源于板栗堅果的微生物及其應(yīng)用和微生物菌劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體而言，涉及源于板栗堅果的微生物及其應(yīng)用和微生物菌劑的制備方法。其中，源于板栗堅果的微生物，2013年11月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC?M2013568，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌亞種CMN1308。該微生物為板栗的一種內(nèi)生菌，其在抑制由栗疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗霉、擴展青霉和炭疽菌中的至少一種真菌引起的板栗實腐病的防治，以及作為飼料添加劑，促進(jìn)動物生長提高免疫能力等方面具有良好的作用。與現(xiàn)有技術(shù)中用化學(xué)農(nóng)藥防治實腐病相比，不會造成對人類健康的危害，以及對環(huán)境的污染等問題，具有重要的環(huán)保意義。
【專利說明】源于板栗堅果的微生物及其應(yīng)用和微生物菌劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體而言，涉及源于板栗堅果的微生物及其應(yīng)用和微生物菌劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]板栗(Castanea millissima.BL.)屬山毛櫸科栗屬植物,素有“千果之王”的美稱，是我國的重要經(jīng)濟樹種之一。板栗含水率高，貯藏和運輸過程中很容易發(fā)生變色、變味甚至腐爛，學(xué)術(shù)上稱為“實腐病”。實腐病的發(fā)病率很高，一般可達(dá)20%~30%，嚴(yán)重者達(dá)70%，造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約了板栗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003]相關(guān)技術(shù)中，主要使用化學(xué)農(nóng)藥來防治板栗的實腐病。
[0004]但是化學(xué)農(nóng)藥在使用過程中，存在對人類健康的危害以及對環(huán)境的污染等問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種源于板栗堅果的微生物及其應(yīng)用和微生物菌劑的制備方法，以解決上述的問題。
[0006]在本發(fā)明的實施例中第一方面提供了一種源于板栗堅果的微生物，2013年11月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2013568，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌亞種CMNl308。
[0007]在本發(fā)明的實施例中第二方面提供了上述微生物在抑制引起板栗實腐病的微生物中的應(yīng)用。
[0008]在本發(fā)明的實施例中第三方面提供了上述微生物作為促進(jìn)家畜生長，提高免疫力的飼料添加劑的應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的實施例中第四方面提供了利用上述微生物制備發(fā)酵液的方法。
[0010]在本發(fā)明的實施例中第五方面提供了上述微生物的固態(tài)菌劑。
[0011]本發(fā)明實施例提供的源于板栗堅果的微生物及其應(yīng)用和微生物菌劑的制備方法，其通過篩選獲得的微生物:2013年11月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2013568，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌亞種CMN1308，為板栗的一種內(nèi)生菌，其在抑制由栗疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗霉、擴展青霉和炭疽菌中的至少一種真菌引起的板栗實腐病的防治，以及作為飼料添加劑，促進(jìn)動物生長提高免疫能力等方面具有良好的作用。與現(xiàn)有技術(shù)中用化學(xué)農(nóng)藥防治實腐病相比，本發(fā)明實施例提供的微生物在防治實腐病時，不會造成對人類健康的危害，以及對環(huán)境的污染等問題，具有重要的環(huán)保意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1示出了本發(fā)明實施例提供的解淀粉芽孢桿菌革蘭氏染色的顯微觀察結(jié)果；
[0013]圖2示出了本發(fā)明實施例提供的解淀粉芽孢桿菌與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析示意圖；[0014]圖3示出了本發(fā)明實施例提供的解淀粉芽孢桿菌對引起實腐病的真菌的抑菌效果示意圖。
【具體實施方式】
[0015]下面通過具體的實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0016]板栗實腐病主要是由一些致病真菌引起的，其中常見的有:匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、腐皮鍵刀菌(Fusarium solani)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、栗疫菌(Cryphonectria parasitica)、可可毛色二抱菌(Lasiodiplodia theobromae)、擴展青霉(Penicillium expansum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、膠胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、淺黃隱球酵母(Cryptococcus luteolus)、白假絲酵母(Candida albicans)等。
[0017]本發(fā)明實施例為了解決在防治板栗實腐病中盡量少用化學(xué)農(nóng)藥，以避免化學(xué)農(nóng)藥的使用帶來的對人類的危害以及對環(huán)境的污染等問題，從板栗中篩選內(nèi)生菌。內(nèi)生菌(endophyte)是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物。內(nèi)生菌生活在植物組織中，長期以來與宿主形成密切關(guān)系，兩者之間互相進(jìn)行物質(zhì)、能量及遺傳信息交流，在長期協(xié)同進(jìn)化過程中，彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。部分內(nèi)生菌能夠抑制引起實腐病的致病真菌，提高宿主植物的抗病能力，其提高植物抗病性的機制主要包括:(I)產(chǎn)生拮抗微生物的低分子量的化學(xué)物質(zhì)，如:植物保護素、多聚物、木質(zhì)素、富含經(jīng)葡氨酸的糖蛋白；(2)誘導(dǎo)一些氧化酶類和水解酶類，如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和過氧化物酶；(3)誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的產(chǎn)生。
[0018]因此，經(jīng)過分離篩選獲得能夠抑制引起實腐病的致病真菌的內(nèi)生菌，對防治板栗實腐病、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用具有重要的意義。
[0019]本發(fā)明實施例獲得了·一種源于板栗堅果的微生物，并將該微生物(以下簡稱“本微生物”)進(jìn)行保藏，保藏號為CCTCC M2013568 ;保藏名稱為:解淀粉芽孢桿菌亞種CMN1308(Bacillus amy1liquefaciens subsp.Plantarum CMN1308);保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏日期為:2013年11月12日；保藏地址為:中國，武漢，武漢大學(xué)。
[0020]本發(fā)明實施例優(yōu)選采用一級母液、二級母液和發(fā)酵的三級發(fā)酵方式制備本微生物的發(fā)酵液，通過優(yōu)化二級母液和發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，使得到的發(fā)酵液的活菌含量達(dá)到了 10~30X 108cfu/mL。其活菌量高，在用于防治板栗實腐病和作為飼料添加劑時的活性更高，效果更好。
[0021]其中,優(yōu)選二級母液的培養(yǎng)基配方為:鹿糖25g/L、葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸錳0.05g/L ;優(yōu)選的二級母液的培養(yǎng)條件為:將一級母液接入二級母液的培養(yǎng)基中，其中，接種量為I~5% (V/V)，培養(yǎng)條件為:通氣比1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為150~200r/min，培養(yǎng)溫度為35~37°C，罐壓為0.01MPa,培養(yǎng)時間為20~22h ;制得所述微生物的二級母液。
[0022]優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:淀粉50g/L、葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸錳0.05g/L ;優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:將二級母液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為I~5% (V/V)，培養(yǎng)條件為:通氣比為1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為150~200r/min，培養(yǎng)溫度35~37°C，罐壓0.01MPa，培養(yǎng)時間為46~48h，制得所述微生物的發(fā)酵液。[0023]此外，本發(fā)明實施例提供的本微生物的發(fā)酵液的制備方法，優(yōu)選在制備一級母液之前，對保藏的本微生物進(jìn)行活化的步驟。經(jīng)過活化的微生物，與保藏中的微生物相比，具有更高的代謝活性，用其制備一級母液時，其活性更高，在制備一級母液的培養(yǎng)基中適應(yīng)能力更強，繁殖速度更快。有利于一級母液的制備。
[0024]本發(fā)明實施例提供的本微生物的固態(tài)菌劑，優(yōu)選采用玉米淀粉為載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的，制備固態(tài)菌劑用的可接受的載體有多種，如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，土豆淀粉等；其中，玉米淀粉來源豐富且價格低廉，有利于降低固體菌劑的成本。
[0025]本發(fā)明實施例中，微生物的干菌粉的制備方法優(yōu)選為:將微生物的菌懸液離心收集菌泥，再冷凍干燥制成干菌粉。其中，通過冷凍干燥的方法制備干菌粉，由于通過升華的方法，使細(xì)胞中的水分直接去除，不會破壞細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，因此可以避免微生物細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致干菌粉中的活菌數(shù)的下降，進(jìn)而降低固態(tài)菌劑的微生物活性。
[0026]本發(fā)明實施例中，本微生物的菌懸液的培養(yǎng)條件為:在LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16~20小時，培養(yǎng)基成本低，原料豐富易得，培養(yǎng)溫度適中，且培養(yǎng)時間短，而且，得到的菌懸液的活菌數(shù)高，達(dá)到了 108cfu/g，則用其制備成固態(tài)菌劑時，固態(tài)菌劑中的活菌數(shù)能夠達(dá)到 108cfu/go
[0027]本發(fā)明實施例中，優(yōu)選將活菌數(shù)為108cfu/g微生物的干菌粉和載體按重量比為I: 4進(jìn)行混合，得到微生物的固態(tài)菌劑。
[0028]由于載體和干菌粉的重量比例適當(dāng)，且干菌粉中的活菌數(shù)高，則將上述固態(tài)菌劑用于防治板栗實腐病和作為飼料添加劑時的活性更高，效果更好。
[0029]如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的，本發(fā)明實施例中，本微生物作為家畜飼料添加劑的應(yīng)用中，家畜包括雞、鴨、鵝、豬等。
[0030]實施例一，本微生物的篩選
[0031]本發(fā)明實施例提供的微生物通過以下方法進(jìn)行篩選獲得:
[0032]從湖北省黃R市羅田縣勝利鎮(zhèn)玫瑰紅板栗園中采集板栗堅果，進(jìn)行常溫氣調(diào)貯藏。取未發(fā)生明顯板栗實腐病的堅果種皮和內(nèi)部種仁，按照本領(lǐng)域的常用方法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離和培養(yǎng)，得到5種內(nèi)生細(xì)菌，分別編號為CMN1301，CMNl302，CMNl304，CMNl305,CMN1308。分別以引起板栗貯藏期發(fā)生實腐病的致病菌:栗疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗霉、擴展青霉、炭疽菌作為指示菌株，按照本領(lǐng)域的常用方法，采取平板對峙培養(yǎng)法和抑菌圈法篩選抑菌能力強的內(nèi)生細(xì)菌。篩選結(jié)果如表1所示。
[0033]表1.板栗栗仁內(nèi)生菌株對病原菌的抑制效果
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種源于板栗堅果的微生物，其特征在于，2013年11月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M2013568，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌亞種CMN1308。
2.權(quán)利要求1所述的微生物在抑制引起板栗實腐病的微生物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述引起板栗實腐病的微生物包括栗疫菌、腐皮鐮刀菌、黑葡萄穗霉、擴展青霉和炭疽菌中的至少一種。
4.權(quán)利要求1所述的微生物作為促進(jìn)家畜生長，提高免疫力的飼料添加劑的應(yīng)用。
5.利用權(quán)利要求1所述的微生物制備發(fā)酵液的方法，其特征在于，包括: 制備一級母液:挑取所述微生物接種于液體培養(yǎng)基中，在37°C，100~120r/min的條件下培養(yǎng)22~24h，制得所述微生物的一級母液； 制備二級母液:將上述一級母液接入二級母液的培養(yǎng)基中，其中，接種量為I~5% (V/V)，培養(yǎng)條件為:通氣比1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為150~200r/min，培養(yǎng)溫度為35~37°C，罐壓為0.01MPa，培養(yǎng)時間為20~22h ;制得所述微生物的二級母液； 制備發(fā)酵液:將上述二級母液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為I~5%(V/V)，培養(yǎng)條件為:通氣比為1:1，攪拌轉(zhuǎn)速為150~200r/min，培養(yǎng)溫度35~37°C，罐壓0.01MPa，培養(yǎng)時間為46~48h，制得所述微生物的發(fā)酵液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于， 所述一級母液的培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基； 和/或` 所述二級母液的培養(yǎng)基配方為:鹿糖25g/L、葡萄糖25g/L、酵母粉15g/L、蛋白粉IOg/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、硫酸錳0.05g/L ； 和/或 所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:淀粉50g/L、葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、蛋白粉10g/L、磷酸二氫鉀 0.5g/L、硫酸錳 0.05g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制備一級母液的步驟之前還包括活化的步驟。
8.權(quán)利要求1所述的微生物的固態(tài)菌劑，其特征在于，包括所述微生物的干菌粉和固態(tài)菌劑中可接受的載體，所述微生物的干菌粉和所述載體的重量比為1:4 ;所述微生物的干菌粉的活菌數(shù)為108cfu/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物的固態(tài)菌劑，其特征在于，所述載體為玉米淀粉。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物的固態(tài)菌劑，其特征在于，所述微生物的干菌粉的制備方法為:將所述微生物的菌懸液離心收集菌泥，冷凍干燥制成干菌粉。
【文檔編號】C12N1/20GK103667142SQ201310672539
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】李琳玲, 程水源, 程華, 華娟, 袁紅慧, 張雪花 申請人:黃岡師范學(xué)院