一種利用rna干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，它是利用中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒(CSBV)特異的、與病毒復(fù)制有關(guān)的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因，通過細(xì)菌原核誘導(dǎo)表達(dá)的方法合成dsRdRp，將該雙鏈RNA添加到飼料中飼喂給1-2日齡幼蟲。本發(fā)明的雙鏈RNA是用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的，成本低，并且對(duì)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的防治具有良好的治愈效果。飼喂?jié)舛葹?.5μg/ml?dsRdRp，幼蟲化蛹率和羽化率分別為70%、55%；比飼喂dsGFP的化蛹率（10%）和羽化率（0%）顯著高。
【專利說明】—種利用RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，屬于昆蟲病害防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]中華蜜蜂cerana cerana,簡(jiǎn)稱中蜂),是我國土生土長(zhǎng)的蜂種。蜜蜂很容易受到各種病害的威脅，病原物包括有病毒、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物等。目前，在蜜蜂中已發(fā)現(xiàn)的病毒病至少有22種。其中，囊狀幼蟲病是危害較嚴(yán)重的一種病毒病。中華蜜蜂囊狀幼蟲病最早是1972年在廣東省發(fā)現(xiàn)的，之后迅速蔓延全國。中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒感染蜜蜂幼蟲后，使其不能化蛹，大量的液體和病毒粒子聚集于病蟲體內(nèi)，且蟲體顏色由珍珠白色逐漸變?yōu)闇\黃色，在死亡之后，蜜蜂蟲體會(huì)逐漸變得干枯，形成一個(gè)暗褐色如龍船狀的鱗片，該病害對(duì)中華蜜蜂構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，往往會(huì)造成蜂群、甚至整個(gè)蜂場(chǎng)的蜜蜂死亡。
[0003]目前，尚無治愈蜜蜂囊狀病的方法和特效藥物，主要以預(yù)防為主。主要通過選育抗病品種、適時(shí)換王、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和一些中草藥來綜合防治該病毒病?；瘜W(xué)藥物治療造成蜂產(chǎn)品藥物殘留的食品安全問題，中草藥治療治標(biāo)而不治本。RNA干擾技術(shù)(RNAinterference, RNAi)是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象,其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。由于其特異性和有效性，已被認(rèn)為是一種重要的特異性基因阻斷技術(shù)，目前RNAi已成為疾病防治和藥物篩選的重要研究手段。本發(fā)明利用中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒自身復(fù)制基因合成雙鏈RNA，采用RNA干擾方法來防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，本發(fā)明的雙鏈RNA是用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)的，成本低，并且對(duì)中華蜜蜂囊狀幼蟲病的防治具有良好的治愈效果。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種利用RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，其步驟包括以下:
(O收集患中華蜜蜂囊狀幼蟲病的幼蟲或蛹放置_80°C冰箱保存；
(2)中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒復(fù)制基因-RNA依賴的RNA聚合酶基因的擴(kuò)增:采用Trizol法提取患病幼蟲的總RNA，用RdRp基因的下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因片段，將該基因片段連接到PMD18-T載體，挑取含有該基因片段的單菌落送至華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定；
(3)dsRdRp原核表達(dá)載體的構(gòu)建，將(2)中擴(kuò)增的目的片段，在T4連接酶的作用下連接至L4440載體，16°C連接過夜；將T4酶連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入HTl 15感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有100μ g/mL氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上；
(4)dsRdRp的誘導(dǎo)表達(dá):將(3)中陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD595 = 0.5-0.6，加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷，即IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，處理后37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp ；
(5)dsRdRp的大量表達(dá)并添加懂到飼料中飼喂給蜜蜂幼蟲。
[0006]所述的LB固體培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨，10 g ;酵母提取物5 g ;氯化鈉，10 g ;瓊月旨，15 g;用去離子水定容至I L，121°C蒸汽滅菌20 min ;所述LB液體培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨,10 g;酵母提取物5 g;氯化鈉，10 g;用去離子水定容至１ L, 121°C蒸汽滅菌20 min。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:用RNA干擾方法對(duì)中華蜜蜂囊狀幼蟲病進(jìn)行防治，該方法采用細(xì)菌原核表達(dá)dsRNA，成本低，且選用的基因片段RdRp是病毒復(fù)制的基因，沉默該基因的表達(dá)，抑制中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒的復(fù)制，特異性強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1 RNA依賴的RNA聚合酶基因PCR的擴(kuò)增。
[0009]圖2 dsRdRp的原核表達(dá)結(jié)果。
[0010]圖3中華蜜蜂幼蟲的化蛹率和羽化率。其中dsGFP為對(duì)照組；dsRdRp(0.5)為0.5μ g/ml 的 dsRdRp ；dsRdRp (0.2)為 0.2 μ g/ml 的 dsRdRp ；dsRdRp (0.8)為 0.8 μ g/ml的 dsRdRpο
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
收集患中華蜜蜂囊狀幼蟲病的幼蟲或蛹放置-80°C冰箱保存。
[0012]中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese Sacbrood virus, CSBV)復(fù)制基因一RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因的擴(kuò)增。采用Trizol法提取患病幼蟲的總RNA，用RdRp基因的下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因片段。將該基因片段連接到PMD18-T載體，陽性克隆送至華大基因公司測(cè)序。
[0013]dsRdRp原核表達(dá)載體的構(gòu)建。將(2)中擴(kuò)增的目的片段，在T4連接酶的作用下連接至L4440載體，16°C連接過夜；將T4酶連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入HT115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有100 μ g/mL氨節(jié)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。
[0014]dsRdRp的誘導(dǎo)表達(dá)。將(3)中陽性克隆接種于液體LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD595 = 0.5-0.6，分別加入0.4 mM和0.8 mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，處理后37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h0收集菌液，采用CTAB法提取dsRNA。0.8 mM IPTG成功誘導(dǎo)dsRdRp。
[0015]dsRdRp的大量表達(dá)并添加懂到飼料中飼喂給蜜蜂幼蟲。dsRdRp的終濃度分別為
0.2 μ g/ml、0.5 μ g/ml和0.8 μ g/ml進(jìn)行飼喂，并且以dsGFP做對(duì)照。
[0016]給1-2日齡中華蜜蜂幼蟲飼喂含有dsRNA的飼料，第二天給幼蟲飼喂含有中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒的飼料，之后3-4天飼喂含有dsRNA的飼料至幼蟲預(yù)蛹期，統(tǒng)計(jì)不同處理組蜜蜂幼蟲的化蛹率和羽化率。
[0017]飼喂?jié)舛葹?.5 μ g/ml的dsRdRp，幼蟲化蛹率和羽化率分別為70%、55% ；比飼喂dsGFP的化蛹率(10%)和羽化率(0%)顯著高(見圖3)。
[0018]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，其特征在于:其步驟包括以下: (1)收集患中華蜜蜂囊狀幼蟲病的幼蟲或蛹放置_80°C冰箱保存； (2)中華蜜蜂囊狀幼蟲病毒復(fù)制基因-RNA依賴的RNA聚合酶基因的擴(kuò)增:采用Trizol法提取患病幼蟲的總RNA，用RdRp基因的下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因片段，將該基因片段連接到PMD18-T載體，挑取含有該基因片段的單菌落送至華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定； (3)dsRdRp原核表達(dá)載體的構(gòu)建，將(2)中擴(kuò)增的目的片段，在T4連接酶的作用下連接至L4440載體，16°C連接過夜；將T4酶連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入HTl 15感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有100μ g/mL氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上； (4)dsRdRp的誘導(dǎo)表達(dá):將(3)中陽性克隆接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至OD595 = 0.5-0.6，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷，即IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，處理后37°C繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h，收集菌液，采用CTAB法提取dsRdRp ； (5)dsRdRp的大量表達(dá)并添加懂到飼料中飼喂給蜜蜂幼蟲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用RNA干擾技術(shù)防治中華蜜蜂囊狀幼蟲病的方法，其特征在于:所述的LB固體培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨，10 g ;酵母提取物5 g ;氯化鈉，10 g ;瓊月旨，15 g;用去離子水定容至1L，121°C蒸汽滅菌20 min ;所述LB液體培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨,10 g;酵母提取物5 g;氯化鈉，10 g;用去離子水定容至1L, 121°C蒸汽滅菌20 min。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103751807SQ201410037220
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】夏曉翠, 魏太云, 周冰峰 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)