腦膜炎奈瑟氏菌z群的特異性檢測用引物探針組合和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟菌Z群核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。利用本發(fā)明的序列組合或試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸。該試劑盒對腦膜炎奈瑟氏菌Z群的檢測限為200拷貝每反應(yīng)體系。整個(gè)反應(yīng)可在2小時(shí)內(nèi)完成，在疾病監(jiān)測、臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】腦膜炎奈瑟氏菌Z群的特異性檢測用引物探針組合和試劑
合
Sl
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟菌Z群核酸存在的寡核苷酸序列組合，以及包括該組合的試劑盒。利用本發(fā)明的序列組合或試劑盒，可快速檢測樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸。該試劑盒對腦膜炎奈瑟氏菌Z群的檢測限為200拷貝每反應(yīng)體系。整個(gè)反應(yīng)可在2小時(shí)內(nèi)完成，在疾病監(jiān)測、臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【背景技術(shù)】
[0002]腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)是流行性腦脊髓膜炎的病原菌。人類是腦膜炎奈瑟菌的唯一宿主。本菌可定植在人類鼻咽部的粘膜上，稱為攜帶狀態(tài)，在健康成人和兒童中本菌的攜帶率可達(dá)5%-15%。本菌借飛沫經(jīng)空氣傳播，冬末春初為流行高峰，被感染者多為青少年和嬰幼兒。感染后多數(shù)患者呈攜帶狀態(tài)或隱性感染，少數(shù)出現(xiàn)上呼吸道感染癥狀，極少數(shù)發(fā)展成敗血癥，進(jìn)而累及腦、脊髓膜，形成化膿性腦脊髓膜炎，嚴(yán)重者可迅速出現(xiàn)休克和散播性血管內(nèi)凝血，或頻繁痙攣驚厥，進(jìn)而昏迷，不及時(shí)救治病死率極高。腦膜炎奈瑟菌有13種血清群,我國流行的血清群以A群為主，其次為C群，其他血清群如B、Y、W135、Z和X在我國僅有散發(fā)的病例報(bào)導(dǎo)。
[0003]在檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點(diǎn)逐漸呈現(xiàn)出要替代以細(xì)菌培養(yǎng)和血清學(xué)檢測為主的傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和敏感性的基礎(chǔ)。此外，對于已知的致流行性腦脊髓膜炎病原菌的檢測，發(fā)現(xiàn)有一些非A群也導(dǎo)致流行性爆發(fā)的能力，如Z群`腦膜炎奈瑟菌。實(shí)際檢測過程中，對于一例待測樣品，可檢測其中是否有Z群腦膜炎奈瑟菌。
[0004]本發(fā)明分別針對腦膜炎奈瑟氏菌Z群特異的靶序列設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，利用real-time PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在Z群腦膜炎奈瑟氏菌核酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了快速準(zhǔn)確地檢測樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏菌Z群。本發(fā)明提供一種特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸的寡核苷酸序列組合和包含該組合的試劑盒，其特征在于序列組合或試劑盒的PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增的引物為:
Pl:5'- TCGCTATGGTTACGGCATGTAG-3'，
P2:5'- CAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAA-3' ；
Pl和P2為針對腦膜炎奈瑟氏菌Z群基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性引物。
[0006]本發(fā)明的的特征還在于，序列組合或試劑盒的PCR反應(yīng)液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針為:
Probel:5'-X1- CCTCCGGCCCTAGTGCGAAAAA-Y1-3' ；X1, Y1為熒光淬滅基團(tuán)。Probel為針對腦膜炎奈瑟氏菌Z群基因組群特異性保守序列設(shè)計(jì)并經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的特異性探針 。
[0007]本發(fā)明的特征還在于，試劑盒包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。其中PCR反應(yīng)液主要含有上述的引物和探針、反應(yīng)緩沖液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動(dòng)Taq酶，陰性質(zhì)控品為去離子水，陽性質(zhì)控品為含有檢測靶序列的核酸。
[0008]本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案為:序列組合或試劑盒的PCR反應(yīng)液中用于突光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的熒光基團(tuán)分，Probel熒光報(bào)告基團(tuán)X1為Fam，熒光淬滅基團(tuán)Y1為Eclipse。
[0009]本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案為:試劑盒的包含上述一對特異性引物和一條特異性探針，屬于單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，可在同一個(gè)反應(yīng)體系中對腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸進(jìn)行檢測。
[0010]本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案為:試劑盒的PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94°C，2min;進(jìn)入循環(huán)階段:94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
[0011]本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒選用的PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，包括2XPCR緩沖液 10 PlUOmmol/L dNTP 1.0μ1、25Μπιο1/1 引物各 0.5 μ1、10Μπιο1/1 探針 0.2 μ?、熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.4μ1、樣品DNA 2μ1，加滅菌水至終體系20 μ?。
[0012]本發(fā)明提供的試劑盒對腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸的檢測下限為200個(gè)拷貝每反應(yīng)體系。
[0013]本發(fā)明提供的試劑盒可以檢出腦膜炎奈瑟氏菌Z群，但不能檢出非腦膜炎奈瑟氏菌Z群病原體的核酸，說明試劑盒具有很好的特異性。
[0014]本發(fā)明提供的試劑盒2小時(shí)內(nèi)即可完成檢測，可為腦膜炎奈瑟氏菌Z群的疾病監(jiān)測和臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測腦膜炎奈瑟氏菌陽性標(biāo)準(zhǔn)品(Ζ群)的擴(kuò)增曲線圖。從左至右的每組曲線對應(yīng)濃度依次為2Χ105~2Χ IO1拷貝每反應(yīng)體系，試劑盒對腦膜炎奈瑟氏菌Z群的檢測限均為200拷貝每反應(yīng)體系。橫坐標(biāo)為反應(yīng)循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為不同循環(huán)數(shù)熒光檢測信號的Λ Rn值。
[0016]圖2為單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測體系檢測10種細(xì)菌基因組DNA的擴(kuò)增曲線圖。10種細(xì)菌包括:Ζ群腦膜炎奈瑟氏菌和9種陰性對照微生物。Z群腦膜炎奈瑟氏菌出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，而其他9種呼吸道病原微生物未出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。需要指出的是，這里列出的實(shí)施例僅僅為示例性說明的目的，而不應(yīng)將其解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。其中使用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實(shí)施例中具體選擇的試劑，應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇其他公司的相應(yīng)試劑以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0018]、引物和TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成
利用Blast工具對Genbank和國內(nèi)外文獻(xiàn)中的腦膜炎奈瑟氏菌Z群基因組序列進(jìn)行分析，分別選擇其穩(wěn)定的保守區(qū)域作為檢測靶序列。腦膜炎奈瑟氏菌Z群檢測靶序列為Ctra基因；并針對檢測靶序列設(shè)計(jì)和合成引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶生物公司合成，腦膜炎奈瑟氏菌Z群的檢測探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)；3’端標(biāo)記Eclipse熒光淬滅基團(tuán)。
[0019]、檢測菌種的準(zhǔn)備
本實(shí)施例中所使用的Z群腦膜炎奈瑟氏菌以及其他陰性對照菌株(流腦A、B、C、Y、W135、肺炎鏈球菌、B型流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體)均購買于中國藥品生物制品檢定所。
[0020]、菌株DNA的抽提
選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit (貨號:51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參考操作說明書。
[0021]、引物和探針的篩選 采用設(shè)計(jì)的引物和探針檢測提取的Z群腦膜炎奈瑟氏菌和陰性對照菌株的基因組DNA，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，篩選出靈敏度、特異性和重復(fù)性最佳的引物探針組合(見序列表，腦膜炎奈瑟氏菌(Z群正向引物p1、反向引物p2和探針probeDo
[0022]、標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備
利用Pl和p2引物擴(kuò)增腦膜炎奈瑟氏菌Z群基因組DNA，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD_18T載體，轉(zhuǎn)化DH5ci大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質(zhì)粒，利用紫外可見分光光度計(jì)分別測定在波長260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計(jì)算質(zhì)粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋至10個(gè)拷貝每微升，制備腦膜炎奈瑟氏菌Z群的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023]、反應(yīng)條件優(yōu)化
對引物、探針、酶等要素逐一優(yōu)化，確定的反應(yīng)體系為:2XPCR緩沖液10 μ?UOmmol/L dNTP 1.0μ1、25Μπιο1/1 引物各 0.5 μ1、10Μπιο1/1 探針 0.2 μ?、Takara 聚合酶混合物
0.4μ1、模板2ul，加滅菌水至終體系20 μ?。
[0024]根據(jù)擴(kuò)增片段長、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應(yīng)退火溫度和延伸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定的循環(huán)參數(shù)為:94°C，2min;進(jìn)入循環(huán)階段:94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在退火階段采集熒光信號。
[0025]在擴(kuò)增結(jié)束后按同一條件分析數(shù)據(jù)，確定各樣品的Ct值。
[0026]、檢測限的評價(jià)
以上述5中的陽性標(biāo)準(zhǔn)品評價(jià)本發(fā)明的提供的試劑盒的檢測限，陽性標(biāo)準(zhǔn)品濃度為:I X IO5Copies/ μ I，I X IO4Copies/ μ I, I X IO3Copies/ μ I, I X IO2Copies/ μ I，I X IO1c0Pies/μ 1，本發(fā)明提供的試劑盒對腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸的檢測下限為200個(gè)拷貝每反應(yīng)體系。
[0027]8、檢測特異性的評價(jià)
以上述菌株DNA為模板評價(jià)了本試劑盒的特異性。對腦膜炎奈瑟氏菌Z群DNA進(jìn)行檢測時(shí)均可見明確擴(kuò)增曲線，對上述9種其他咽部常見病原微生物DNA檢測時(shí)，未產(chǎn)生陽性擴(kuò)增曲線，說明我們使用的探 針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應(yīng)。
[0028]盡管上文中以優(yōu)選的方式，通過具體實(shí)施例示例性說明了本發(fā)明的某些實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本發(fā)明并不限于上面所公開的實(shí)施方式，而是可以根據(jù)本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的知識對其進(jìn)行修改，所作修改不會超出本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。例如，本發(fā)明所使用的熒光實(shí)時(shí)PCR也可以根據(jù)需要采用說明書中所列出的實(shí)施例中指出的熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)以外的標(biāo)記物質(zhì)，如Tet、FAM、HEX、TAMRA, ROX、Cy3、TxRd、JOE等標(biāo)記物；或使用Taqman技術(shù)之外的其他標(biāo)記體系,例如MGB探針、分子信標(biāo)MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等熒光探針標(biāo)記技術(shù)；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發(fā)明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的基因的存在，進(jìn)而特異性地檢測腦膜炎奈瑟氏菌Z群的存在。所以，這些本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求書所限定`。
【權(quán)利要求】
1.一種用于特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟氏菌Z群的引物組合，這套序列組合特征在于包括下列引物:
Pl:5'- TCGCTATGGTTACGGCATGTAG-3'，
P2:5'- CAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAA-3'?
2.一種用于特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟氏菌Z群的引物和寡核苷酸探針組合，其中引物為權(quán)利要求1所述的引物，寡核苷酸探針為:
Probel:5'-Xr CCTCCGGCCCTAGTGCGAAAAA-Y1-3' ； X1為熒光報(bào)告基團(tuán)，Y1為熒光淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述，這套序列組合特征還在于，其中Probel熒光報(bào)告基團(tuán)X1為Fam，熒光淬滅基團(tuán)Y1S Eclipse。
4.如權(quán)利要求2所述，這套序列組合特征還在于，可用于單重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測，即一個(gè)反應(yīng)體系可檢測出腦膜炎奈瑟氏菌Z群。
5.一種用于特異性檢測樣品中腦膜炎奈瑟氏菌Z群核酸的試劑盒，其中包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其特征在于PCR反應(yīng)液中用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物序列如下:
Pl:5'- TCGCTATGGTTACGGCATGTAG-3',
P2:5'- CAGATTGTTGCCCTAAAGAGACAA-3'。
6.如權(quán)利要求5所述的 試劑盒,其特征在于PCR反應(yīng)液中用于突光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針的序列如下:
Probel:5'-Xr CCTCCGGCCCTAGTGCGAAAAA-Y1-3' ； X1為熒光報(bào)告基團(tuán)，Y1為熒光淬滅基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)液中用于熒光信號監(jiān)測的寡核苷酸探針=Probel熒光報(bào)告基團(tuán)X1為Fam，熒光淬滅基團(tuán)Y1為Eclipse。
8.如權(quán)利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)體系為20μ 1，包括2XPCR緩沖液 10 Pl、10mmol/L dNTP 1.0μ1、25Μπιο1/1 引物各 0.5 μ1、10Μπιο1/1 探針 0.2 μ?、熱啟動(dòng)Taq酶混合液0.4μ1、樣品DNA 2μ1，加滅菌水至終體系20 μ?。
9.如權(quán)利要求5所述的的試劑盒，其特征還在于PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為: 94°C,2min;進(jìn)入循環(huán)階段:94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號】C12N15/11GK103642901SQ201310535717
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】丁小靜, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:江蘇和創(chuàng)生物科技有限公司