枯草芽孢桿菌a053及其在制備防治植物致病真菌發(fā)酵液中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】枯草芽孢桿菌A053及其在制備防治植物致病真菌發(fā)酵液中的應(yīng)用，涉及枯草芽孢桿菌。所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）A053的保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2010269。所述枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）A053可用于制備防治植物致病真菌發(fā)酵液。所述防治植物致病真菌發(fā)酵液的使用方法如下：將防治植物致病真菌發(fā)酵液直接用于植物致病真菌的防治。所述植物致病真菌包括：立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長(zhǎng)柄鏈格孢、香蕉炭疽菌等。制備工藝簡(jiǎn)單，抑真菌譜廣，對(duì)鐮刀菌生防效果好。
【專利說明】枯草芽孢桿菌A053及其在制備防治植物致病真菌發(fā)酵液中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌，特別是涉及一種枯草芽孢桿菌A053及其在制備防治植物致病真菌發(fā)酵液中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物病原真菌引起的植物病害位居植物3類病害(真菌病害、細(xì)菌病害和病毒病害)之首，其頻繁發(fā)生成災(zāi)，造成重大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，是阻礙中國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的突出問題之一。我國(guó)既是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，也是一個(gè)海洋大國(guó)，從海洋微生物資源中尋找具有特殊功能的活性物質(zhì)應(yīng)用于陸地農(nóng)業(yè)是一個(gè)較新的研究方向，有著很強(qiáng)的創(chuàng)新性和巨大的應(yīng)用潛力。由于試制的農(nóng)用抗生素可以直接在植物體上測(cè)試，不需要經(jīng)過動(dòng)物間接試驗(yàn)，因此研究過程較醫(yī)藥研究將大大縮短?，F(xiàn)在也已獲得一些有價(jià)值的活性物質(zhì)，有的己經(jīng)應(yīng)用到植物病蟲害的防治試驗(yàn)中，取得較好的效果。
[0003]由于極地環(huán)境特殊性以及人們尋找新型活性物質(zhì)的興趣與日俱增，近年來，極地微生物資源已越來越引起了人們的注意。北極由于其獨(dú)有的地理及氣候特征，是一個(gè)潛在的、有待開發(fā)的微生物資源庫。它不僅是獨(dú)特生態(tài)系統(tǒng)微生物的生存繁衍地，也是新型生物活性物質(zhì)(如酶、抗生素、多糖及脂類等)和先導(dǎo)化合物合成菌株的潛在種源地。在這種特殊的生態(tài)多樣性環(huán)境中生存的微生物，可能具有不同于陸生微生物的獨(dú)特的遺傳和代謝多樣性。因此，北極微生物資源可能是新型化合物或新型活性代謝產(chǎn)物的潛在來源。
[0004]研究表明，許多海洋微生物可產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)，包括鏈霉菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、芽抱桿菌屬、黃桿菌屬、微球菌屬、子囊菌屬、半知菌屬等以及許多未定菌(沈寅初.農(nóng)用抗生素研究開發(fā)的新進(jìn)展.國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè).1998，19(2): 155-160)。雖然已知有數(shù)種細(xì)菌具有抗真菌活`性，但是芽孢桿菌仍然是最好的選擇(Handelsman J, StabbEV.Biocontrol of soil borne plant pathogens.Plant Celll996;8:1855-1869),因?yàn)閷?duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力(黃海嬋，裘娟萍.枯草芽孢桿菌防治植物病害的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，(3):213-215)，故其成為近年來植物病害防治研究的熱點(diǎn)。尤其是來自北極極端條件下的芽孢桿菌，其生長(zhǎng)條件、代謝類型和產(chǎn)物與陸地或其他海洋來源的不同，從而有可能開發(fā)出結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053在制備防治植物致病真菌發(fā)酵液中的應(yīng)用及其方法。
[0007]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053分離自中國(guó)第三次北極科學(xué)考察期間所采集的海水樣品(N78° 57' 09.2"，E12° OOi 02.3 ");該菌已于2010年10月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵編為430072，保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2010269。
[0008]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增其16S rDNA序列，與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有99%的序列相似性。
[0009]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053可用于制備防治植物致病真菌發(fā)酵液。其制備方法如下:
[0010]首先將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053在含有IOml LB培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后將活化的菌株接種到5L發(fā)酵罐(培養(yǎng)基3L)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到防治植物致病真菌發(fā)酵液。
[0011]所述LB 培養(yǎng)基的組成如下:葡萄糖 20g/L，KH2P046g/L, K2HPO414g/L, MgSO40.2g/L, (NH4)2S044g/L, 2ml 微量元素，0.1MPa 滅菌 30min,所述微量元素包括 FeSO4.4H20,CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用。
[0012]所述活化培養(yǎng)的時(shí)間為8~12h ;所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可為:溫度為30~37°C，pH為6.0~8.0,時(shí)間為36~72h。
[0013]所述防治植物致病真菌發(fā)酵液的使用方法如下:
[0014]將防治植物致病真菌發(fā)酵液直接噴灑在植物上。
[0015]在棉花枯萎病菌(鐮刀菌感染引起)防治的盆栽實(shí)驗(yàn)中，A053發(fā)酵液具有較好的生物防治效果。 [0016]所述植物致病真菌包括:立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長(zhǎng)柄鏈格孢、香蕉炭疽菌等。在棉花枯萎病菌(鐮刀菌)防治的盆栽試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053發(fā)酵液具有較好的生物防治效果，處理7天后，對(duì)照組的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，發(fā)病率從36.67%升高到69.23% ;而實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病趨勢(shì)得到遏制，發(fā)病率從45.95% 下降至Ij 37.93%。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053發(fā)酵液的制備工藝簡(jiǎn)單，抑真菌譜廣，對(duì)鐮刀菌生防效果好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053的菌落形態(tài)。
[0019]圖2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053的發(fā)酵上清液對(duì)不同植物致病真菌的抑菌效果圖。在圖2中:A，立枯絲核菌，B，核盤菌，C，宛氏擬青霉，D，鐮刀菌，E，綠色木霉，F(xiàn),長(zhǎng)柄鏈格孢，G,香蕉炭疽菌
[0020]圖3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053的發(fā)酵液防治棉花枯萎病菌的盆栽試驗(yàn)生防效果。在圖3中，實(shí)驗(yàn)組:枯草芽孢桿菌(Bacillus sUbtilis)A053發(fā)酵液處理過棉花植株；對(duì)照組:發(fā)酵培養(yǎng)基處理過棉花植株(作為陰性對(duì)照)。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0022]實(shí)施例1:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053的分離篩選[0023]本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053來源于本 申請(qǐng)人:來自中國(guó)第三次北極科學(xué)考察期間所采集的海水樣品(N78° 57' 09.2"，E12° 00' 02.3")中所分離獲得，該菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，30°C培養(yǎng)24h后，菌體呈淺黃色，菌落較大，見圖1。
[0024]實(shí)施例2:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053菌種鑒定
[0025]利用16S rDNA 通用引物 27F 和 1495R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAT ；1495R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT)對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A05316S rDNA 序列進(jìn)行PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增。以北極來源枯草芽孢桿菌A053總DNA為PCR擴(kuò)增模板，在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94°C變性Imin ;55°C退火lmin;72°C延長(zhǎng)1.5min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增基因送測(cè)序公司測(cè)序，獲得該菌株16S rDNA序列后，將該序列通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI) BLAST搜索引擎(http://ncb1.nlm.nih.gov/blast)與GeneBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) A05316S rDNA 序列與 Bacillus subtilis (CP002905.1)、Bacillus subtilis(EU047884.1)、Bacillus subtilis(HQ327126.1)、Bacillussubtilis (AB325584.1)等菌株的序列相似性為99%，因此，將其命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053。
[0026]實(shí)施例3:植物致病真菌抗菌譜的測(cè)定
[0027]采用濾紙片法測(cè)定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053對(duì)7種植物致病真菌的抑制活性。用直徑為6mm無菌打孔器將受試致病真菌制成菌塊，用牙簽挑取一菌塊于馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)平板中央，28°C的條件下培養(yǎng)I~2天，等待受試致病真菌菌絲體擴(kuò)散生長(zhǎng)后，在每個(gè)菌塊的四周放置若干滅菌的直徑6mm的雙層濾紙片，濾紙片距離菌塊中心0.5~1cm，再在每 個(gè)濾紙片上加50 μ L的無菌發(fā)酵上清液，繼續(xù)培養(yǎng)2~3天，通過與對(duì)照培養(yǎng)的比較，觀測(cè)菌絲體的生長(zhǎng)是否會(huì)受到抑制，如果受試致病真菌的菌絲體受到抑制時(shí)，菌絲體會(huì)形成月牙型或者線型邊緣。結(jié)果如圖2所示，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) A053發(fā)酵上清液對(duì)立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長(zhǎng)柄鏈格孢、香蕉炭疽菌等7種受試植物致病真菌具有抑制活性。
[0028]實(shí)施例4:棉花枯萎病菌(鐮刀菌感染引起)的生物防治盆栽試驗(yàn)
[0029]在棉花發(fā)病較明顯時(shí)每缽澆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053發(fā)酵菌液50mL，共6缽，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；另設(shè)對(duì)照組6缽，澆清水。處理前，實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病率達(dá)45.95%，對(duì)照發(fā)病率為36.67%，實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病程度較對(duì)照組重。處理后7天，對(duì)照組的發(fā)病呈上升趨勢(shì)，發(fā)病率達(dá)69.23% ;而實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病趨勢(shì)得到遏制，發(fā)病率為37.93%，見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在棉花發(fā)病后用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) A053發(fā)酵菌液澆根能在一定程度遏制枯萎病的加重，從而有利于棉花后期的恢復(fù)生長(zhǎng)。
【權(quán)利要求】
1.枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)A053,已于2010年10月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2010269。
2.如權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) A053在制備防治植物致病真菌發(fā)酵液中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于所述防治植物致病真菌發(fā)酵液的制備方法如下: 首先將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)A053在含有IOml LB培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后將活化的菌株接種到5L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到防治植物致病真菌發(fā)酵液。
4.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述LB培養(yǎng)基的組成如下:葡萄糖20g/L，KH2P046g/L，K2HP0414g/L，MgSO40.2g/L，(NH4) 2S044g/L，2ml 微量元素，0.1MPa 滅菌 30min,所述微量元素包括FeSO4.4H20, CaCl2.2H20, MnSO4.4H20, ZnCl2各ImM，過濾除菌后放入無菌試劑瓶中備用。
5.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述活化培養(yǎng)的時(shí)間為8~12h。
6.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度為30~37°C，pH為6.0~8.0，時(shí)間為36~72h。
7.如權(quán)利要求3所 述應(yīng)用，其特征在于所述防治植物致病真菌發(fā)酵液的使用方法如下: 將防治植物致病真菌發(fā)酵液直接噴灑在植物上。
8.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于植物致病真菌包括:立枯絲核菌、核盤菌、宛氏擬青霉、鐮刀菌、綠色木霉、長(zhǎng)柄鏈格孢、香蕉炭疽菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103589673SQ201310636419
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】陳新華, 陳志騰, 崔鵬飛 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所