草莓鑲脈病毒的快速檢測試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測草莓鑲脈病毒（Strawberry?vein?banding?virus）的專用引物及其應用。檢測草莓鑲脈病毒（Strawberry?vein?banding?virus）的專用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。利用本發(fā)明引物進行檢測，檢測過程快速、靈敏、操作簡便，不需要其他貴重儀器和試劑，特別適合種苗繁育、脫毒培養(yǎng)、田間調查時快速檢測和生產基層技術人員掌握應用。
【專利說明】草莓鑲脈病毒的快速檢測試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及草莓鑲脈病毒的LAMP檢測引物、快速檢測試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]草莓壤脈病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)是一種對草莓危害較嚴重的潛隱性病毒，屬花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)花椰菜病毒屬(Caulimovirus),病毒粒子為等軸狀，直徑約50nm，無包膜?；蚪M為單分子環(huán)狀dsDNA，長7876bp。目前，SVBV唯一的自然傳播載體是蚜蟲，但是病毒不能在蚜蟲體內復制，也不能通過蚜蟲的后代傳遞。機械接種病汁液不能傳播SVBV，種子和花粉也不傳播。當SVBV侵染栽培草莓品種時，一般不表現明顯癥狀，但是可造成草莓植株生長衰弱，匍匐莖數量有所減少，草莓的產量及品質降低。對草莓生產影響很大，甚至造成部分草莓產田絕產絕收。因此，草莓苗的病毒檢測至關重要，尤其是在草莓苗的莖尖脫毒組織培養(yǎng)過程中，SVBV的快速、準確檢測在生產上的要求極為迫切。
[0003]由于草莓病毒提純困難、蚜蟲傳播等原因，病毒病害防治困難，因此，建立高效靈敏的檢測技術，成為解決種苗檢測、早期鑒定等問題的關鍵，為草莓栽培提供保障。SVBV的檢測技術目前包括指示植物的小葉嫁接法、血清學方法和聚合酶鏈式反應(PCR)等。小葉嫁接法、血清學方法周期長、靈敏度較低、較為費時費工，PCR方法需要特殊的儀器和試劑，在農業(yè)生產單位和技術推廣部門很難應用檢測。
[0004]環(huán)介導等溫擴增技術檢測病毒操作簡便，不需要特殊的儀器和試劑，操作簡單，可以在恒溫條件下快速檢測，成本較低。與其他病毒檢測方法相比，快速、簡便、靈敏，至今尚未有任何有關環(huán)介導等溫擴增技術在草莓鑲脈病毒檢測上的應用。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)的專用引物以及特異性強、靈敏度高、易于操作、結果可靠的草莓鑲脈病毒(Strawberry veinbanding virus)的快速分子檢測方法。
[0006]本發(fā)明所提供的檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)的專用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。
[0007]本發(fā)明還提供一種檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)的試劑盒，包括所述的專用引物。
[0008]本發(fā)明所述專用引物在制備檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein bandingvirus)的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍
[0009]上述專用引物或試劑盒在鑒定草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)病害中的應用也是本發(fā)明的保護范圍。
[0010]本發(fā)明還保護一種檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)或檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)病害發(fā)生危害的方法,包括如下步驟:
[0011](I)提取待測生物樣本的基因組DNA ；
[0012](2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用權利要求1所述的專用引物進行環(huán)介導恒溫擴增；
[0013](3)根據步驟(2)的擴增產物鑒定所述待測生物樣本是否含有草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)或者是否感染草莓壤脈病毒(Strawberry veinbanding virus)病害。
[0014]所述環(huán)介導恒溫擴增的反應程序為:63°C I小時，80°C 10分鐘。
[0015]所述環(huán)介導恒溫擴增的反應體系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所示DNA的濃度均為1.2 μ M，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的濃度均為0.1 μ Μ。
[0016]所述環(huán)介導恒溫擴增的體系包括:1.2μ M序列表的序列I所示DNA，1.2μΜ列表的序列4所不DNA, 0.1 u M序列表的序列2所不DNA, 0.1 u M序列表的序列3所不DNA,IOXBst buffer2.5ul, 2mM MgSO4,1.6mM dNTPs, IM Betaine,8U Bst DNA polymerase,DEPCddH20，待測生物樣本的基因組DNA，擴增體系總體積為25 μ I。
[0017]所述環(huán)介導恒溫擴增產物的檢測方法為下述I)或2)所述的方法:
[0018]I)擴增產物中加入0.1 μ I熒光染料SYBR green I，直接觀察，染有草莓鑲脈病毒的樣本有沉淀物呈現黃綠色，無草莓鑲脈病毒侵染的樣本透明且呈橘紅色；
[0019]2)常規(guī)電泳和紫外成像方法:取5 μ I擴增產物加入5 μ IH2O進行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外成像技術能夠顯示感染有草莓鑲脈病毒的樣本形成瀑布型條帶。
[0020]本發(fā)明基于環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)的草莓壤脈病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)檢測試劑盒及方法，該試劑盒根據草莓鑲脈病毒的基因保守區(qū)域設計了四個特異性引物，可以特異性的檢測樣品中草莓鑲脈病毒。利用本發(fā)明試劑盒進行檢測，檢測過程快速、靈敏、操作簡便，不需要其他貴重儀器和試劑，特別適合種苗繁育、脫毒培養(yǎng)、田間調查時快速檢測和生產基層技術人員掌握應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為SVBV LAMP各反應溫度擴增產物電泳檢測；圖1中，泳道M.DNA MarkerAL2000 ;泳道 1:60°C ;泳道 2:61°C ;泳道 3:62°C ;泳道 4:63°C ;泳道 5:64°C ;泳道 6:65°C。
[0022]圖2為SVBV LAMP不同反應時間擴增產物電泳檢測；其中，泳道M:DNA MarkerAL2000 ;泳道 I:30min ;泳道 2:45min ;泳道 3:60min ;泳道 4:75min。
[0023]圖3為SVBV LAMP引物FIP/BIP不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M.DNAMarker AL2000 ;泳道 1:1.0μΜ;泳道 2:1.2μΜ;泳道 3:1.4μΜ;泳道 4:1.6μΜ;泳道 5:
1.8 μ Μ。
[0024]圖4為SVBV LAMP弓丨物F3/B3不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M =DNAMarker AL2000 ;泳道 I:0.1 μ M ;泳道2:0.15 μ M ;泳道3:0.2 μ M ;泳道4:0.25 μ M ;泳道5:0.3 μ Μ。
[0025]圖5為SVBV LAMP Mg2+不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M:DNA MarkerAL2000 ;泳道 1:2mM ;泳道 2:4mM ;泳道 3:6mM ;泳道 4:8mM ；5:10mM。
[0026]圖6為SVBV LAMP dNTPs不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M:DNA MarkerAL2000 ;泳道1:0.2mM ;泳道2:0.4mM ;泳道3.0.8mM ;泳道4:1.2mM ;泳道5:1.6mM ;泳道6:
2.0mM。
[0027]圖7為SVBV LAMP betaine不同終濃度擴增產物電泳檢測；其中，泳道M.DNAMarker AL2000 ;泳道 1:0.2M ;泳道2:0.4M ;泳道 3:0.8M ;泳道4:1.0M ;泳道5:1.2M ;泳道6:1.4M。
[0028]圖8為SVBV PCR檢測靈敏度測定；其中，泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道1:提取的DNA原液做模板；泳道2-8依次為DNA原液稀釋10-1、10_2、10' 10_4、10_5、10_6和10'
[0029]圖9為SVBV LAMP檢測的靈敏度測定；其中，泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道1:提取的DNA原液做模板；泳道2-8依次為DNA原液稀釋10' 10_2、10' 10_4、10_5、10_6和10'
[0030]圖10為SVBV LAMP檢測的特異性測定；其中，(a)為LAMP產物的電泳和凝膠成像技術檢測；(b)為LAMP產物加入SYBR green I檢測；泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道I:健康植株樣品DNA ;泳道2-5依次為含有SVBV的植株樣品DNA和SMYEV、SMoV、SCV的cDNA。
【具體實施方式】
[0031]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑公司購買得到的。
[0032]實施例1、草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)環(huán)介導引物及其應用
[0033]一、草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)環(huán)介導引物的獲得
[0034]根據美國NCBI中的GenBank發(fā)布的草莓鑲脈病毒(Strawberry vein bandingvirus)的序列(AY605663，AY955374，FM867860, JN542480，NC001725)，通過軟件 DNAMAN7.0進行同源性分析后找出草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)的外殼蛋白基因保守序列作為模板，使用在線軟件 Primer3Input(http://bioinf0.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)設計LAMP引物,并對設計的引物進行篩選，序列調整，驗證，最終獲得一組敏感性和特異性很高的LAMP引物。引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列如下表1 ;
[0035]表1 SVBV LAMP檢測引物組
[0036]
【權利要求】
1.檢測草莓鑲脈病毒(Strawberryvein banding virus)的專用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成。
2.—種檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)的試劑盒,包括權利要求I所述的專用引物。
3.權利要求1所述專用引物在制備檢測草莓鑲脈病毒(Strawberryvein bandingvirus)的試劑盒中的應用。
4.權利要求1所述專用引物或權利要求2所述試劑盒在鑒定草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)病毒病中的應用。
5.一種檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)或檢測草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus)病毒病感染的方法,包括如下步驟: (1)提取待測生物樣本的基因組DNA； (2)以步驟(1)的基因組DNA為模板，用權利要求1所述的專用引物進行環(huán)介導恒溫擴增； (3)根據步驟(2)的擴增產物鑒定所述待測生物樣本是否含有草莓鑲脈病毒或者是否感染草莓鑲脈病毒病毒病。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于:所述環(huán)介導恒溫擴增的反應程序為:63°CI小時，80°C 10分鐘。`
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述環(huán)介導恒溫擴增的反應體系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所示DNA的濃度均為1.2 μ M，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的濃度均為0.1 μ Μ。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述環(huán)介導恒溫擴增的體系包括:1.2μΜ序列表的序列I所不DNA, 1.2 μ M列表的序列4所不DNA, 0.1 u M序列表的序列2所不0嫩，0.1“]?序列表的序列3所示0嫩，10\88七 buffer2.5ul,2mM MgSO4,1.6mM dNTPs, IMBetaine，8U Bst DNA polymerase, DEPC ddH20，待測生物樣本的基因組DNA,擴增體系總體積為25 μ 10
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述環(huán)介導恒溫擴增產物的檢測方法為下述I)或2)所述的方法: 1)擴增產物中加入0.1 μ I熒光染料SYBR green I，直接觀察，染有草莓鑲脈病毒的樣本有沉淀物呈現黃綠色，無草莓鑲脈病毒侵染的樣本透明且呈橘紅色； 2)常規(guī)電泳和紫外成像方法:取5μ I擴增產物加入5 μ IH2O進行1%瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外成像技術能夠顯示感染有草莓鑲脈病毒的樣本形成瀑布型條帶。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667525SQ201310613488
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權日:2013年11月27日
【發(fā)明者】尚巧霞, 陳柳, 陳笑瑜, 邢冬梅, 魏艷敏, 劉正坪, 趙曉燕, 冉策, 楊建強, 胡學軍, 陳明遠, 祝寧, 韓成貴 申請人:北京農學院