雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的分子標記及其鑒別方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的兩種分子標記，分別位于SEQ?ID?NO：2所示序列中的第50位堿基處的G/A堿基突變，及SEQ?ID?NO：3所示序列中的第167位堿基處的T/C堿基突變。還提供了這兩種分子標記的鑒別方法及其在雞新城疫病毒抗體水平性狀方面的分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。這兩種分子標記均是以雞ROBO2基因的DNA序列為模板，選擇SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3及所示的引物進行擴增。本發(fā)明所使用的檢測方法準確性高、成本低。通過對上述G/A及T/C突變位點的檢測，在育種過程中選擇TT或者GG基因型的個體，在不影響雞生長性狀的前提下，提高雞新城疫病毒抗體水平。
【專利說明】雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的分子標記及其鑒別方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雞標記輔助選擇【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是涉及用于雞標記輔助選擇的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的兩種分子標記及其鑒別方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫是由新城疫病毒引起的嚴重危害家禽養(yǎng)殖的呼吸道傳染病，新城疫病毒屬于副粘病毒科。新城疫在我國各地均有發(fā)生，具有發(fā)病率和死亡率相對較高，成年蛋雞產(chǎn)蛋率、蛋品質(zhì)下降，飼料報酬低等危害，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。目前在家禽養(yǎng)殖過程中都是通過接種疫苗來預(yù)防新城疫，但是隨著新城疫疫苗免疫密度的提高和廣泛應(yīng)用，養(yǎng)殖成本進一步提升。同時，一些雞群盡管按照免疫程序開展了新城疫疫苗防疫，但是由于病毒免疫應(yīng)答水平存在個體差異，仍然會出現(xiàn)非典型雞新城疫疫情。宿主對新城疫的抗性研究仍是一種挑戰(zhàn)，我們前期利用雞高密度單核苷酸多態(tài)性芯片進行全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與雞新城疫病毒抗體水平密切相關(guān)的基因組區(qū)域，該基因組區(qū)域內(nèi)的R0B02基因上的突變與新城疫病毒抗體水平極顯著相關(guān)。該基因是影響雞對新城疫病毒免疫應(yīng)答的候選基因。但目前從遺傳的角度來說，還沒有建立有關(guān)R0B02基因作為雞新城疫病毒抗體水平分子標記的檢測方法，同時該基因作為雞新城疫病毒抗體水平分子標記輔助選擇也未見應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的分子標記及其鑒別方法和應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明通過克隆與雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的cDNA全長序列，尋找該基因編碼區(qū)的突變位點以及相應(yīng)的多態(tài)性檢測方法，通過性狀關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為雞的標記輔助選擇提供有用的分子標記。另外本發(fā)明還涉及分子標記的鑒別方法以及在雞標記輔助選擇上的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明克隆得到與雞新城疫抗體水平相關(guān)基因R0B02的全長cDNA序列，該全長cDNA序列包括完整的編碼區(qū)序列及3’ UTR和5’ UTR,如序列表SEQ ID NO:1所述，該序列全長為5269bp。
[0006]本發(fā)明通過對上述克隆所獲得的cDNA片段分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可作為雞標記輔助選擇應(yīng)用的兩種分子標記，這兩種標記與雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)。
[0007]分子標記一的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，在該序列的第50位的G堿基突變?yōu)锳堿基；該突變位點位于雞R0B02基因的全長cDNA序列的1418bp處，如序列表SEQ ID N0:1所示。因此，為了方便表述，將標記一的G/A突變命名為1418G>A。
[0008]分子標記二的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，在該序列的第167位堿基處T/C堿基突變。T堿基突`變?yōu)镃堿基，導致AIu1-RFLP多態(tài)性；該突變位點位于雞R0B02基因的全長cDNA序列的2462bp處，如序列表SEQ ID NO:1所示。因此，為了方便表述，將標記二的T/C突變命名為2462T>C。
[0009]分子標記一(1418G>A):以雞R0B02基因的DNA序列(參考序列GeneBank登錄號為NC_006088.3)為模板，設(shè)計引物擴增該基因部分序列。擴增所得到的序列包括部分第5外顯子，如序列表SEQ ID NO:2所述，該序列全長為87bp。所用的引物為:
[0010]RS-exon5-F:5，-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3，，
[0011]RS-exon5-R: 5’-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3’。
[0012]分子標記二(2462T>C):以雞R0B02基因的DNA序列(參考序列GeneBank登錄號為NC_006088.3)為模板，設(shè)計引物擴增該基因部分序列。擴增所得到的序列包括完整的第12外顯子和部分第11內(nèi)含子、部分第12內(nèi)含子，如序列表SEQ ID NO:3所述，該序列全長為286bp。所用的引物為:
[0013]RS-exon12-F: 5’ -TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3’，
[0014]RS-exon12-R:5’-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3’。
[0015]本發(fā)明的第二個目的是提供了兩種分子標記的鑒別方法。
[0016]分子標記一(1418G>A):以雞R0B02基因的DNA序列為模板，通過焦磷酸測序儀，利用RS-exon5-F/RS-exon5-R引物進行擴增，PS-exon5_SR引物進行測序，可以準確判斷該突變位點的基因型。因為在擴增引物的正向引物RS-eXon5-F的5’末端做生物素標記，設(shè)計了反向的測序引物，所以測序結(jié)果為TT基因型，則是發(fā)生突變的AA基因型，測序結(jié)果為CC基因型，則是沒有發(fā)生突變的GG野生型，測序結(jié)果為TC基因型，則是雜合型AG。
[0017]用到的引物:
[0018]擴增引物RS-exon5-F:5’-AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3’(5’ 末端標記有生物素)，
[0019]擴增弓I 物 RS-exon5-R: 5’ -TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3’。
[0020]測序引物PS-exon5_SR:5' -CTTCTTCCAGCGGAC-3，。
[0021]分子標記二(2462T>C):以雞R0B02基因的DNA序列為模板，利用RS-exonl2_F/RS-exon 12-R引物進行擴增，將PCR擴增所得到的產(chǎn)物利用AluI內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。該序列上存在2個AluI內(nèi)切酶識別位點一 “AGTC”，其中一個識別位點位于該序列的第257-260位，該區(qū)域沒有突變位點，所以被檢測個體均可以在該序列處切開為258bp和28bp兩條序列，但是由于28bp的序列太短了，瓊脂糖凝膠電泳檢測不到該序列對應(yīng)的條帶。如果只有一條258bp的條帶，則DNA雙鏈在該突變位點處均為C堿基，判斷為CC基因型；若有兩條分別為165bp和93bp的條帶，則說明DNA雙鏈在該突變位點處均為T堿基，判斷為TT基因型；若有三條分別為258bp、165bp和93bp的條帶，則說明DNA雙鏈在該突變位點處一條鏈為C堿基，另一條鏈為T堿基，判斷為TC基因型。
[0022]本發(fā)明的第三個目的是提供該分子標記在雞分子標記輔助選擇中的應(yīng)用，特別是雞新城疫抗體水平選擇育種中的應(yīng)用。
[0023]通過本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，還可以制備成該兩種分子標記的鑒別試劑盒。
[0024]本發(fā)明的有益效果是，通過對上述G/A或者T/C突變位點的檢測，能知道目標雞群新城疫抗體水平這一免疫性狀的基因型，從而能有目的對雞群進行選擇，提高其后代雞群新城疫抗體水平的一致性。另外，本發(fā)明所使用的檢測方法準確性高、成本低、效率高。【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為利用引物CtlF/CtlR克隆得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的部分cDNA片段I的電泳圖片；
[0026]圖2是利用引物Ct2F/Ct2R克隆所得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的部分cDNA片段2的電泳圖片；
[0027]圖3是利用5’ RACE克隆得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的5’ UTR片段的電泳圖片；
[0028]圖4是利用3’ RACE克隆得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的3’ UTR的電泳圖片；
[0029]圖5是實施例1中雞R0B02基因上的部分DNA序列，用來尋找分子標記一(1418G>A)的片段的電泳圖片，片段大小為87bp (瓊脂糖膠濃度為1.5%)；
[0030]圖6是實施例1中雞R0B02基因外顯子5上的G/A突變位點(分子標記一:1418G>A)的三種基因型(GG，AA和AG)的焦磷酸測序結(jié)果；
[0031]圖7是實施例1中雞R0B02基因上的部分DNA序列，用來尋找分子標記二(2462T>C)的片段的電泳圖片，片段大小為286bp (瓊脂糖膠濃度為1.5%)，其中，M泳道為DNA分子量標準(DL2000)；
[0032]圖8是本發(fā)明中雞R0B02基因外顯子12上的AIu1-RFLP的三種基因型(TT，TC和CC)電泳圖譜(瓊脂糖膠濃度為2.0%)，`M泳道為DNA分子量標準(DL2000)。
【具體實施方式】
[0033]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0034]序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明將所獲得的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的分子標記R0B02全部序列利用DNAStar中的SeqMan程序拼接成一條完整的cDNA序列，包含3621bpCDS 全長，662bp5’ UTR 和 986bp3，UTR。
[0035]序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明克隆的第一只國內(nèi)地方雞種“惠陽胡須雞” R0B02基因包括分子標記一(1418G>A)在內(nèi)的核苷酸序列。
[0036]序列表SEQ ID NO:3是本發(fā)明克隆的第一只國內(nèi)地方雞種“惠陽胡須雞”R0B02基因包括分子標記二(2462T>C)在內(nèi)的核苷酸序列。
[0037]實施例1:雞新城疫抗體水平分子檢測方法的建立
[0038](一)R0B02基因cDNA序列克隆
[0039]以雞R0B02基因的mRNA序列(參考序列GeneBank登錄號為XM_416674.3)為模板，設(shè)計兩對引物CtlF/CtlR，Ct2F/Ct2R克隆得到如圖1和圖2所示的cDNA序列；圖1為利用引物CtlF/CtlR克隆得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的部分cDNA片段I的電泳圖片；圖2是利用引物Ct2F/Ct2R克隆所得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的部分cDNA片段2的電泳圖片。根據(jù)所獲得的cDNA序列設(shè)計三條下游引物5GSP-R1、5NGSP-R2以及5NGSP-R3，以SMART cDNA為模板，用上述三條下游引物和5’ RACE引物擴增該基因的5’末端，得到1279bp的擴增產(chǎn)物，其序列如圖3所示，圖3是利用5’ RACE克隆得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的5’ UTR片段的電泳圖片。根據(jù)所獲得的cDNA序列設(shè)計兩條上游游引物3GSP-F1、3NGSP-F2，以SMARTcDNA為模板，用上述兩條上游引物和3’ RACE引物擴增該基因的3’末端，得到1518bp的擴增產(chǎn)物，其序列如圖4所示，圖4是利用3’ RACE克隆得到的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02的3’ UTR的電泳圖片。
[0040]將上述所獲得的四條序列利用DNAStar中的SeqMan程序進行拼接得到雞R0B02基因的cDNA全長，其序列如序列表SEQ ID NO:1所示。該序列是本發(fā)明將所獲得的雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)基因R0B02全部序列利用DNAStar中的SeqMan程序拼接成一條完整的 cDNA 序列，包含 3621bp CDS 全長，662bp5’ UTR 和 986bp3’ UTR。
[0041]擴增R0B02基因cDNA序列的引物如下所示(分4段擴增):
[0042]第一段:擴增部分cDNA序列
[0043]CtlF:5’ -GCGAGTGGAAACTGACAAAGATGAT-3’，
[0044]CtlR:5’ -TATGGGTTGTGGCTCACTTTTCACT-3’。
[0045]第二段:擴增部分cDNA序列
[0046]Ct2F:5’-CTACCGAGTAATGTATCGCCAAACG-3’，
[0047]Ct2R:5’-AGGAGGTTGTGTATTGCTTTGGATG-3’。
[0048]第三段:5’RACE 擴增 5’ UTR
[0049]5 ‘RACE 上游引物:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATC
[0050]AACGCAGAGT-3’/5 ’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ ，
[0051]5GSP-R1:5’-CATCCTTCTTCCAGCGGACGGTCGG-3’。
[0052]5 ‘RACE 上游槽式引物:5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，
[0053]5NGSP-R2:5’-TCCAGTAGATGGTAGGCTCAGGGTGTCC-3’ 。
[0054]5 ‘RACE 上游槽式引物:5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，
[0055]5NGSP-R3:5’-CATAACTTCCTTCGTCAGGTTTACTCC-3’ 。
[0056]第四段:3’ RACE 擴增 3 ’ UTR
[0057]3GSP-F1:5’ -GTGTTCCCCTCCCACCCCCTCCTGT-3’，
[0058]3 ‘ RACE 下游引物:5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATC
[0059]AACGCAGAGT-3’/5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ 。
[0060]3NGSP-F2:5’-TTCATCACCTGCGATCTCCTTTGGG-3’ ，
[0061]3 ‘RACE 下游槽式引物:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’。
[0062](二)PCR 擴增條件:
[0063]總體積為25yL的PCR反應(yīng)體系中加入DNA模板I μ L，2 XPCR反應(yīng)混合物
12.5 μ L，IOmM引物前后各I μ L，Taq DNA聚合酶0.625U，雙蒸水8.25 μ L，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，退火溫度見表1，表1為引物的退火溫度和延伸時間的列表。退火時間45s，72°C延伸時間見表1，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0064]表1:引物的退火溫度和延伸時間
[0065]
【權(quán)利要求】
1.雞新城疫病毒抗體水平相關(guān)的分子標記，其特征在于，所述分子標記包括分子標記一和分子標記二: 所述分子標記一為如SEQ ID NO:2所示序列中的第50位堿基處G/A堿基突變， 所述分子標記二為如SEQ ID NO:3所示序列中的第167位堿基處T/C堿基突變。
2.一種鑒別權(quán)利要求1所述的分子標記一的方法，其特征在于，包括以下步驟:以雞ROB02基因的DNA序列為模板，選擇如下引物進行擴增及焦磷酸測序檢測: RS-exon5-F:5’ -AGGAGGAGGCCGTGGATTT-3’，其中該引物序列的5’末端標記有生物素， RS-exon5-R:5’-TTGGCAGGTCTGCGTCAT-3’，
PS-exon5-SR:5’-CTTCTTCCAGCGGAC-3’ ； 若測序結(jié)果為TT基因型，則是發(fā)生突變的AA基因型； 若測序結(jié)果為CC基因型，則是沒有發(fā)生突變的GG野生型； 若測序結(jié)果為TC基因型，則是AG雜合型。
3.一種鑒別權(quán)利要求1所述的分子標記二的方法，其特征在于，包括以下步驟:以雞ROB02基因的DNA序列為模板，選擇如下引物擴增:
RS-exonl2-F:5’-TTTACTTCCTTGTTTTCTTG-3’，
RS-exonl2-R:5’-ACCTTCAGTTTCTTTCTTTC-3’ ； 將所得擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶AluI酶切， 若只有一條帶，則該突變位點處均為C堿基； 若有二條帶，則突變位點處均為T堿基； 若有三條帶，則說明該突變位點處一條鏈為C堿基，另一條鏈為T堿基。
4.權(quán)利要求1所述的分子標記在雞新城疫病毒抗體水平性狀方面的分子標記輔助選擇中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為在雞新城疫病毒抗體水平選擇育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725688SQ201310714390
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】王艷, 舒鼎銘, 瞿浩, 王劼, 羅成龍, 李寶紅 申請人:廣東智威農(nóng)業(yè)科技股份有限公司, 廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所