾水1000mL, pH值6.5±0.2 (25V)。使用時稱取本品66.2g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，121°C高壓滅菌15min,備用。
[0038]乳酸菌復篩驗證培養(yǎng)基MC培養(yǎng)基，購自青島海博生物科技公司，成分含有:大豆蛋白胨5.0g,牛肉浸粉3.0g,酵母浸粉3.0g,葡萄糖20.0g,乳糖20.0g,碳酸鈣10.0g,瓊脂15.0g,中性紅0.05g，蒸餾水1000mL, ρΗ6.0 (25。。)。使用時稱取本品80.0g，加熱煮沸溶解于1000mL蒸懼水中，121°C高壓滅菌15min,備用。
[0039]1.1菌株初步分離純化
[0040]分別取深埋蛋殼土壤樣品每份樣品約25g，加入225mL的生理鹽水稀釋，稀釋后的樣品分別在MRS培養(yǎng)基上分別作涂布平板和劃線兩種方式處理，在37°C下厭氧培養(yǎng)48h，觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。
[0041]將上一步培養(yǎng)的菌挑取長勢不同的典型單菌落進一步在MRS培養(yǎng)基上反復劃線分離培養(yǎng)，直到菌落形態(tài)一致，進一步觀察菌落形態(tài)。
[0042]將分離培養(yǎng)基中長勢不同的菌落取單菌落涂片并在載玻片上晾干固定后，采用革蘭氏染色法染色，并于顯微鏡下油鏡鏡檢觀察，驗證菌體形態(tài)與革蘭氏性質。圖1為分離得到的野生型菌株M-25的鏡檢結果。
[0043]1.2菌株復篩
[0044]將劃線分離出的菌種用接種針在MC瓊脂平板上點樣，每皿點樣5個點，于37°C下厭氧培養(yǎng)48h，觀察菌體顏色，觀察是否溶鈣并形成透明環(huán)，驗證菌種是否有溶鈣特性。圖2為經復篩后的野生型菌株M-25在MC培養(yǎng)基中點樣形成的溶鈣圈。
[0045]實施例2菌株的誘變及鑒定
[0046]2.1分別研究紫外誘變和亞硝基胍誘變對乳酸產酸能力的影響:
[0047]2.1.1 紫外(UV)誘變
[0048]取菌體斜面，加入無菌水IOmL制成懸液，分別取0.1mL涂布于8個平板上，在37°C下厭氧培養(yǎng)24h后置于20W紫外燈下誘變，照射距離為30cm，分別照射0.5min、l.0min,
1.5min、2.0min、2.5min、3min、3.5min，以未經紫外照射的平皿為對照(CK)，再以37°C厭氧培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)物于MC固體平板中點樣，于37°C下厭氧培養(yǎng)42h，用游標卡尺測量溶鈣圈的直徑，測3個溶鈣圈，取平均值，比較不同誘變時間的溶鈣圈大小。
[0049]結果:不同照射時間溶鈣圈大小結果如圖3,照射1.5min時溶鈣圈最大。
[0050]2.1.2亞硝基胍(NTG)誘變
[0051]取在37°C下，180r/min培養(yǎng)36h的菌液30mL, 6000r/min離心15min,收集菌體，用8%的無菌生理鹽水洗滌3次，再向菌體中加入適量的無菌水，振蕩，配制成濃度為IO8Cfu/ml的菌體懸浮液。將NTG加入菌懸液的三角瓶中，使其濃度為0.3mg/ml,以未添加NTG的菌體懸浮液為對照(CK)。將三角瓶置于37°C下180r/min的搖床上振蕩處理不同時間(20min、30min、40min、50min、60min、70min)后,用無菌生理鹽水多次離心洗漆菌體,取菌體沉淀,加入無菌生理鹽水搖勻，適當稀釋，取0.1ml菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上37°C厭氧培養(yǎng)48h后，用接種針在初篩MC固體平板上點樣，置于37°C下厭氧培養(yǎng)42h，比較不同作用時間的溶鈣圈大小。
[0052]結果:亞硝基胍不同處理時間溶鈣圈大小結果如圖4,處理40min時,溶鈣圈直徑最大。
[0053]2.1.3NTG 和 UV 復合誘變
[0054]將經NTG誘變處理不同時間(20min、30min、40min、50min、60min)多次離心洗漆后的菌懸液，取0.1ml菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上37°C厭氧培養(yǎng)24h后，置于紫外燈下不同時間(0.5min、l.0min、l.5min、2.0min、2.5min)照射,再將兩兩組合誘變的菌體在初篩MC固體培養(yǎng)基上點樣，置于37°C下厭氧培養(yǎng)42h，比較溶鈣圈大小。同時將菌株分別接入已裝IOOmL PYG培養(yǎng)基的250mL三角瓶中進行搖床培養(yǎng)，37°C，180r/min培養(yǎng)48h，測定菌株產乳酸含量。
[0055]結果:復合誘變采用亞硝基胍處理40min同時紫外照射1.5min時溶鈣圈直徑最大，同時搖瓶乳酸含量最高，最終菌種采用復合誘變菌，將菌種編號為HNMD-25。
[0056]2.2誘變菌株的生化性質鑒定
[0057]2.2.1糖發(fā)酵性質
[0058]實驗將測定的糖或醇類等碳水化合物按質量體積比0.5%加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分裝于含IOmL糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，糖發(fā)酵管成分為:牛肉膏5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸膏
5.0g,吐溫800.5mL，瓊脂1.5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL，蒸餾水lOOOmL，121°C高壓滅菌15min。分別用接種針挑取被鑒定菌株穿刺接種到滅菌后的碳水化合物培養(yǎng)基中37°C下160r/min振蕩培養(yǎng)24h。本試驗進行了以下糖的發(fā)酵試驗:蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、纖維二糖、蜜二糖、松三糖棉籽糖、水楊苷、七葉苷、山梨醇。結果:對纖維二糖不發(fā)酵呈陰性，對松三糖和蜜二糖呈現(xiàn)部分發(fā)酵，對其余糖均發(fā)酵成陽性。
[0059]2.2.2其余生化性質及耐性試驗
[0060]驗證其他的生理生化性質及耐酸堿耐鹽及耐溫度試驗。依據伯杰系統(tǒng)細菌學手冊，常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊和凌代文等(1999)的方法，主要進行以下的生化性質鑒定:過氧化氫酶試驗，淀粉水解試驗，石蕊牛奶試驗，酪素水解試驗，明膠液化試驗，乙酰甲基甲醇V-P試驗，甲基紅(M.R.)試驗，檸檬酸鹽試驗，厭氧硝酸鹽產氣試驗，硫化氫產生試驗，吲哚試驗。結果如下:
[0061]表1菌株生化性質結果
[0062]
【權利要求】
1.一株高產乳酸菌,為蒙氏腸球菌(Enterococcus mundtii)HNMD_25,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為:CGMCCN0.8699。
2.權利要求1所述的高產乳酸菌在發(fā)酵鈣源制備乳酸鈣中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述鈣源為蛋殼。
4.一種利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，其特征在于:向含有葡萄糖和蛋殼粉的培養(yǎng)基中接種權利要求1所述的高產乳酸菌，進行發(fā)酵，然后精制分離乳酸鈣。
5.根據權利要求4所述的利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中蛋殼粉和葡萄糖的重量比為0.2-1.5: 1。
6.根據權利要求5所述的利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中蛋殼粉和葡萄糖的重量比為0.6: 1。
7.根據權利要求6所述的利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基由下述重量配比的成分組成: 蛋白胨0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母提取物1%，葡萄糖10%，蛋殼粉6%，CaCl20.008%,MgSO40.192%, K2HPO40.04%, KH2PO40.04%, NaHCO30.4%, NaCl0.08%，蒸餾水為余量。
8.根據權利要求4-7任何一項所述的利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，其特征在于:每100g培養(yǎng)基中接種IO5-1O8Cfu的高產乳酸菌。
9.根據權利要求4-7任何一項所述的利用蛋殼制備乳酸鈣的方法，其特征在于:在溫度為32-37°C，搖床速度為150-200r/min的條件下發(fā)酵，發(fā)酵時間為60_84h。
【文檔編號】C12R1/46GK103898016SQ201410113319
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權日:2014年3月25日
【發(fā)明者】馬美湖, 鄧素楓, 金永國, 耿放 申請人:華中農業(yè)大學