肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒。該試劑盒及檢測方法是根據(jù)研究報道與肌萎縮側(cè)索硬化癥相關(guān)的致病基因，包括SOD1、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1位點，設(shè)計和合成各基因特異性引物，通過采集待測個體的標(biāo)本，運用RT-PCR技術(shù)，將得到RT-PCR產(chǎn)物進行測序分析，然后將樣本序列與正?；蛐蛄羞M行比對，確認(rèn)是否有致病突變。本發(fā)明能一次性檢測出致病基因蛋白編碼區(qū)（CDS）所有的致病突變位點，具有簡便快速，準(zhǔn)備可靠，特異性好，靈敏度高等優(yōu)點，可以同時檢出ALS病人和無癥狀患者。
【專利說明】肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]發(fā)明涉及一種遺傳性疾病的基因診斷試劑盒，更具體的說是一種肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是運動神經(jīng)元病(motor neuron disease, MND)的一個主要類型，由Charcot在1865年第一次描述。其病變主要累及脊髓前角細胞，腦干運動神經(jīng)核及錐體束，表現(xiàn)為上.下運動神經(jīng)元同時受損的特征，屬于慢性進行性變性疾病?；颊吲R床表現(xiàn)為上下運動神經(jīng)元同時受累的癥狀.受累肢體肌無力.肌萎縮.肌束震顫.痙攣.腱反射活躍.出現(xiàn)病理反射。延髓上運動神經(jīng)元受累可出現(xiàn)痙攣性構(gòu)音障礙，表現(xiàn)為言語緩慢.吃力.失真，并常伴有鼻音，下頜反射呈陽性；延髓下運動神經(jīng)元受累主要表現(xiàn)為舌肌無力萎縮.纖顫，發(fā)音無力和吞咽障礙。該病每年發(fā)病率約為疒3/105，多為中.老年起病，男性多于女性，多數(shù)患者在出現(xiàn)臨床癥狀后3飛年內(nèi)死于呼吸肌麻痹，給患者和家庭帶來沉重的生理和心理負擔(dān)。
[0005]ALS起病隱匿，疾病早期臨床癥狀不典型，該病的診斷尚存在一定困難。目前國內(nèi)外臨床上一直使用的為1998年世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟推薦的ALS診斷標(biāo)準(zhǔn)。2001年，中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會參照世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟的診斷標(biāo)準(zhǔn)提出了我國肌萎縮側(cè)索硬化癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，必須有以下神經(jīng)癥狀和體征:(1)下運動神經(jīng)元病孫特征(包括目前臨床表現(xiàn)正常，肌肉的肌電圖異常)；(2)上運動神經(jīng)元病損體征；(3)病情逐步發(fā)展。根據(jù)以上3個特征，又做以下3個程度的診斷:(1)確診ALS:全身四個區(qū)域(腦.頸.胸.腰骶神經(jīng)支配區(qū))的肌肉群，3個區(qū)域有上下運動神經(jīng)元病損的癥狀和體征；(2)擬診ALS:在2個區(qū)域有上下運動神經(jīng)元病損的癥狀和體征；(3)可能ALS:在一個區(qū)域有上下運動神經(jīng)元病損的癥狀和體征，或在2~3個區(qū)域有上運動神經(jīng)元病損癥狀和體征。根據(jù)情況選擇適當(dāng)?shù)妮o助檢查以排除其他疾病，如肌電圖，包括運動和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度和阻滯測定及胸鎖乳突肌檢查，脊髓和腦干MRI檢查和肌肉活檢。
[0006]根據(jù)這些診斷標(biāo)準(zhǔn)，典型的ALS診斷并不困難，但是用于臨床工作，這一標(biāo)準(zhǔn)顯得過于嚴(yán)格。ALS患者發(fā)病早期可以表現(xiàn)為單純下運動神經(jīng)元或上運動神經(jīng)元受累，也可以單純表現(xiàn)為延髓受累癥狀，當(dāng)病情發(fā)展至符合該確診標(biāo)準(zhǔn)時往往延誤了最佳治療時機。甚至約有25%的ALS患者死亡后仍然不能得到診斷，一些不典型的病例也不能得到及時得到診斷，尤其對ALS的臨床實驗中的患者的篩選非常不利。同時由于ALS神經(jīng)病變部位的隨機性，ALS的臨床表現(xiàn)也因人而異，因病變部位而不同，其癥狀和體征也難以與一些重要疾病鑒別，如椎管源性脊髓病.多灶性運動神經(jīng)病，進行性脊肌萎縮癥，青年良性遠端手肌萎縮癥等，單憑臨床癥狀極易誤診。[0007]迄今為止，ALS的病因及發(fā)病機制尚不明確，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，其中環(huán)境和遺傳因素被認(rèn)為是主要病因，尤其是遺傳因素。近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)了多個基因與ALS發(fā)病有關(guān)，包括SODl、FUS、VAPB、ANG、TARDBP.FIG4、OPTN、VCP、Sigmarl、CHMP2B、PFNl，并在離體和在體實驗中驗證了基因突變與發(fā)病密切相關(guān)。至今報道的各致病基因突變也有多種，如SODl基因已報道了 100多個不同的突變類型，TARDBP基因突變位點達到50多個，這些突變包括錯義突變.缺失，無義突變等，分布于各個外顯子。ALS疾病具有明顯的遺傳異質(zhì)性，不同種族和家系各種原發(fā)致病位點分布情況也不一樣。
[0008]針對肌萎縮側(cè)索硬化癥的早期臨床診斷較難，且存在一定的誤診和漏診，利用基因診斷技術(shù)將成為確診的有力手段，不僅可以對患者所患疾病做出判斷，也可以對表型正常但攜帶某種特定疾病基因或者特定疾病的易感性做出判斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))是近年發(fā)展起來體外擴增特異DNA片段的技術(shù)，由于其具有快速.靈敏.特異性強等特點，所以該技術(shù)很快用于實踐中。
[0009]傳統(tǒng)的等位基因特異性PCR簡便快速等優(yōu)點，但一次PCR只能鑒別一個突變位點。從中國專利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，以PCR為基礎(chǔ)發(fā)展起來的RT-PCR結(jié)合現(xiàn)在發(fā)展起來的基因測序技術(shù)，單管可以同時檢測到ALS疾病一個致病基因內(nèi)所有外顯子的多個突變，目前尚未見到這一技術(shù)進行ALS疾病分子診斷的專利和報道。本項專利即是利用RT-PCR結(jié)合基因測序技術(shù)，對ALS各相關(guān)致病基因蛋白編碼區(qū)域(CDS)的所有致病突變位點進行檢測，從而對ALS做出快速診斷。
[0010]

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的目的是提供一種肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)的基因診斷試劑盒及檢測方法，在于為肌萎縮側(cè)索硬化癥的相關(guān)致病基因提供一種簡便快速、準(zhǔn)確可靠、特異性好高的基因診斷方法，可應(yīng)用于患者、表型正常的攜帶者及產(chǎn)前基因診斷，從而為臨床診斷和早期的預(yù)防治療提供參考。
[0012]本發(fā)明依據(jù)國內(nèi)外對肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)的分子遺傳學(xué)研究的成果，發(fā)現(xiàn)了多個與 ALS 相關(guān)的致病基因，包括 SODl、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、FIG4、0PTN、VCP、Sigmar1、CHMP2B、PFN1，發(fā)病與上述基因的蛋白編碼區(qū)(⑶S)基因突變密切相關(guān)。利用RT-PCR方法結(jié)合基因測序技術(shù)，就能達到明確全面檢測該疾病的目的。
[0013]具體的技術(shù)方案是:
肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，包括有用于擴增如下11個基因的引物:S0D1、FUS、VAPB, ANG、TARDBP, FIG4、OPTN、VCP, Sigmarl、CHMP2B、PFNl。
[0014]優(yōu)選地，上述引物是如表1所示，引物在最終擴增體系中的濃度也列于表1。
[0015]表1優(yōu)選的引物序列以及引物在最終擴增體系中的濃度
【權(quán)利要求】
1.一種肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于，包括有用于擴增如下11個基因的引物:SODl、FUS、VAPB、ANG、TARDBP、F1G4、OPTN、VCP、S1gmarl、CHMP2B、PFNl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于，所述的引物如下所示:S0D1，SEQ 1D N0.1 ~2 ；FUS, SEQ 1D N0.3 ~4 ；VAPB, SEQ 1D N0.5 ~6 ;ANG, SEQ 1D N0.7 ~8 ；TARDBP, SEQ 1D N0.9 ~10 ；F1G4, SEQ 1D N0.11 ~12 ；0PTN, SEQ1D N0.13 ~14 ；VCP, SEQ 1D N0.15 ~16 ；S1gmarl, SEQ 1D N0.17 ~18 ；CHMP2B, SEQ 1DN0.19 ~20 ；PFN1, SEQ 1D N0.21 ~22。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:各個引物在擴增體系中的終濃度都是0.4 μ Mo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:所述試劑盒的擴增體系由以下組成=1OX緩沖液，5.0μ 1 ;10mM dNTP，1.0 μ 1 ;正向引物，2.0μ 1 ;反向引物，2.0μ 1 ;Taq 酶，0.2μ 1 ；dd H2O,補足至 50μ 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因診斷試劑盒，其特征在于:還包括有RNA提取試劑盒和/或反轉(zhuǎn)錄試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898211SQ201410082951
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】陳實, 黎寒 申請人:江蘇雄鳴醫(yī)藥科技有限公司