一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法，通過生物信息學(xué)分析獲得轉(zhuǎn)基因植物中外源基因與秀麗隱桿線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉(zhuǎn)化來飼喂秀麗隱桿線蟲，根據(jù)秀麗隱桿線蟲的表型差異來檢測外源基因?qū)€蟲的安全性。以往轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)集中在取食外源蛋白對(duì)非靶標(biāo)生物影響，本發(fā)明用于檢測外源基因?qū)€蟲這類重要土壤生態(tài)系統(tǒng)組成者的安全性問題，填補(bǔ)了這一轉(zhuǎn)基因作物安全評(píng)價(jià)領(lǐng)域的空白。本發(fā)明是利用飼喂的方法來進(jìn)行RNAi，不需要特殊的試劑和儀器，線蟲飼養(yǎng)容易，方法簡單易行。
【專利說明】一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從1996年轉(zhuǎn)基因作物開始大規(guī)模的種植到現(xiàn)在，已經(jīng)有16年的歷史，轉(zhuǎn)基因作物在環(huán)境中的大規(guī)模釋放，使得轉(zhuǎn)基因作物的安全性越來越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，并引發(fā)了不少的爭論。轉(zhuǎn)基因作物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一直是伴隨著轉(zhuǎn)基因作物的研究而開展的，并且也一直是轉(zhuǎn)基因作物獲得許可的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。根據(jù)2001年歐洲議會(huì)發(fā)布的2001/18/EC指令，轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的目的是在個(gè)案分析的原則上確定和評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物可能對(duì)人類健康和環(huán)境造成的直接或間接、短期或長期的負(fù)面影響(Craig et al.2008)。轉(zhuǎn)基因作物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一項(xiàng)重要內(nèi)容就是轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全，包括對(duì)非靶標(biāo)生物以及生物多樣性的影響、基因漂移以及重組的風(fēng)險(xiǎn)和靶標(biāo)生物的抗性演化風(fēng)險(xiǎn)等。轉(zhuǎn)基因作物中轉(zhuǎn)入的外源蛋白和外源基因可以通過花粉、根際分泌物以及作物殘?bào)w等形式在環(huán)境中進(jìn)行擴(kuò)散，這可能對(duì)轉(zhuǎn)基因的非靶標(biāo)生物產(chǎn)生影響。
[0003]所有的轉(zhuǎn)基因作物都有一些非靶標(biāo)的物種存在，這些物種大致可以分為以下幾類:a.農(nóng)業(yè)害蟲的天敵(比如瓢蟲)和傳粉者(比如蜜蜂)；b.非靶標(biāo)的食草動(dòng)物；c.土壤生物；d.保護(hù)物種(比如黑脈金斑蝶)；e.對(duì)地方生物多樣性有貢獻(xiàn)的物種(Snow etal.2005 ；Andow and Hilbeck2004)。由于外源蛋白和外源基因可以通過根際分泌物以及作物殘?bào)w等形式在土壤中殘留，轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生物的非靶標(biāo)效應(yīng)也成為研究者關(guān)注的一個(gè)重點(diǎn)。已經(jīng)有不少研究者開始研究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)彈尾目昆蟲(Folsomia Candida)、螨類(Scheloribates praeincisus)、蟲丘蝴(Enchytraeus albidus)以及甲蟲(Poeciluschalcites)等土壤生物的影響(袁一楊和戈峰2010)。
[0004]土壤中的線蟲無論是在在自然生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要位置。土壤中自由生活的線蟲的取食范圍包括細(xì)菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物以及腐殖質(zhì)等，而寄生性線蟲則在動(dòng)物和植物中均有發(fā)現(xiàn)。土壤線蟲作為分解者參與環(huán)境中的氮循環(huán)和碳循環(huán)，是土壤食物鏈的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這使得線蟲越來越多的被應(yīng)用為土壤生態(tài)系統(tǒng)的指示生物。土壤線蟲中屬于線蟲動(dòng)物門胞管腎綱小桿目小桿科隱桿線蟲屬的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)作為一種重要的模式生物,不僅在分子生物學(xué)以及發(fā)育生物學(xué)方面取得了很多重要的研究成果，也越來越多的應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)方面的研究，在環(huán)境評(píng)估中發(fā)揮著越來越重要的作用。在早期的研究中，常使用致死率作為評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)，而在后來的研究中，有更多反映亞致死情況的指標(biāo)被應(yīng)用到對(duì)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中來，比如生長和繁殖，取食和用計(jì)算機(jī)追蹤的方法來反映運(yùn)動(dòng)機(jī)能等(Sochovd et al.2006 ；Leung etal.2008 ；Hoss et al.2009)。
[0005]在目前研究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生物的非靶標(biāo)效應(yīng)中，一般考察殘留在土壤中的外源蛋白(如Bt蛋白)對(duì)土壤生物的毒副作用，而不考慮外源基因的影響。對(duì)于一般的生物來說，除了基因漂移和重組以外，外源基因難以對(duì)其產(chǎn)生影響。但是，通過對(duì)模式生物秀麗隱桿線蟲的研究，發(fā)現(xiàn)線蟲是一種可以通過注射、浸泡和取食雙鏈RNA等方式來影響自身基因表達(dá),產(chǎn)生RNAi效應(yīng)的生物。這種外源基因?qū)ν寥谰€蟲的非靶標(biāo)效應(yīng)是之前研究中沒有得到監(jiān)測的缺失環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法，通過生物信息學(xué)分析獲得轉(zhuǎn)基因植物中外源基因與秀麗隱桿線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉(zhuǎn)化來飼喂秀麗隱桿線蟲，根據(jù)秀麗隱桿線蟲的表型差異來檢測外源基因?qū)€蟲的安全性。
[0008]通過構(gòu)建含有外源基因與秀麗隱桿線蟲相同短片段的表達(dá)雙鏈RNA的載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中飼喂秀麗隱桿線蟲，利用RNAi的方法，檢測轉(zhuǎn)基因作物中的外源基因是否對(duì)秀麗隱桿線蟲造成影響。
[0009]具體地，所述方法包括以下步驟:
[0010]I)序列的生物信息學(xué)分析
[0011]將轉(zhuǎn)基因作物外源基因的核苷酸序列與秀麗隱桿線蟲的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出完全匹配且長度≥17bp的目的基因片段，再將這些目的片段在Wormbase數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，找出與秀麗隱桿線蟲基因組中外顯子反相互補(bǔ)的目的基因片段；
[0012]2)重復(fù)片段表達(dá)載體的構(gòu)建及宿主菌的轉(zhuǎn)化
[0013]1.將找到的與秀麗隱桿線蟲基因組中外顯子反相互補(bǔ)的目的基因片段分別以5和10的倍數(shù)進(jìn)行拷貝，兩端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)堿基，合成5個(gè)和10個(gè)拷貝的重復(fù)目的基因片段；
[0014]i1.將目的基因片段與含有兩個(gè)相反方向的T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體L4440分別用相同的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，切割后的目的片段和表達(dá)載體以3:1的比例進(jìn)行連接，使目的片段連入表達(dá)載體的兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間；
[0015]ii1.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transl09的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB培養(yǎng)基上，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜；
[0016]3)對(duì)照組的選擇和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0017]根據(jù)Wormbase數(shù)據(jù)庫中秀麗隱桿線蟲的基因信息,選擇3個(gè)基因rpl_2, fem-1和hrp-1作為陽性對(duì)照；分別在這3個(gè)基因上選擇長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設(shè)計(jì)引物，兩端加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，按步驟2)中目的基因片段的克隆方法，連接到表達(dá)載體L4440 中；
[0018]4)飼喂秀麗隱桿線蟲
[0019]iv.將E.coli 0P50涂布于NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)過夜；挑取秀麗隱桿線蟲于含有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)；
[0020]V.將步驟2)中含有目的基因片段克隆表達(dá)載體的大腸桿菌HT115接種于含lmmol/L IPTG的NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)過夜以誘導(dǎo)dsRNA的產(chǎn)生；將處于L3生長期的線蟲放到該培養(yǎng)基上飼養(yǎng)至產(chǎn)卵,待線蟲大量產(chǎn)卵后,移除成蟲；
[0021]v1.每個(gè)處理組及對(duì)照組設(shè)置5個(gè)平板，每個(gè)平板中接入20條Fl代線蟲；在？1代線蟲產(chǎn)卵期間，每天更換一次平板；待產(chǎn)卵期結(jié)束后，每兩天更換一次平板；統(tǒng)計(jì)Fl代線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量及存活時(shí)間，進(jìn)而檢測外源基因?qū)ν寥谰€蟲的安全性。
[0022]步驟3)中分別針對(duì)3個(gè)基因rpl-2，fem-1和hrp_l的長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設(shè)計(jì)的引物如下:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測轉(zhuǎn)基因作物外源基因?qū)ν寥谰€蟲安全性的方法，其特征在于，通過生物信息學(xué)分析獲得轉(zhuǎn)基因植物中外源基因與秀麗隱桿線蟲基因組中相同短片段，通過將短片段克隆和轉(zhuǎn)化來飼喂秀麗隱桿線蟲，根據(jù)秀麗隱桿線蟲的表型差異來檢測外源基因?qū)€蟲的安全性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)序列的生物信息學(xué)分析 將轉(zhuǎn)基因作物外源基因的核苷酸序列與秀麗隱桿線蟲的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，找出完全匹配且長度≥17bp的目的基因片段，再將這些目的片段在Wormbase數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，找出與秀麗隱桿線蟲基因組中外顯子反相互補(bǔ)的目的基因片段； 2)重復(fù)片段表達(dá)載體的構(gòu)建及宿主菌的轉(zhuǎn)化 1.將找到的與秀麗隱桿線蟲基因組中外顯子反相互補(bǔ)的目的基因片段分別以5和10的倍數(shù)進(jìn)行拷貝，兩端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和保護(hù)堿基，合成5個(gè)和10個(gè)拷貝的重復(fù)目的基因片段； ?.將目的基因片段與含有兩個(gè)相反方向的T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體L4440分別用相同的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，切割后的目的片段和表達(dá)載體以3:1的比例進(jìn)行連接，使目的片段連入表達(dá)載體的兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間； ii1.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transl09的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB培養(yǎng)基上，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HT115的感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液涂布于LB培養(yǎng)基上，37 °C培養(yǎng) 過夜； 3)對(duì)照組的選擇和表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)Wormbase數(shù)據(jù)庫中秀麗隱桿線蟲的基因信息，選擇3個(gè)基因rpl_2, fem-1和hrp-1作為陽性對(duì)照；分別在這3個(gè)基因上選擇長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設(shè)計(jì)引物，兩端加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，按步驟2)中目的基因片段的克隆方法，連接到表達(dá)載體L4440 中； 4)飼喂秀麗隱桿線蟲 iv.將E.coli 0P50涂布于NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)過夜；挑取秀麗隱桿線蟲于含有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)； V.將步驟2)中含有目的基因片段克隆表達(dá)載體的大腸桿菌HT115接種于含lmmol/LIPTG的NGM培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)過夜以誘導(dǎo)dsRNA的產(chǎn)生；將處于L3生長期的線蟲放到該培養(yǎng)基上飼養(yǎng)至產(chǎn)卵,待線蟲大量產(chǎn)卵后,移除成蟲； v1.每個(gè)處理組及對(duì)照組設(shè)置5個(gè)平板，每個(gè)平板中接入20條Fl代線蟲；在Fl代線蟲產(chǎn)卵期間，每天更換一次平板；待產(chǎn)卵期結(jié)束后，每兩天更換一次平板；統(tǒng)計(jì)Fl代線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量及存活時(shí)間，進(jìn)而檢測外源基因?qū)ν寥谰€蟲的安全性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟3)中分別針對(duì)3個(gè)基因rpl-2，fem-1和hrp-1的長度為700bp、200bp和IOObp的片段，設(shè)計(jì)的引物如下:
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK103695541SQ201310682486
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】許崇任, 王戎疆, 李家練, 李茹 申請(qǐng)人:北京大學(xué)