專利名稱：含有腦膜炎奈瑟球菌b血清群外膜蛋白質(zhì)的外膜囊(omv)疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)B血清群(NmB)的疫苗。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌是一種無(wú)運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陰性雙球菌人病原體。它群居于咽部，可引起腦膜炎，有時(shí)可在不出現(xiàn)腦膜炎的情況下發(fā)生敗血病。在美國(guó)，每年的發(fā)病率為0.6-1/100,000人，在戰(zhàn)爭(zhēng)期間發(fā)病率會(huì)更高〔參見(jiàn)Lieberman等人(1996)，JAMA，275(19)1499-1503；Schuchat等人(1997)，NEngl J Med，337(14)970-976〕。在發(fā)展中國(guó)家，地方性發(fā)病比例會(huì)更高，在疫疾流行期間，發(fā)病率可達(dá)每年500例/100,000人。死亡率極高，在美國(guó)是10-20％，在發(fā)展中國(guó)家更高。在引入抗流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)的聯(lián)合疫苗后，腦膜炎奈瑟球菌就成了引起美國(guó)所有年齡段的人的細(xì)菌性腦膜炎的主要原因〔Schuchat等人(1997)，同上〕。
根據(jù)該菌的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定出12種腦膜炎奈瑟球菌的血清群。目前使用的腦膜炎球菌疫苗是由血清群A、C、Y和W135組成的四價(jià)多糖疫苗。在針對(duì)流感嗜血菌疫苗的成功之后，已開(kāi)發(fā)了針對(duì)血清群A和C的偶聯(lián)疫苗。
然而腦膜炎球菌B仍是一個(gè)問(wèn)題。這種血清群導(dǎo)致約占美國(guó)、歐洲和南美腦膜炎總數(shù)的50％。不能采用多糖方法，因?yàn)閙enB莢膜多糖是一種α(2-8)-相連的N-乙酰神經(jīng)氨酸的聚合物，它也存在于哺乳動(dòng)物組織中。這就導(dǎo)致了對(duì)抗原的耐免，事實(shí)上如果引發(fā)應(yīng)答，該應(yīng)答將會(huì)是防自身的，因此是不良的。為了避免引發(fā)自體免疫和引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，將莢膜多糖進(jìn)行例如化學(xué)修飾，用N-丙酰基替代N-乙?；?，而不改變其特異性抗原性〔Romero & Outschoom(1994)ClinMicrobiol Rev 7(4)559-575)。
已由挪威國(guó)家公共衛(wèi)生委員會(huì)制備了抗B血清群的有效的外膜囊(OMV)疫苗〔如Bjune等人(1991)，Lancet，338(8775)1093-96〕。雖然這種疫苗是安全的，并可預(yù)防NmB發(fā)病，但是它的療效受到用于制備這種疫苗的菌株的限制。也已報(bào)道了以外膜制劑為基礎(chǔ)的其它疫苗。本發(fā)明的目的是將這些疫苗的藥效擴(kuò)大至其它菌株。
發(fā)明的公開(kāi)令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)將已經(jīng)確定的成分加到OMV疫苗中可明顯地?cái)U(kuò)大它們的藥效范圍。
因而，本發(fā)明提供一種組合物，它含有(a)NmB外膜制劑，和(b)下述免疫原性成分中的一種或多種·WO99/57280中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/36544中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/24578中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO00/66791中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·Tettelin等人〔Science(2000)，2871809-1815〕公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·Parkhill等人〔Nature(2000)，404502-506〕公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO97/28273中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO96/29412中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO95/03413中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/31132中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/58683中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/55873中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·腦膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白或Omp85蛋白。
如果所述組合物含有WO99/24578中公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文中以下的氨基酸序列SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、1 80、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、和892〔或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白質(zhì)〕；如果所述組合物含有WO99/36544中公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有含有選自該文中以下氨基酸序列SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、和90〔或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白質(zhì)〕；如果所述組合物含有Tettelin等人公開(kāi)的蛋白質(zhì)(即由該文公開(kāi)的一種基因編碼的蛋白質(zhì))，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自NMB0001到NMB2160的一條氨基酸序列〔或者含有這2160個(gè)基因中的一個(gè)或多個(gè)的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與這2160個(gè)基因之一具有序列同一性(較佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有Parkhill等人公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文中公開(kāi)的2121個(gè)編碼序列的一個(gè)氨基酸序列〔或者含有這2121個(gè)序列的一個(gè)或多個(gè)的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與這2121個(gè)序列中的一個(gè)具有序列同一性(較佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有WO99/57280中公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文中的以下氨基酸序列SEQ ID 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452、454、456、458、460、462、464、466、468、470、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、506、508、510、512、514、516、518、520、522、524、526、528、530、532、534、536、538、540、542、544、546、548、550、552、554、556、558、560、562、564、566、568、570、572、574、576、578、580、582、584、586、588、590、592、594、596、598、600、602、604、606、608、610、612、614、616、618、620、622、624、626、628、630、632、634、636、638、640、642、644、646、648、650、652、654、656、658、660、662、664、666、668、670、672、674、676、678、680、682、684、686、688、690、692、694、696、698、700、702、704、706、708、710、712、714、716、718、720、722、724、726、728、730、732、734、736、738、740、742、744、746、748、750、752、754、756、758、760、762、764、766、768、770、772、774、776、778、780、782、784、786、788、790、792、794、796、798、800、802、804、806、808、810、812、814、816、818、820、822、824、826、828、830、832、834、836、838、840、842、844、846、848、850、852、854、856、858、860、862、864、866、868、870、872、874、876、878、880、882、884、886、888、890、892、894、896、898、900、902、904、906、908、910、912、914、916、918、920、922、924、926、928、930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、956、958、960、962、964、966、968、970、972、974、976、978、980、982、984、986、988、990、992、994、996、998、1000、1002、1004、1006、1008、1010、1012、1014、1016、1018、1020、1022、1024、1026、1028、1030、1032、1034、1036、1038、1040、1042、1044、1046、1048、1050、1052、1054、1056、1058、1060、1062、1064、1066、1068、1070、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1118、1120、1122、1124、1126、1128、1130、1132、1134、1136、1138、1140、1142、1144、1146、1148、1150、1152、1154、1156、1158、1160、1162、1164、1166、1168、1170、1172、1174、1176、1178、1180、1182、1184、1186、1188、1190、1192、1194、1196、1198、1200、1202、1204、1206、1208、1210、1212、1214、1216、1218、1220、1222、1224、1226、1228、1230、1232、1234、1236、1238、1240、1242、1244、1246、1248、1250、1252、1254、1256、1258、1260、1262、1264、1266、1268、1270、1272、1274、1276、1278、1280、1282、1284、1286、1288、1290、1292、1294、1296、1298、1300、1302、1304、1306、1308、1310、1312、1314、1316、1318、1320、1322、1324、1326、1328、1330、1332、1334、1336、1338、1340、1342、1344、1346、1348、1350、1352、1354、1356、1358、1360、1362、1364、1366、1368、1370、1372、1374、1376、1378、1380、1382、1384、1386、1388、1390、1392、1394、1396、1398、1400、1402、1404、1406、1408、1410、1412、1414、1416、1418、1420、1422、1424、1426、1428、1430、1432、1434、1436、1438、1440、1442、1444、1446、1448、1450、1452、1454、1456、1458、1460、1462、1464、1466、1468、1470、1472、1474、1476、1478、1480、1482、1484、1486、1488、1490、1492、1494、1496、1498、1500、1502、1504、1506、1508、1510、1512、1514、1516、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1530、1532、1534、1536、1538、1540、1542、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1568、1570、1572、1574、1576、1578、1580、1582、1584、1586、1588、1590、1592、1594、1596、1598、1600、1602、1604、1606、1608、1610、1612、1614、1616、1618、1620、1622、1624、1626、1628、1630、1632、1634、1636、1638、1640、1642、1644、1646、1648、1650、1652、1654、1656、1658、1660、1662、1664、1666、1668、1670、1672、1674、1676、1678、1680、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1706、1708、1710、1712、1714、1716、1718、1720、1722、1724、1726、1728、1730、1732、1734、1736、1738、1740、1742、1744、1746、1748、1750、1752、1754、1756、1758、1760、1762、1764、1766、1768、1770、1772、1774、1776、1778、1780、1782、1784、1786、1788、1790、1792、1794、1796、1798、1800、1802、1804、1806、1808、1810、1812、1814、1816、1818、1820、1822、1824、1826、1828、1830、1832、1834、1836、1838、1840、1842、1844、1846、1848、1850、1852、1854、1856、1858、1860、1862、1864、1866、1868、1870、1872、1874、1876、1878、1880、1882、1884、1886、1888、1890、1892、1894、1896、1898、1900、1902、1904、1906、1908、1910、1912、1914、1916、1918、1920、1922、1924、1926、1928、1930、1932、1934、1936、1938、1940、1942、1944、1946、1948、1950、1952、1954、1956、1958、1960、1962、1964、1966、1968、1970、1972、1974、1976、1978、1980、1982、1984、1986、1988、1990、1992、1994、1996、1998、2000、2002、2004、2006、2008、2010、2012、2014、2016、2018、2020、2022、2024、2026、2028、2030、2032、2034、2036、2038、2040、2042、2044、2046、2048、2050、2052、2054、2056、2058、2060、2062、2064、2066、2068、2070、2072、2074、2076、2078、2080、2082、2084、2086、2088、2090、2092、2094、2096、2098、2100、2102、2104、2106、2108、2110、2112、2114、2116、2118、2120、2122、2124、2126、2128、2130、2132、2134、2136、2138、2140、2142、2144、2146、2148、2150、2152、2154、2156、2158、2160、2162、2164、2166、2168、2170、2172、2174、2176、2178、2180、2182、2184、2186、2188、2190、2192、2194、2196、2198、2200、2202、2204、2206、2208、2210、2212、2214、2216、2218、2220、2222、2224、2226、2228、2230、2232、2234、2236、2238、2240、2242、2244、2246、2248、2250、2252、2254、2256、2258、2260、2262、2264、2266、2268、2270、2272、2274、2276、2278、2280、2282、2284、2286、2288、2290、2292、2294、2296、2298、2300、2302、2304、2306、2308、2310、2312、2314、2316、2318、2320、2322、2324、2326、2328、2330、2332、2334、2336、2338、2340、2342、2344、2346、2348、2350、2352、2354、2356、2358、2360、2362、2364、2366、2368、2370、2372、2374、2376、2378、2380、2382、2384、2386、2388、2390、2392、2394、2396、2398、2400、2402、2404、2406、2408、2410、2412、2414、2416、2418、2420、2422、2424、2426、2428、2430、2432、2434、2436、2438、2440、2442、2444、2446、2448、2450、2452、2454、2456、2458、2460、2462、2464、2466、2468、2470、2472、2474、2476、2478、2480、2482、2484、2486、2488、2490、2492、2494、2496、2498、2500、2502、2504、2506、2508、2510、2512、2514、2516、2518、2520、2522、2524、2526、2528、2530、2532、2534、2536、2538、2540、2542、2544、2546、2548、2550、2552、2554、2556、2558、2560、2562、2564、2566、2568、2570、2572、2574、2576、2578、2580、2582、2584、2586、2588、2590、2592、2594、2596、2598、2600、2602、2604、2606、2608、2610、2612、2614、2616、2618、2620、2622、2624、2626、2628、2630、2632、2634、2636、2638、2640、2642、2644、2646、2648、2650、2652、2654、2656、2658、2660、2662、2664、2666、2668、2670、2672、2674、2676、2678、2680、2682、2684、2686、2688、2690、2692、2694、2696、2698、2700、2702、2704、2706、2708、2710、2712、2714、2716、2718、2720、2722、2724、2726、2728、2730、2732、2734、2736、2738、2740、2742、2744、2746、2748、2750、2752、2754、2756、2758、2760、2762、2764、2766、2768、2770、2772、2774、2776、2778、2780、2782、2784、2786、2788、2790、2792、2794、2796、2798、2800、2802、2804、2806、2808、2810、2812、2814、2816、2818、2820、2822、2824、2826、2828、2830、2832、2834、2836、2838、2840、2842、2844、2846、2848、2850、2852、2854、2856、2858、2860、2862、2864、2866、2868、2870、2872、2874、2876、2878、2880、2882、2884、2886、2888、2890、2892、2894、2896、2898、2900、2902、2904、2906、2908、2910、2912、2914、2916、2918、2920、2922、2924、2926、2928、2930、2932、2934、2936、2938、2940、2942、2944、2946、2948、2950、2952、2954、2956、2958、2960、2962、2964、2966、2968、2970、2972、2974、2976、2978、2980、2982、2984、2986、2988、2990、2992、2994、2996、2998、3000、3002、3004、3006、3008、3010、3012、3014、3016、3018和3020〔或含有一種或多種這些SEQ ID的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或含有與這些SEQ ID之一有序列相同性(宜高于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有WO99/28273公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳是該文獻(xiàn)在圖4或

圖13中公開(kāi)的蛋白質(zhì)。
如果所述組合物含有WO96/29412公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文獻(xiàn)公開(kāi)的第1-8條序列中的一條氨基酸序列〔或者含有這些序列的一條或多條免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與這些序列中的一條具有序列同一性(較佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有WO95/03413公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文獻(xiàn)公開(kāi)的第1-23條序列中的一條氨基酸序列〔或者含有這些序列的一條或多條免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與這些序列中的一條具有序列同一性(較佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有WO99/31132公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文獻(xiàn)公開(kāi)的SEQ ID 2的氨基酸序列〔或者含有該序列的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與該序列具有序列同一性(較佳大于5O％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有WO99/58683中公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文獻(xiàn)公開(kāi)的SEQ ID 2或SEQ ID 4的氨基酸序列〔或者含有SEQ ID 2或SEQID 4的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與SEQ ID 2或SEQ ID 4具有序列同一性(較佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
如果所述組合物含有WO99/55873中公開(kāi)的蛋白質(zhì)，則所述蛋白質(zhì)較佳含有選自該文獻(xiàn)公開(kāi)的SEQ ID 2或SEQ ID 4的氨基酸序列〔或者含有SEQ ID 2或SEQID 4的免疫原性片段的蛋白質(zhì)，或者含有與SEQ ID 2或SEQ ID 4具有序列同一性(較佳大于50％，如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)的序列的蛋白質(zhì)〕。
可在Wiertz等人〔Infect.Immun.(1996)，61298-304〕中找到Opa和PorA的詳細(xì)描述。PilC在Nassif等人〔PNAS USA(1994)，913769-73〕的文獻(xiàn)中公開(kāi)。Omp85在Manning等人〔Microb.Pathog.(1998)，2511-21〕的文獻(xiàn)中公開(kāi)。TbpA和TbpB在Ala＇Aldeen和Borriello(Vaccine(1996)，1449-53〕以及Legrain等人〔Protein Expr Purif(1995)，6570-578〕的文獻(xiàn)中公開(kāi)。
用于組分(b)的較佳蛋白質(zhì)是·蛋白質(zhì)＇919＇，由WO99/57280的SEQ ID 3069-3074和SEQ ID 3027-3241代表(還可參見(jiàn)該文中的圖23和實(shí)施例15)；·蛋白質(zhì)＇235＇，由WO99/57280的SEQ ID 869-874和3149-3178代表(還可參見(jiàn)該文中的圖20和實(shí)施例12)；·蛋白質(zhì)＇519＇，由由WO99/57280的SEQ ID 3045-3056和3158-3206代表(還可參見(jiàn)該文中的圖22和實(shí)施例14)；·蛋白質(zhì)＇225＇，由WO99/57280的SEQ ID 793-804和3115-3148代表(還可參見(jiàn)該文中的圖19和實(shí)施例11)；·蛋白質(zhì)＇ORF40＇，由WO99/36544的實(shí)施例1(SEQ ID 1-6)代表(還可參見(jiàn)WO00/66741的圖1，還可參見(jiàn)WO99/31132和WP99/58683)；·蛋白質(zhì)＇287＇，由WO99/57280的實(shí)施例9代表(還可參見(jiàn)該文中的SED ID1199-1204、3103-3108和3179-3184)；·蛋白質(zhì)＇ORF1＇，由WO99/24578的實(shí)施例77(SEQ ID 647-654)代表(還可參見(jiàn)WO99/55873和登記號(hào)AJ242535)；·蛋白質(zhì)＇ORF4＇，由WO99/24578的實(shí)施例26(SEQ ID 215-226)代表(還可參見(jiàn)WO00/66741的圖2)；·蛋白質(zhì)＇ORF46＇，由WO99/24578的實(shí)施例55(SEQ ID 457-466)代表(還可參見(jiàn)WO00/66741的圖12)。
所述組合物的組分(b)較佳是NmB蛋白。較佳的是，組分(b)包含從獲得組分(a)的OMV的不同NmB菌株獲得的蛋白質(zhì)，即所述組分(a)中的OMV較佳由從不同NmB菌株得到的免疫原性組分(b)補(bǔ)充。
可使一種或多種上述成分(或者全部)吸附到Al(OH)3上。
外膜制劑組分本發(fā)明的組合物包含作為組分(a)的NmB外膜制劑。這種制品較佳成外膜囊(OMV)的形式。
從NmB制備OMV在本領(lǐng)域中是周知的。獲得適當(dāng)?shù)闹破返姆椒ㄔ谌缦挛墨I(xiàn)中公開(kāi)Claassen等人〔Vaccine(1996)，141001-1008〕；Cartwright等人〔Vaccine(1999)，172612-2619)；Peeters等人〔Vaccine(1996)，141009-1015〕；Fu等人〔Biotechnology NY(1995)，12170-74〕；Davies等人〔J.Immunol.Meth.(1990)，134215-225〕；Saunders等人〔Infect.Immun.(1999)，67113-119〕；Draabick等人〔Vaccine(2000)，18160-172〕；Moreno等人〔Infect.Immun.(1985)，47527-533〕；Milagres等人〔Infect.Immun.(1994)，624419-4424〕；Naess等人〔Infect.Immun.(1998)，66959-965〕；Rosenqvist等人〔Dev.Biol.Stand.(1998)，92323-333〕；Haneberg等人〔Infect.Immun.(1998)，661334-41〕；Andersen等人〔Vaccine(1997)，151225-34〕；Bjune等人〔Lancer(1991)，3381093-96)等等。
OMV較佳是NmB的脫氧膽酸鹽抽提產(chǎn)物(即通過(guò)脫氧膽酸鹽抽提NmB獲得的產(chǎn)物)。Fredriksen等人〔MenB-疫苗“Folkehelsa”一種抗B型腦膜炎球菌疾病的外膜囊疫苗的制備、鑒定和控制(1991)，NIPH Ann.，14(2)67-80〕。
用于從中抽提OMV的較佳菌株是腦膜炎奈瑟球菌的44/76菌株(B15P1.7，16P5.5L3、7、9)。
關(guān)于OMV組分的更詳細(xì)描述可在以下文獻(xiàn)中查索如Bjune等人〔Lancet(1991)，338(8775)1093-96〕，或Fredriksen等人〔抗B型腦膜炎球菌疾病的外膜囊疫苗MenB-疫苗“Folkehelsa”中的高分子量組分的鑒定，Pathobiologyand immunobiology of Neisseriaceae的第818-824頁(yè)(Cinde-Glez等人編輯)，ISBN，968-6502-13-0〕。
所述OMV組分可被吸附到氫氧化鋁佐劑上。較佳的蛋白質(zhì)佐劑比為1∶67(wt/wt)。
人用疫苗的標(biāo)準(zhǔn)劑型劑含有25μg蛋白質(zhì)、2μg LPS和1.67mg Al(OH)3，可以0.5ml的體積注射到三角肌中。
可對(duì)所述OMV組分(如采用脫氧膽酸鹽抽提法獲得的)進(jìn)行處理，以除去某些成分。例如，可除去熱原成分或毒性成分(如LPS)。
較佳的是，如Fredfiksen等人〔Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae的第818-824頁(yè)〕所述，所述OMV組分應(yīng)保留80kDa的抗原成分。
更佳的是，所述OMV應(yīng)保留含有一種或多種下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)SEQID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 13〔或者(i)與SEQ ID3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11、SEQ ID 13具有序列同一性的蛋白質(zhì)——根據(jù)具體的序列，序列同一性的程度較佳大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或以上)，該蛋白質(zhì)包括突變體和等位基因變異體，或者(ii)含有SEQ ID 1、SEQ ID 3、SEQ ID 5、SEQ ID 7、SEQ ID 9、SEQ ID 11或SEQ ID13的免疫原性片段的蛋白質(zhì)——該片段應(yīng)含有對(duì)應(yīng)序列上的至少n個(gè)連續(xù)的氨基酸，根據(jù)具體的序列，n是7或以上(如8、10、12、14、16、18、20或以上)〕。
將組分(a)和(b)混合通過(guò)使組分(a)與外膜制劑簡(jiǎn)單地混合〔如通過(guò)使ORF4與挪威(Norwegian)OMV混合〕可混合組分(a)和(b)。
或者，以細(xì)菌在其外膜產(chǎn)生(較佳高產(chǎn)量)組分(a)的方式對(duì)細(xì)菌進(jìn)行處理而將這兩種組分混合——從這種重組細(xì)菌獲得的外膜制劑將同時(shí)含有組分(a)和組分(b)。
在此方法中用于處理的合適細(xì)菌包括腦膜炎奈瑟球菌(任何血清群或菌株)、乳酰胺奈瑟球菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)或任何其它未定型的奈瑟球菌。也可使用其它革蘭氏陰性菌，如大腸埃希桿菌、沙門菌屬(Salmonella)、志賀菌屬(Shigella)、博代桿菌屬(Bordetella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、螺桿菌屬(Helicobacter)等等。轉(zhuǎn)化方法在本領(lǐng)域中是周知的。
多價(jià)疫苗視需要，本發(fā)明的組合物還可含有一種或多種下述組分·抗腦膜炎奈瑟球菌A血清群的保護(hù)性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌C血清群的保護(hù)性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌Y血清群的保護(hù)性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌W血清群的保護(hù)性抗原；·抗流感嗜血桿菌的保護(hù)性抗原；·抗肺炎球菌(pneumococcus)的保護(hù)性抗原；·抗白喉的保護(hù)性抗原；
·抗破傷風(fēng)的保護(hù)性抗原；·抗百日咳的保護(hù)性抗原；·抗幽門螺桿菌的保護(hù)性抗原；·抗脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)性抗原；和/或·抗B型肝炎病毒的保護(hù)性抗原。
這些任選的成分的較佳例子是·抗腦膜炎奈瑟球菌A血清群的多糖抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌C血清群的多糖抗原，如Costantino等人(1992) Vaccine，10691-698中所述；·抗腦膜炎奈瑟球菌Y血清群的多糖抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌W血清群的多糖抗原；·抗流感嗜血桿菌的多糖抗原；·抗肺炎球菌的多糖抗原；·抗白喉的保護(hù)性抗原，由白喉毒素組成，如CRM197突變體〔如Del Guidice等人(1998)，MolecularAspects of Medicine，191-70〕；·抗破傷風(fēng)保護(hù)性抗原，由破傷風(fēng)毒素組成〔如Wassilak和Orenstein，Vaccines(Plotkin和Mortimer編輯)的第4章，1988〕；·抗百日咳的保護(hù)性抗原，含有百日咳全毒素(PT)和絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)，視需要還可含有pertactin和/或凝集原2和凝集原3〔如Gustafsson等人(1996)，N.Engl.J.Med.，334349-355；Rappuoli等人(1991)，TIBTECH，9232-238〕；·抗幽門螺桿菌的保護(hù)性抗原，含有一種或多種CagA(如WO93/18150)、VacA(如WO93/18150)、NAP(如WO99/53310)、HopX(如WO98/04702)、HopY(如WO98/04702)、脲酶；·抗B型肝炎病毒的保護(hù)性抗原，由HBV表面抗原和/或HBV核心抗原組成。
當(dāng)組合物含有抗白喉的抗原時(shí)，這種組合物宜含有抗破傷風(fēng)和脊髓灰質(zhì)炎的抗原。當(dāng)組合物含有抗破傷風(fēng)的抗原時(shí)，該組合物宜含有抗白喉和脊髓灰質(zhì)炎的抗原。當(dāng)組合物含有抗脊髓灰質(zhì)炎的抗原時(shí)，該組合物宜含有抗白喉和破傷風(fēng)的抗原。
百日咳毒素是毒素蛋白，當(dāng)存在于組合物中時(shí)，宜將其去毒。去毒化可通過(guò)化學(xué)和/或遺傳方法進(jìn)行。優(yōu)選的去過(guò)毒的突變體是9K/129G雙突變體〔如，Rappuoli(1997)Nature Medicine 3374-376〕。
當(dāng)組合物含有以不同新生和成熟形式存在的蛋白質(zhì)時(shí)，宜選用該蛋白質(zhì)的成熟形式。例如，當(dāng)含有NspA時(shí)，(WO96/29412；還可參見(jiàn)Martin等人(1997)J.Exp.med1851173-1183)宜選用沒(méi)有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)成熟形式。
當(dāng)組合物含有多糖抗原時(shí)，宜將多糖偶聯(lián)于載體蛋白。
治療、預(yù)防和診斷本發(fā)明的組合物較佳是一種疫苗。本發(fā)明的疫苗可以是預(yù)防性的(即預(yù)防感染)或治療性的(即感染后治療疾病)。
本發(fā)明還提供了用作藥劑(宜為疫苗)或作為診斷試劑的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的組合物在生產(chǎn)下列物質(zhì)中的應(yīng)用(i)用于治療或預(yù)防奈瑟球菌屬細(xì)菌感染的藥劑；(ii)用于檢測(cè)奈瑟球菌屬細(xì)菌或檢測(cè)抗奈瑟球菌屬細(xì)菌抗體是否存在的診斷試劑；和/或(iii)用于產(chǎn)生抗奈瑟球菌屬細(xì)菌的抗體的試劑。所述奈瑟球菌屬細(xì)菌可以是任何物種或菌株(例如淋病奈瑟球菌，N.gonorrhoeae)，但優(yōu)選腦膜炎奈瑟球菌，尤其是血清群B。
本發(fā)明還提供了一種治療患者的方法，該方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明的組合物。該方法宜為免疫法。
方法根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供各種方法。
給出生產(chǎn)本發(fā)明組合物的一種方法，包括從腦膜炎奈瑟球菌抽提(如脫氧膽酸鹽抽提)出OMV。
序列表序列表中的序列如下


實(shí)施本發(fā)明的方式以下是為了實(shí)施本發(fā)明(如將公開(kāi)的序列用于免疫接種或診斷)而可能使用到的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和方法的歸納。這一歸納并不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，而是給出可能使用到而非必需的實(shí)施例。
綱要除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明的實(shí)施將使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)都是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所掌握的。這些技術(shù)在下述文獻(xiàn)中有充分的描述如Sambrook的Molecular Cloning；A LaboratoryManual，第二版(1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N Glover編輯，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編輯，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編輯，1986)；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL出版社，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，尤其是第154和155卷；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Mayer和Walker編輯(1987)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein PurificationPrinciples and Practice，第二版(Springer-Verlag，N.Y.)和Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編輯，1986)。
在本說(shuō)明書(shū)中使用核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫(xiě)。
可采用各種方法制備本發(fā)明使用的蛋白質(zhì)(如重組表達(dá)、從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化、化學(xué)合成等)，并將其制成各種形式(如天然的、融合的等)。較佳的是以基本純凈的形式制備(即基本上沒(méi)有其它奈瑟球菌或其它宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì))。
可采用許多方法制備用于本發(fā)明的核酸(如化學(xué)合成、從基因組或cDNA庫(kù)獲得、從生物體自身獲得等)，并且所制得的核酸可以成各種形式(如單鏈、雙鏈、載體、探針等)。術(shù)語(yǔ)“核酸”包括DNA和RNA，還有它們的類似物(如那些含有修飾的骨架的核酸)，以及肽核酸(PNA)等。
定義當(dāng)組合物中X+Y總重量的至少85％是X時(shí)，則稱含有X的組合物“基本無(wú)Y”。較佳地，X占組合物中X+Y總重量的至少約90％，更佳地為至少約95％或者甚至99％(重量)。
術(shù)語(yǔ)“包含”指“含有”和“由......構(gòu)成”，例如“包含”X的組合物可以完全由X構(gòu)成，或者可以含有X之外的物質(zhì)，例如X+Y。
術(shù)語(yǔ)“異源”指在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起的兩種生物學(xué)組分。這種組分可以是宿主細(xì)胞、基因、或調(diào)控區(qū)如啟動(dòng)子。盡管異源組分在自然界中發(fā)現(xiàn)不在一起，但是它們能一起起作用，例如當(dāng)與某基因異源的一種啟動(dòng)子與該基因操作性相連時(shí)。另一個(gè)例子是奈瑟球菌序列與小鼠宿主細(xì)胞異源。另一例子是來(lái)自相同或不同蛋白質(zhì)的兩個(gè)表位，它們已經(jīng)以自然界沒(méi)有的排列方式組裝在一個(gè)蛋白質(zhì)中。
“復(fù)制起點(diǎn)”是啟動(dòng)和調(diào)節(jié)多核苷酸(例如表達(dá)載體)復(fù)制的一種多核苷酸序列。復(fù)制起點(diǎn)可作為細(xì)胞內(nèi)多核苷酸復(fù)制的自主性單位，能在其自身的控制下進(jìn)行復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)是載體在特定宿主細(xì)胞中復(fù)制所需要的。有了某一復(fù)制起點(diǎn)，表達(dá)載體就能在細(xì)胞中合適蛋白的存在下高拷貝數(shù)地復(fù)制。這些起點(diǎn)的例子是在酵母中有效的自主復(fù)制序列；以及在COS-7細(xì)胞中有效的病毒性T-抗原。
較佳采用在MPSRCH程序(Oxford Molecular)中執(zhí)行的Smith-Waterman同一性檢索算法測(cè)定蛋白質(zhì)間的同一性，使用參數(shù)缺口罰分(gap open penalty)＝12和缺口延伸罰分(gap extension penalty)＝1進(jìn)行缺口仿射搜索(affine gap search)。通常，兩個(gè)蛋白質(zhì)有50％以上的同一性即可認(rèn)為它們?cè)诠δ苌舷喈?dāng)。
核酸分子或提供核酸序列的區(qū)域的“等位基因變異體”在本文中指基本上在另一基因組或第二種分離物的基因組中的相同位置產(chǎn)生、并且由于天然變異(如突變或重組)而產(chǎn)生與所述基因組具有類似而非相同的核酸序列的核酸分子或區(qū)域。編碼區(qū)域的等位基因變異體一般編碼活性與由與它比較的基因編碼的蛋白質(zhì)類似的蛋白質(zhì)。等位基因變異體還可在基因的5＇或3＇不翻譯區(qū)域(如調(diào)節(jié)控制區(qū)域)有改變(如美國(guó)專利第5753/235號(hào))。
表達(dá)系統(tǒng)奈瑟球菌屬細(xì)菌的核苷酸序列可在各種不同的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)；例如那些使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞、桿狀病毒、植物、細(xì)菌和酵母的系統(tǒng)。
i.哺乳動(dòng)物系統(tǒng)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域中已知的。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子是能結(jié)合哺乳動(dòng)物RNA聚合酶并啟動(dòng)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)的下游(3＇)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，它通常鄰近編碼序列的5＇端，還具有一個(gè)TATA盒，這個(gè)框通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25-30個(gè)堿基對(duì)(bp)處。認(rèn)為TATA盒指導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點(diǎn)開(kāi)始RNA合成。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子還含有一個(gè)上游啟動(dòng)子元件，它通常位于TATA盒上游100至200bp內(nèi)。該上游啟動(dòng)子元件決定了轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的速度，并可在兩個(gè)方向之一上起作用〔Sambrook等人(1989)“克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)”，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版〕。
哺乳動(dòng)物病毒基因通常是高表達(dá)的，具有廣泛的宿主范圍；因此，編碼哺乳動(dòng)物病毒基因的序列提供了特別有用的啟動(dòng)子序列。例子包括SV40早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(Ad MLP)以及單純皰疹病毒啟動(dòng)子。另外，從非病毒基因(如鼠金屬硫蛋白基因)衍生的序列也提供了有用的啟動(dòng)子序列。表達(dá)可以是組成型的或受調(diào)控的(誘導(dǎo)型)，取決于啟動(dòng)子能否在激素反應(yīng)性細(xì)胞中用促糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。
增強(qiáng)元件(增強(qiáng)子)的存在，聯(lián)合上述啟動(dòng)子元件時(shí)通常會(huì)提高表達(dá)水平。增強(qiáng)子是這樣一種調(diào)控性DNA序列，當(dāng)它與同源或異源啟動(dòng)子相連，合成在正常的RNA起始位點(diǎn)開(kāi)始時(shí)，它能刺激轉(zhuǎn)錄提高1000倍。當(dāng)增強(qiáng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游或下游，處于正?；蚍D(zhuǎn)方向，或距離啟動(dòng)子1000個(gè)核苷酸以上的距離時(shí)，它均具有活性〔Maniatis等人(1987)Science 2361237；Alberts等人(1989)《細(xì)胞分子生物學(xué)》，第2版〕。從病毒衍生的增強(qiáng)子元件可能是特別有用的，因?yàn)樗鼈兺ǔ＞哂休^寬的宿主范圍。例子包括SV40早期基因增強(qiáng)子〔Dijkema等人(1985)EMBO J.4761〕以及衍生自Rous肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子〔Gorman等人(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.796777〕以及來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子〔Boshart等人(1985)Cell 41521〕。另外，一些增強(qiáng)子僅僅在誘導(dǎo)物(例如激素或金屬離子)的存在下是具有活性〔Sassone-Corsi和Borelli(1986)Trends Genet.2215；Maniatis等人(1987)Science 2361237〕。
DNA分子可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子序列可以和DNA分子直接相連，在這種情況下，重組蛋白N端的第一個(gè)氨基酸始終是甲硫氨酸，它由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過(guò)和溴化氰體外培育來(lái)從蛋白上切下此N端?；蛘撸鈦?lái)蛋白也可從細(xì)胞中分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，方法是產(chǎn)生嵌合的DNA分子，該DNA分子編碼的融合蛋白包括一前導(dǎo)序列片段，該片段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提供了外源蛋白的分泌。較佳的是，在前導(dǎo)序列片段和外源基因之間可以有能在體內(nèi)或體外斷裂的加工位點(diǎn)。前導(dǎo)序列片段通常編碼一種由疏水性氨基酸組成的信號(hào)肽，該信號(hào)肽指導(dǎo)蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌。腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)序列是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌外來(lái)蛋白的一個(gè)前導(dǎo)序列的例子。
通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3＇的調(diào)控區(qū)域，因此它和啟動(dòng)子元件一起側(cè)接于編碼序列。成熟mRNA的3＇端由定點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄后斷裂和聚腺苷酸化形成〔Bimstiel等人(1985)Cell 41349；Proudfoot和Whitelaw(1988)＂真核RNA的終端和3＇端加工＂，Transcription and splicing(B.D.Hames和D.M.Glover編)；Proudfoot(1989)Trends Biochem.Sci.14105〕。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，mRNA能被翻譯成該DNA編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號(hào)的例子包括從SV40衍生的那些〔Sambrook等人(1989)“克隆基因在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)”，Molecular CloningA Laboratory Manual〕。
通常，上述組件，包括啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)以及轉(zhuǎn)錄終止序列被一起放入表達(dá)構(gòu)建物中。如果需要，表達(dá)構(gòu)建物中還包括增強(qiáng)子、具有功能性剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子以及前導(dǎo)序列。構(gòu)建物的表達(dá)通常以復(fù)制子形式維持，例如是能在宿主(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。哺乳動(dòng)物復(fù)制系統(tǒng)包括從動(dòng)物病毒衍生的那些系統(tǒng)，其需要反式作用因子來(lái)進(jìn)行復(fù)制。例如，含有乳多空病毒復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒，如SV40〔Gluzman(1981)Cell，23175〕或多瘤病毒，在合適的病毒T抗原的存在下復(fù)制出極高的拷貝數(shù)。哺乳動(dòng)物復(fù)制子的其它例子包括衍生自牛乳頭瘤病毒和EB病毒的復(fù)制子。另外，復(fù)制子可以有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而使其能維持在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并能在原核宿主中克隆和擴(kuò)增。這些哺乳動(dòng)物細(xì)菌穿梭載體的例子包括pMT2〔Kaufman等人(1989)Mol.Cell.Biol.9946〕和pHEBO〔Shimizu等人(1986)Mol.Cell.Biol.61074〕。
所用的轉(zhuǎn)化步驟取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域所知的，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中以及將DNA直接顯微注射到胞核中。
可作為宿主進(jìn)行表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域中已知的，其包括許多從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的無(wú)限增殖的細(xì)胞系，包括但不局限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、乳倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如Hep G2)和其它許多細(xì)胞系。
ii.桿狀病毒系統(tǒng)也可將編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸插入合適的昆蟲(chóng)表達(dá)載體中，并與該載體中的控制元件操作性相連。載體構(gòu)建采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)。通常，表達(dá)系統(tǒng)的組分包括一種轉(zhuǎn)移載體，通常是細(xì)菌質(zhì)粒，它含有桿狀病毒基因組片段以及便于插入待表達(dá)異源基因的限制性位點(diǎn)；野生型桿狀病毒，它的序列與轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源(這使得異源基因能同源重組到桿狀病毒基因組中)；以及合適的昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入轉(zhuǎn)移載體中后，將載體和野生型病毒基因組轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞中，使載體和病毒基因組重組。表達(dá)包裝的重組病毒，鑒定并純化重組噬斑。桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)材料及其方法，除別的以外，可以試劑盒形式購(gòu)自Invitrogen，San Diego CA(＂MaxBac＂試劑盒)。這些技術(shù)通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，在Summers和Smith的Texas Agricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)(后稱“Summer和Smith的文章”)中有充分描述。
在將編碼蛋白質(zhì)的DNA序列插入桿狀病毒基因組之前，通常將上述組件，包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列裝配在中間置換型構(gòu)建物(轉(zhuǎn)移載體)中。該構(gòu)建物可含有單個(gè)基因以及操作性相連的調(diào)控元件；多個(gè)基因，每個(gè)基因有其自己的一套操作性相連調(diào)控元件；或是由同一組調(diào)控元件調(diào)控的多個(gè)基因。中間置換型構(gòu)建物通常保持在一個(gè)復(fù)制子中，例如能在宿主(如細(xì)菌)內(nèi)穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子將具有一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而使其能保持在合適的宿主中進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。
目前，用來(lái)將外源基因?qū)階cNPV的最常用的轉(zhuǎn)移載體是pAc373。還可設(shè)計(jì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它許多載體。這些載體包括如pVL985(其將多角體蛋白的起始密碼子從ATG變?yōu)锳TT，并在ATT下游32個(gè)堿基對(duì)處引入一個(gè)BamHI克隆位點(diǎn)；見(jiàn)Luckow和Summers，Virology(1989)，1731)。
質(zhì)粒通常還含有多角體蛋白聚腺苷酸化信號(hào)(Miller等人(1988〕Ann.Rev.Microbiol.，42177)以及用來(lái)在大腸桿菌中選擇和繁殖的原核氨芐青霉素抗性(amp)基因和復(fù)制起點(diǎn)。
桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體通常含有桿狀病毒啟動(dòng)子。桿狀病毒啟動(dòng)子是能結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并啟動(dòng)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)下游(5＇到3＇)轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動(dòng)子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，該區(qū)通常鄰近編碼序列的5＇端。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括一個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體還可能具有稱為增強(qiáng)子的第二區(qū)，如果該區(qū)域存在，它通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。表達(dá)可以是調(diào)控型或組成型的。
在病毒感染周期晚期大量轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供了特別有用的啟動(dòng)子序列。例子包括從編碼病毒多角體蛋白的基因衍生獲得的序列，F(xiàn)riesen等人(1986)“桿狀病毒基因表達(dá)的調(diào)控”，The Molecular Biology of Baculoviruses(Walter Doerfler編輯)；EPO公開(kāi)號(hào)127 839和155 476；以及編碼p10蛋白的基因，Vlak等人(1988)，J.Gen.Virol.，69765。
編碼合適的信號(hào)序列的DNA可以衍生自分泌的昆蟲(chóng)或桿狀病毒蛋白的基因(如桿狀病毒多角體蛋白基因)(Carbonell等人，(1988)Gene，73409)。另外，由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞翻譯后修飾(如信號(hào)肽斷裂、蛋白水解斷裂和磷酸化)的信號(hào)看來(lái)可被昆蟲(chóng)細(xì)胞識(shí)別，且分泌和胞核積累所需的信號(hào)看來(lái)在無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞和脊椎動(dòng)物細(xì)胞之間是保守的，因此也可用非昆蟲(chóng)來(lái)源的前導(dǎo)序列來(lái)提供昆蟲(chóng)中的分泌，這些前導(dǎo)序列例如是從編碼人α-干擾素(Maeda等人(1985)，Nature 315592)、人胃泌素釋放的肽(Lebacq-Verheyden等人(l988)，Molec.Cell.Biol.83129)、人IL-2(Smith等人(1985)Proc.Nat’l.Acad Sci.USA，828404)、小鼠IL-3(Miyajima等人(1987)Gene 58273)和人葡糖腦苷脂酶(Martin等人(1988)DNA，799)的基因衍生獲得的。
重組多肽或聚蛋白可以在胞內(nèi)表達(dá)，或如果它是用合適的調(diào)控序列表達(dá)的，就可被分泌。非融合的外源蛋白良好的胞內(nèi)表達(dá)通常需要理想地具有短前導(dǎo)序列的異源基因在ATG起始信號(hào)前有合適的翻譯起始信號(hào)。如果需要，可通過(guò)和溴化氰體外培育，從成熟蛋白上切下N端甲硫氨酸。
另外，通過(guò)產(chǎn)生嵌合的DNA分子將非天然分泌的重組聚蛋白或蛋白從昆蟲(chóng)細(xì)胞中分泌出來(lái)，該嵌合的DNA分子所編碼的融合蛋白包含一前導(dǎo)序列片段，該片段提供了從昆蟲(chóng)中分泌外源蛋白的作用。該前導(dǎo)序列片段通常編碼一種信號(hào)肽，該信號(hào)肽包含的疏水性氨基酸引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
在插入了編碼該蛋白表達(dá)產(chǎn)物前體的DNA序列和/或基因后，用轉(zhuǎn)移載體的異源DNA和野生型桿狀病毒的基因組DNA共同轉(zhuǎn)化(通常是共轉(zhuǎn)染)昆蟲(chóng)細(xì)胞宿主。此構(gòu)建物的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列通常包含桿狀病毒基因組2-5kb片段。將異源DNA引入桿狀病毒中所需位點(diǎn)內(nèi)的方法是本領(lǐng)域所知的。(見(jiàn)Summers和Smith的文章，同上；Ju等人(1987)；Smith等人，Mol.Cell.Biol.(1983)32156；和Luckow和Summers(1989))。例如，插入可以是通過(guò)同源雙交換重組來(lái)插入一個(gè)基因如多角體蛋白基因中；插入還可以是插入構(gòu)建的所需桿狀病毒基因內(nèi)的限制性酶切位點(diǎn)中。Miller等人(1989)，Bioessays 491。當(dāng)DNA序列被克隆在表達(dá)載體多角體蛋白基因位置中時(shí)，其5＇和3＇均側(cè)接了多角體蛋白特異性序列，并位于多角體蛋白啟動(dòng)子的下游。
隨后將新形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝到感染性重組桿狀病毒中。發(fā)生頻率很低(在約1％和5％之間)的同源重組；因此，共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的大多數(shù)病毒仍是野生型病毒。因此，需要用一種方法來(lái)鑒別重組病毒。該表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是肉眼篩選能區(qū)分重組病毒。在病毒感染后期，天然病毒產(chǎn)生的多角體蛋白在受其感染細(xì)胞的胞核中產(chǎn)生的水平非常高。累積的多角體蛋白形成的包涵體，其還含有包埋顆粒。這些大小至多為15微米的包涵體具有高度的折光性，從而使它們呈現(xiàn)明亮的發(fā)光外觀，在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察。感染了重組病毒的細(xì)胞缺少包涵體。為了區(qū)分重組病毒和野生型病毒，用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將轉(zhuǎn)染上清接種到單層昆蟲(chóng)細(xì)胞上形成噬斑。即，在光學(xué)顯微鏡下篩選存在(表明是野生型病毒)或不存在(表明是重組病毒)包涵體的噬斑?！癈urrent Protocols in Microbiology”，第2卷(Ausubel等人編輯)，16.8(增補(bǔ)10，1990)；Summers和Smith的文章，同上；Miller等人(1989)。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出感染進(jìn)入幾種昆蟲(chóng)細(xì)胞的重組桿狀病毒表達(dá)載體。例如，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于感染以下昆蟲(chóng)細(xì)胞的重組桿狀病毒埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)、家蠶(Bombyx mori)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(WO89/046699；Carbonell等人(1985)，J.Virol.56153；Wright(1986)Nature 321718；Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.32156；綜述見(jiàn)Fraser等人(1989)In Vitro Cell.Dev.Biol.25225)。
可以購(gòu)得細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基用于在桿狀病毒/表達(dá)系統(tǒng)中直接表達(dá)和融合表達(dá)異源多肽；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的。參見(jiàn)Summers和Smith的文章，同上。
然后，經(jīng)修飾的昆蟲(chóng)細(xì)胞可以生長(zhǎng)在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基能穩(wěn)定地保持該質(zhì)粒于修飾的昆蟲(chóng)宿主中。當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物的基因處于可誘導(dǎo)的控制下時(shí)，可以使宿主生長(zhǎng)至高密度，并誘導(dǎo)表達(dá)。另外，當(dāng)表達(dá)是組成型時(shí)，產(chǎn)物將被連續(xù)表達(dá)到培養(yǎng)基中，營(yíng)養(yǎng)性培養(yǎng)基必需不斷循環(huán)，取出感興趣的產(chǎn)物同時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物。產(chǎn)物可用以下這些技術(shù)來(lái)純化例如層析，如HPLC、親和層析、離子交換層析等；電泳；密度梯度離心；溶劑抽提等。產(chǎn)物可按需作進(jìn)一步純化，以基本上除去所有也分泌到培養(yǎng)基中或由昆蟲(chóng)細(xì)胞裂解而產(chǎn)生的昆蟲(chóng)蛋白，以提供一種至少基本上不含宿主碎片如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的產(chǎn)物。
為了獲得蛋白質(zhì)的表達(dá)，將從轉(zhuǎn)化子衍生獲得的重組宿主細(xì)胞培育在允許重組蛋白的編碼序列表達(dá)的條件下。這些條件將隨所選定的宿主細(xì)胞而變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易根據(jù)本領(lǐng)域已知的知識(shí)來(lái)確定該條件。
iii.植物系統(tǒng)本領(lǐng)域已知有許多植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和全植物遺傳表達(dá)系統(tǒng)。典型的植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)包括在以下專利中描述的那些，如US5,693,506；US5,659,122；和US5,608,143。Zenk，Phytochemistry 303861-3863(1991)中描述了在植物細(xì)胞培養(yǎng)物中遺傳表達(dá)的其它例子。除上述參考文獻(xiàn)外，關(guān)于植物蛋白信號(hào)肽的描述還可在下列文獻(xiàn)中找到Vaulcombe等人，Mol.Gen.Genet.20933-40(1987)；Chandler等人，Plant Molecular Biology 3407-418(1984)；Rogers，J.Biol.Chem.2603731-3738(1985)；Rothstein等人，Gene 55353-356(1987)；Whittier等人，NucleicAcids Research 152515-2535(1987)；Wirsel等人，Molecular Microbiology 33-14(1989)；Yu等人，Gene 122247-253(1992)。關(guān)于用植物激素、赤霉素酸和赤霉素酸誘導(dǎo)分泌的酶調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)的描述可在R.L.Jones和J.MacMillin，Gibberellins，Advanced Plant Physiology，Malcolm B.Wilkins編輯，1984 PitmanPublishing Limited，London，21-52頁(yè)中找到。描述其它調(diào)節(jié)代謝的基因的參考文獻(xiàn)參見(jiàn)Sheen，Plant Cell，21027-1038(1990)；Maas等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志(EMBO J.)93447-3452(1990)；Benkel和Hickey，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.).841337-1339(1987)。
通常，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將所需的多核苷酸序列插入一表達(dá)盒中，該表達(dá)盒含有為在植物中操作而設(shè)計(jì)的基因調(diào)控元件。將該表達(dá)盒插入所需的表達(dá)載體中，表達(dá)盒的上游和下游有適合在植物宿主中表達(dá)的伴隨序列。這些伴隨序列可來(lái)自質(zhì)粒或病毒，并為載體提供所需的性能，以允許載體將DNA從起初的克隆宿主(如細(xì)菌)中移動(dòng)到所需植物宿主中?；A(chǔ)的細(xì)菌/植物載體構(gòu)建物最好能提供寬的宿主范圍原核復(fù)制起點(diǎn)；原核可選擇的標(biāo)記；以及，對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而言，宜提供T DNA序列用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移至植物染色體。當(dāng)異源基因不易檢測(cè)時(shí)，該構(gòu)建物最好還具有一個(gè)適用于確定植物細(xì)胞是否已經(jīng)轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記基因。關(guān)于合適標(biāo)記(例如對(duì)于禾草類家族成員)的綜述可在Wilmink和Dons，1993，Plant Mol.Biol.Reptr，11(2)165-185中找到。
還建議采用適合將異源序列整合到植物基因組中的序列。這些序列可能包括用于同源重組的轉(zhuǎn)座子序列以及允許將異源表達(dá)盒隨機(jī)插入植物基因組中的Ti序列。合適的原核可選擇標(biāo)記包括抗生素(如氨芐青霉素或四環(huán)素)抗性標(biāo)記。編碼其它功能的其它DNA序列也可存在于載體中，這是本領(lǐng)域所知的。
本發(fā)明的核酸分子可包括在一個(gè)表達(dá)盒中來(lái)表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。通常只要一個(gè)表達(dá)盒，但是兩個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒也是可行的。除了編碼異源蛋白的序列外，重組表達(dá)盒還含有下列元件啟動(dòng)子區(qū)域、植物5＇非翻譯序列、起始密碼子(根據(jù)結(jié)構(gòu)基因原來(lái)是否具有而定)、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止序列。表達(dá)盒5＇和3＇端的獨(dú)特限制性酶位點(diǎn)能使表達(dá)盒方便地插入預(yù)先存在的載體中。
異源編碼序列可以用于任何與本發(fā)明有關(guān)的蛋白。編碼感興趣的蛋白的序列將編碼出一個(gè)信號(hào)肽，該信號(hào)肽能適當(dāng)?shù)丶庸ず娃D(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，并且通常缺少可能會(huì)導(dǎo)致本發(fā)明的所需蛋白與膜結(jié)合的序列。由于對(duì)于大部分來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)將針對(duì)發(fā)芽期間表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，采用提供轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)肽，也可提供轉(zhuǎn)運(yùn)感興趣的蛋白質(zhì)。通過(guò)這種方式，感興趣的蛋白將從表達(dá)該蛋白的細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(lái)，并能被有效地收獲。通常，種子中的分泌是通過(guò)糊粉或小盾體上皮層進(jìn)入種子的胚乳。盡管不需要使蛋白從產(chǎn)生該蛋白的細(xì)胞中分泌出來(lái)，但是這種分泌有利于重組蛋白的分離和純化。
由于所需基因產(chǎn)物的最終表達(dá)將在真核細(xì)胞中進(jìn)行，因此需要確定克隆的基因部分是否含有作為內(nèi)含子被宿主剪接體機(jī)制加工的序列。如果是這樣，需要對(duì)“內(nèi)含子”區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以防止一部分遺傳信息作為錯(cuò)誤的內(nèi)含子密碼而喪失，Reed和Maniatis，Cell 4195-105，1985。
可用微量移液管以機(jī)械方式轉(zhuǎn)移重組DNA，將載體直接顯微注射到植物細(xì)胞中。Crossway，Mol.Gen.Genet，202179-185。還可用聚乙二醇將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，Krens等人，Nature，296，72-74，1982。導(dǎo)入核酸片段的另一種方法是用小顆粒進(jìn)行高速?gòu)椀镭灤谶@些小珠或顆粒的基質(zhì)中或表面上帶有核酸，Klein等人，Nature，327，70-73，1987，Knudsen和Muller，1991，Planta，185330-336提出用顆粒轟擊大麥胚乳以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大麥。還有一種導(dǎo)入方法是使原生質(zhì)體和其它實(shí)體〔微細(xì)胞(minicell)、細(xì)胞、溶酶體或其它可融合的脂質(zhì)表面體〕融合，F(xiàn)raley等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，1859-1863，1982。
載體也可通過(guò)電穿孔導(dǎo)入植物細(xì)胞中。(Fromm等人，PNAS 825824，1958)。在該技術(shù)中，在含有基因構(gòu)建物的質(zhì)粒存在下電穿孔植物原生質(zhì)體。高電場(chǎng)強(qiáng)度的電脈沖使生物膜可逆地被通透，從而允許導(dǎo)入質(zhì)粒。電穿孔的植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁，分裂并形成植物愈傷組織。
能分離出原生質(zhì)體并能培育成全再生植物的所有植物，都能用本發(fā)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而回收得到含有轉(zhuǎn)基因的全植物。已經(jīng)知道實(shí)際上可以從培育的細(xì)胞或組織再生所有的植物，其包括但不局限于，甘蔗、甜菜、棉花、果實(shí)和其它樹(shù)、豆科植物和蔬菜的所有主要種類。合適的植物包括如從草莓屬(Fragaria)、蓮屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢喜豆屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡蘆巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、牻牛兒屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica)、蘿卜屬(Raphanus)、芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、曼陀羅屬(Datura)、莨菪屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、矮牽牛屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、馬約喇納屬(Majorana)、菊苣屬(Cichorium)、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚(yú)草屬(Antirrhinum)、Hererocallis、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍?qū)?Panicum)、狼尾屬(Pennisetum)、毛莨屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、蛾蝶屬(Salpiglossis)、黃瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、毒麥屬(Lolium)、玉米屬(Zea)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)和曼陀羅屬(Datura)。
再生方式隨各種植物而有所不同，但是通常是首先提供含有異源基因拷貝的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸液。形成愈傷組織，從愈傷組織中誘生出枝條，隨后是根。另外，從原生質(zhì)體懸液可以誘生形成胚。這些胚象天然的胚那樣發(fā)芽形成植物。培養(yǎng)基通常含有各種氨基酸和激素，如植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。尤其是對(duì)于玉米和苜蓿屬來(lái)說(shuō)，在培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸也是很有利的。枝條和根通常同時(shí)發(fā)育。有效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型以及培養(yǎng)史。如果控制了這三個(gè)變量，那么再生能完全再現(xiàn)和重復(fù)。
在一些植物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，本發(fā)明所需的蛋白可能被分泌出來(lái)，或者蛋白可從全植物中提取出來(lái)。當(dāng)本發(fā)明所需的蛋白被分泌到培養(yǎng)基中后，就可進(jìn)行收集。或者，可以用機(jī)械方式破碎胚以及無(wú)胚-半種子或其它植物組織，以釋放出分泌到細(xì)胞和組織之間的蛋白。將該混合物懸于緩沖液中，以收回可溶性蛋白。然后用常規(guī)的蛋白分離和純化方法純化重組蛋白。用常規(guī)方法調(diào)節(jié)時(shí)間、溫度、pH、氧和體積等參數(shù)，以優(yōu)化異源蛋白的表達(dá)和回收。
iv.細(xì)菌系統(tǒng)細(xì)菌表達(dá)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。細(xì)菌啟動(dòng)子是能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3＇)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動(dòng)子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常位于編碼序列的5＇端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。細(xì)菌啟動(dòng)子可能還有第二個(gè)功能區(qū)域稱為操縱子，它可能與毗鄰的RNA合成開(kāi)始的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)重疊。該操縱子允許負(fù)調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo))的轉(zhuǎn)錄，因?yàn)榛蜃瓒舻鞍卓赡芙Y(jié)合操縱子并因而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。在負(fù)調(diào)節(jié)元件(如操縱子)不存在時(shí)，可能發(fā)生組成型表達(dá)。另外，正調(diào)節(jié)可通過(guò)基因激活蛋白結(jié)合序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，如果有的話，該結(jié)合序列通常鄰近RNA聚合酶結(jié)合序列的(5＇)?；蚣せ畹鞍椎睦邮欠纸獯x物激活劑蛋白(CAP)，它幫助啟動(dòng)大腸桿菌(E.coli)中的lac操縱子的轉(zhuǎn)錄〔Raibaud等人(1984)Annu.Rev.Genet.18173〕。因此，表達(dá)的調(diào)控可能是正作用或負(fù)作用，從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。
編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動(dòng)子序列。例子包括衍生自糖(如半乳糖、乳糖(lac)〔Chang等人(1977)Nature 1981056〕和麥芽糖)代謝酶的啟動(dòng)子序列。其它例子包括衍生自生物合成酶(如色氨酸(trp))〔Goeddel等人(1980)Nuc.Acids Res.84057；Yelverton等人(1981)Nucl.Acids Res.9731；美國(guó)專利4,738,921；EP-A-0036776和EP-A-0121775〕的啟動(dòng)子序列。β-內(nèi)酰胺酶(bla)啟動(dòng)子系統(tǒng)〔Weissmann(1981)＂干擾素的克隆和其它錯(cuò)誤＂《干擾素3》(I.Gresser編輯)〕，λ噬菌體PL〔Shimatake等人(1981)Nature 292128〕和T5〔美國(guó)專利4,689,406〕啟動(dòng)子系統(tǒng)也提供了有用的啟動(dòng)子序列。
另外，非天然存在的合成的啟動(dòng)子也可象細(xì)菌啟動(dòng)子一樣起作用。例如，一種細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活序列可以和另一種細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子的操縱子序列連接在一起，形成合成的雜交啟動(dòng)子〔美國(guó)專利4,551,433〕。例如，tac啟動(dòng)子是雜合的trp-lac啟動(dòng)子，它由trp啟動(dòng)子以及受lac阻遏蛋白調(diào)節(jié)的lac操縱子序列組成〔Amann等人(1983)Gene 25167；de Boer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.8021〕。另外，細(xì)菌啟動(dòng)子可包括非細(xì)菌來(lái)源但能結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動(dòng)子。天然存在的非細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子還能和相容的RNA聚合酶偶聯(lián)在一起，從而在原核細(xì)胞中高水平地表達(dá)某些基因。噬菌體T7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)就是一種偶聯(lián)的啟動(dòng)子系統(tǒng)〔Studier等人(1986)J.Mol.Biol.189113；Tabor等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.821074〕。另外，雜合的啟動(dòng)子還可由噬菌體啟動(dòng)子以及大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(EP-A-0267 851)。
除了有功能的啟動(dòng)子序列外，有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)于外來(lái)基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)也是有用的。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)稱為Shine-Dalgarno(SD)序列，其包括起始密碼子(ATG)以及在起始密碼子上游3-11個(gè)核苷酸處的長(zhǎng)度為3-9個(gè)核苷酸的序列〔Shine等人(1975)Nature 25434〕。認(rèn)為SD序列是通過(guò)SD序列和大腸桿菌16S rRNA的3＇端之間堿基配對(duì)來(lái)促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合的〔Steitz等人(1979)，“信使RNA中的遺傳信號(hào)和核苷酸序列”，《生物學(xué)調(diào)節(jié)和發(fā)育基因表達(dá)》，R.F.Goldberger編輯〕。為了表達(dá)具有弱的核糖體結(jié)合位點(diǎn)的原核基因和真核基因〔Sambrook等人(1989)，“克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)”，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》〕。
DNA分子可以在胞內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，N端的第一個(gè)氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過(guò)和溴化氰體外培育或通過(guò)和細(xì)菌甲硫氨酸N-端肽酶體內(nèi)或體外培育，將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下(EP-A-0219237)。
融合蛋白為直接表達(dá)提供了另一種方法。通常，將編碼內(nèi)源細(xì)菌蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5＇端融合。在表達(dá)時(shí)，該構(gòu)建物將提供這兩個(gè)氨基酸序列的融合物。例如，λ噬菌體細(xì)胞基因可以和外源基因的5＇端相連并在細(xì)菌中表達(dá)。所得融合蛋白宜保留一個(gè)酶(因子X(jué)a)加工位點(diǎn)，以便將噬菌體蛋白與外源基因切開(kāi)〔Nagai等人(1984)Nature 309810〕。融合蛋白也可用lacZ〔Jia等人(1987)Gene 60197〕，trpE〔Allen等人(1987)J.Biotechnol.593；Makoff等人(1989)，J.Gen.Microbiol.13511〕以及Chey〔EP-A-0324 647〕基因的序列組成。兩個(gè)氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼一可切割的位點(diǎn)。另一個(gè)例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成，該區(qū)域宜保留一個(gè)酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點(diǎn)，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開(kāi)。通過(guò)這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白〔Miller等人(1989)，Bio/Technology 7698〕。
另外，還可通過(guò)產(chǎn)生嵌合的DNA分子來(lái)將外源蛋白分泌出細(xì)胞，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽序列片段，該序列片段能使細(xì)菌中的外源蛋白分泌出來(lái)〔美國(guó)專利4,336,336〕。信號(hào)序列片段通常編碼一個(gè)信號(hào)肽，該信號(hào)肽含有疏水性氨基酸，能指引蛋白分泌出細(xì)胞。蛋白質(zhì)被分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基(革蘭陽(yáng)性菌)中或細(xì)胞內(nèi)膜和外膜之間的周質(zhì)間隙內(nèi)(革蘭陰性菌)。在編碼的信號(hào)肽片段和外源基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點(diǎn)。
編碼合適信號(hào)序列的DNA可以從分泌性細(xì)菌蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如是大腸桿菌外膜蛋白基因(ompA)〔Masui等人(1983)，《基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)操作》；Ghrayeb等人(1984)EMBO J.32437〕以及大腸桿菌堿性磷酸酶信號(hào)序列(phoA)〔Oka等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212〕。另一個(gè)例子是，可采用各種芽孢桿菌菌株的α淀粉酶基因的信號(hào)序列將異源蛋白分泌出枯草芽孢桿菌〔Palva等人(1982)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0244042〕。
通常，細(xì)菌所識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3＇的調(diào)控區(qū)，它和啟動(dòng)子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列通常包括約50個(gè)核苷酸的DNA序列，該序列能形成幫助終止轉(zhuǎn)錄的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例子包括衍生自具有強(qiáng)啟動(dòng)子的基因(如大腸桿菌中的trp基因以及其它生物合成的基因)的轉(zhuǎn)錄終止序列。
上述組件，包括啟動(dòng)子、信號(hào)序列(如果需要)、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列通常一起被放在表達(dá)構(gòu)建物中。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子的形式維持，例如能在宿主(如細(xì)菌)中穩(wěn)定維持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子具有一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而允許其維持在原核宿主中或進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。另外，復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個(gè)質(zhì)粒，更佳的含有至少約20個(gè)質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對(duì)宿主的影響，可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。
另外，表達(dá)構(gòu)建物可以和一個(gè)整合載體一起整合入細(xì)菌基因組中。整合載體通常含有至少一個(gè)序列與細(xì)菌染色體同源，從而允許該載體整合。整合看來(lái)是載體和細(xì)菌染色體中的同源DNA之間重組的結(jié)果。例如，用不同芽孢桿菌菌株的DNA構(gòu)建的整合載體整合到芽孢桿菌染色體中(EP-A-0127328)。整合載體還可包含噬菌體或轉(zhuǎn)座子序列。
通常，染色體外構(gòu)建物以及整合的表達(dá)構(gòu)建物可含有可選擇的標(biāo)記，以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株。可選擇標(biāo)記可在細(xì)菌宿主中表達(dá)，其包括賦予細(xì)菌對(duì)藥物(如氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素(新霉素)和四環(huán)素)抗性的基因〔Davies等人(1978)Annu.Rev.Microbiol.32469〕?？蛇x擇標(biāo)記還可包括生物合成性基因，如在組氨酸、色氨酸以及亮氨酸生物合成途徑中的那些基因。
另外，上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個(gè)可選擇標(biāo)記，如上所述，該載體以復(fù)制子形式維持或發(fā)展成一個(gè)整合載體。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化到許多細(xì)菌中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(無(wú)論是染色體外復(fù)制子還是整合載體)。例如，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了用于下列細(xì)菌的表達(dá)載體枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0036259和063953；WO84/04541〕，大腸桿菌(Escherichia coli)〔Shimatake等人，(1981)Nature 292128；Amann等人，(1985)Gene 40183；Studier等人，(1986)J.Mol.Biol.189113；EP-A-0036776、136829和136907〕，乳脂鏈球菌(Streptococcus cremoris)〔Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655〕；淺青紫鏈球菌(Streptococcus lividans)〔Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655〕，淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)〔美國(guó)專利4,745,056〕。
將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用氯化鈣或其它試劑(如二價(jià)陽(yáng)離子和二甲亞砜)處理對(duì)細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。DNA還可通過(guò)電穿孔方法導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的細(xì)菌種類而不同?！怖鐓⒁?jiàn)，例如使用桿菌Masson等人，(1989)FEMSMicrobiol.Lett.60273；Palva等人，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EP-A-0036259和063953；WO84/04541；使用彎曲桿菌Miller等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；和Wang等人，(1990)J.Bacteriol.172949；使用埃希氏大腸桿菌Cohen等人，(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower等人，(1988)NucleicAcids Res.166127；Kushner (1978)＂用ColE1-衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的改進(jìn)方法＂Genetic EngineeringProceedings ofthe International Symposium on Genetic Engineering(H.W.Boyer和S.Nicosia編輯)；Mandel等人，(1970)J.Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta949318；使用乳酸桿菌Chassy等人，(1987)FEMSMicrobiol.Lett.44173；使用假單胞菌Fiedler等人，(1988)Anal.Biochem17038；使用葡萄球菌Augustin等人，(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203；使用鏈球菌Barany等人，(1980)J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)＂用電穿孔轉(zhuǎn)化鏈球菌產(chǎn)乳酸微生物＂Streptococcal Genetics(J.Ferretti和R.Curtiss III編輯)；Perry等人，(1981)Infect.Immun.321295；Powell等人，(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti等人，(1987)Proc.4th Evr.Cong.Biotechnology 1412〕。
v酵母表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。酵母啟動(dòng)子是能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動(dòng)下游(3＇)編碼序列(如結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動(dòng)子具有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，它通常位于編碼序列的5＇端附近。該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)通常包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(＂TATA盒＂)以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。酵母啟動(dòng)子可能還有第二個(gè)功能區(qū)域稱為上游激活序列(UAS)，如果存在的話，它通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。UAS允許調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo))的表達(dá)。在UAS不存在時(shí)，發(fā)生組成型表達(dá)。表達(dá)的調(diào)控可能是正作用或負(fù)作用的，從而增強(qiáng)或減弱轉(zhuǎn)錄。
酵母是一種發(fā)酵生物體，具有活潑的代謝途徑，因此編碼代謝途徑中的酶的序列提供了特別有用的啟動(dòng)子序列。例子包括醇脫氫酶(ADH)(EP-A-0284044)、烯醇酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶、以及丙酮酸激酶(PyK)(EP-A-0329203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也提供了有用的啟動(dòng)子序列〔Myanohara等人(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 801〕。
另外，非天然存在的合成的啟動(dòng)子也可象酵母啟動(dòng)子一樣起作用。例如，一種酵母啟動(dòng)子的UAS序列可以和另一種酵母啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)連接在一起，形成合成的雜合啟動(dòng)子。這種雜合啟動(dòng)子的例子包括與GAP轉(zhuǎn)錄激活區(qū)相連的ADH調(diào)控序列(美國(guó)專利No.4,876,197和4,880,734)。雜合啟動(dòng)子的其它例子包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的調(diào)控序列組成的啟動(dòng)子與糖酵解酶基因如GAP或PyK的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的組合(EP-A-0164556)。另外，酵母啟動(dòng)子可包括非酵母來(lái)源但能結(jié)合酵母RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的天然存在的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子的例子包括，尤其是，〔Cohen等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 771078；Henikoff等人，(1981)Nature 283835；Hollenberg等人，(1981)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.96119；Hollenberg等人，(1979)＂細(xì)菌抗生素抗性基因在釀酒酵母中的表達(dá)＂，Plasmids of Medical，Environmental and Commercial Importance(K.N.Timmis和A.Puhler編輯)；Mercerau-Puigalon等人，(1980)Gene 11163；Panthier等人，(1980)Curr.Genet.2109〕。
DNA分子可以在酵母菌胞內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子序列可以直接與DNA分子相連，在這種情況下，重組蛋白N端的第一個(gè)氨基酸始終是甲硫氨酸，其由ATG起始密碼子編碼。如果需要，可通過(guò)和溴化氰體外培育將N端的甲硫氨酸從蛋白質(zhì)上切下。
象在哺乳動(dòng)物、桿狀病毒以及細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中一樣，融合蛋白為酵母表達(dá)系統(tǒng)提供了另一種方法。通常，將編碼內(nèi)源酵母蛋白或其它穩(wěn)定的蛋白之N端部分的DNA序列與異源編碼序列的5＇端融合。在表達(dá)時(shí)，該構(gòu)建物將提供這兩個(gè)氨基酸序列的融合物。例如，酵母或人超氧化物歧化酶(SOD)基因可以和外源基因5＇端相連并在酵母中表達(dá)。兩個(gè)氨基酸序列連接處的DNA序列可以編碼或不編碼可切割的位點(diǎn)。例如參見(jiàn)EP-A-0196056。另一個(gè)例子是遍在蛋白融合蛋白。這種融合蛋白由遍在蛋白區(qū)域組成，該區(qū)域宜保留一個(gè)酶(例如遍在蛋白特異性加工蛋白酶)加工位點(diǎn)，以便將外源蛋白和遍在蛋白切開(kāi)。因此，通過(guò)這種方法，可以分離獲得天然的外源蛋白(例如WO88/024066)。
另外，還可通過(guò)產(chǎn)生嵌合的DNA分子來(lái)將外源蛋白從細(xì)胞分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，該嵌合的DNA分子編碼的融合蛋白含有一個(gè)前導(dǎo)序列片段，該前導(dǎo)序列片段能使酵母中的外源蛋白分泌出來(lái)。較佳的是，在編碼的前導(dǎo)片段和外來(lái)基因之間宜具有能在體內(nèi)或體外切割的加工位點(diǎn)。該前導(dǎo)序列片段通常編碼了含有疏水性氨基酸的信號(hào)肽，其引導(dǎo)蛋白從細(xì)胞分泌出來(lái)。
編碼合適信號(hào)序列的DNA可以從分泌性酵母蛋白的基因衍生獲得，這些基因例如有酵母轉(zhuǎn)化酶基因(EP-A-0012873；JPO 62096，086)以及A-因子基因(美國(guó)專利4,588,684)。另外，非酵母來(lái)源的前導(dǎo)序列(如干擾素前導(dǎo)序列)的存在也能提供分泌出酵母的作用(EP-A-0060057)。
較佳的一類分泌前導(dǎo)序列采用了酵母α-因子基因的片段，其含有＂pre＂信號(hào)序列和＂pro＂區(qū)?？刹捎玫摩烈蜃悠蔚念愋桶ㄈL(zhǎng)pre-pro α因子前導(dǎo)序列(約83個(gè)氨基酸殘基)以及截短的α-因子前導(dǎo)序列(通常約25至50個(gè)氨基酸殘基)(美國(guó)專利4,546,083和4,870,008；EP-A-0324274)。采用α-因子前導(dǎo)片段提供分泌作用的其它前導(dǎo)序列包括雜合的α-因子前導(dǎo)序列，其由第一個(gè)酵母的pre序列以及第二個(gè)酵母α因子的pro區(qū)域組成(例如見(jiàn)WO89/02463)。
通常，酵母識(shí)別的轉(zhuǎn)錄終止序列是位于翻譯終止密碼子3＇的調(diào)控區(qū)，其和啟動(dòng)子一起側(cè)接在編碼序列的兩側(cè)。這些序列指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，而mRNA能被翻譯成該DNA所編碼的多肽。轉(zhuǎn)錄終止序列和其它酵母識(shí)別的終止序列的例子是編碼糖酵解酶的那些轉(zhuǎn)錄終止序列。
上述組件，包括啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(如果需要時(shí))、感興趣的編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列，通常被一起放在表達(dá)構(gòu)建物中。表達(dá)構(gòu)建物通常以復(fù)制子的形式保持，例如能在宿主(如酵母或細(xì)菌)中穩(wěn)定保持的染色體外元件(如質(zhì)粒)。復(fù)制子可能具有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，從而允許其能維持在例如酵母中進(jìn)行表達(dá)，并能維持在原核宿主進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。這些酵母-細(xì)菌穿梭載體的例子包括YEp24〔Botstein等人(1979)Gene 817-24〕，pCL/1〔Brake等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA814642-4646〕和YRp17〔Stinchcomb等人(1982)J.Mol.Biol.158157〕。另外，復(fù)制子可以是高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。高拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)大致在約5至200之間，通常在約10至150之間。含有高拷貝數(shù)質(zhì)粒的宿主宜含有至少約10個(gè)質(zhì)粒，更佳的含有至少約20個(gè)質(zhì)粒。根據(jù)載體以及外源蛋白對(duì)宿主的影響，可以選擇高拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的載體。例如參見(jiàn)Brake等人，同上。
另外，表達(dá)構(gòu)建物可以和一個(gè)整合載體一起整合入酵母基因組中。整合載體通常含有至少一個(gè)序列與酵母染色體同源，從而允許該載體整合，最好含有兩個(gè)同源序列側(cè)接該表達(dá)構(gòu)建物。整合看來(lái)是載體和酵母染色體中同源DNA之間重組的結(jié)果〔Orr-Weaver等人(1983)，Methods in Enzymol.101228-245〕。通過(guò)選擇合適的同源序列插入載體中，可將整合載體導(dǎo)入酵母中某一特定的基因座。見(jiàn)Orr-Weaver等人，同上?？梢哉先胍粋€(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建物，這可能會(huì)影響重組蛋白產(chǎn)生的水平(Rine等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 806750〕。載體中的染色體序列可以載體中的單個(gè)片段形式存在(從而導(dǎo)致整個(gè)載體的整合)，或是與染色體中的相鄰片段同源的兩個(gè)片段，這兩個(gè)片段在載體中側(cè)接在表達(dá)構(gòu)建物兩側(cè)，從而可導(dǎo)致僅表達(dá)構(gòu)建物的穩(wěn)定性整合。
通常，染色體外構(gòu)建物以及整合的表達(dá)可建物均含有可選擇的標(biāo)記，以便選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母菌株?？蛇x擇標(biāo)記可包括能在酵母宿主中表達(dá)的生物合成基因(如ADE2、HIS4、LEU2、TRP1和ALG7以及G418抗性基因)，這些基因分別賦予酵母細(xì)胞對(duì)衣霉素以及G418的抗性。另外，合適的可選擇標(biāo)記還可能為酵母在毒性化合物(如金屬)存在下提供生長(zhǎng)能力。例如，CUP1的存在使酵母能在銅離子存在下生長(zhǎng)〔Butt等人，(1987) Microbiol.Rev.51351〕。
另外，上述某些組件可以一起放在轉(zhuǎn)化載體中。轉(zhuǎn)化載體通常包含一個(gè)可選擇標(biāo)記，如上所述，該載體以復(fù)制子形式維持或發(fā)展成一個(gè)整合載體。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了用于轉(zhuǎn)化入許多酵母中的表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體(無(wú)論是染色體外復(fù)制子還是整合載體)。例如，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于下列酵母菌的表達(dá)載體白色念珠菌(Candida albicans)〔Kurtz，等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6142〕，麥芽糖念珠菌(Candida maltosa)〔Kunze，等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141〕，多形漢遜酵母(Hansenula polymorpa)〔Gleeson，等人，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202302〕，脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)〔Das，等人，(1984)J.Bacteriol.1581165〕，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)〔De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.154737；Vanden Berg等人，(1990)Bio/Technology 8135〕，季也蒙畢赤酵母(Pichia guillerimondii)〔Kunze等人，(1985)J.BasicMicrobiol.25141〕，巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)〔Cregg，等人，(1985)Mol.Cell. Biol.53376；美國(guó)專利No.4,837,148和4,929,555〕，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〔Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA751929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153163〕，栗酒裂植酵母(Schizosaccharomycespombe)〔Beach和Nurse(1981)Nature 300706〕，以及Yarrowia lipolytica〔Davidow，等人，(1985)Curr.Genet.10380471 Gaillardin，等人，(1985)Curr.Genet.1049〕。
將外源DNA導(dǎo)入酵母宿主的方法是本領(lǐng)域熟知的，通常包括用堿陽(yáng)離子處理轉(zhuǎn)化原生質(zhì)球或完整酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化程序通常因待轉(zhuǎn)化的酵母種類而不同。例如參見(jiàn)，〔Kurtz等人，(1986)Mol.Cell.Biol.6142；Kunze等人，(1985)J.BasicMicrobiol.25141；念珠菌〕；〔Gleeson等人，(1986)J.Gen.Microbiol.1323459；Roggenkamp等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202302；漢遜酵母〕；〔Das等人，(1984)J.Bacteriol.1581165；De Louvencourt等人，(1983)J.Bacteriol.1541165；Van denBerg等人，(1990)Bio/Technology8135；克魯維酵母〕；〔Cregg等人，(1985)Mol.Cell.Biol.53376；Kunze等人，(1985)J.Basic Microbiol.25141；美國(guó)專利No.4,837,148和4,929,555；畢赤酵母〕；〔Hinnen等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75；1929；Ito等人，(1983)J.Bacteriol.153163釀酒酵母〕；〔Beach和Nurse(1981)Nature 300706；裂殖酵母〕；〔Davidow等人，(1985)Curr.Genet.1039；Gaillardin等人，(1985)Curr.Genet.1049；Yarrowia〕。
抗體本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”指由至少一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)組成的一個(gè)或一組多肽。“抗體結(jié)合位點(diǎn)”是一個(gè)三維結(jié)合空間，其內(nèi)表面形狀和電荷分布與抗原表位的特征互補(bǔ)，從而使抗體與抗原結(jié)合?！翱贵w”例如包括，脊椎動(dòng)物抗體、雜合抗體、嵌合抗體、人源化抗體、經(jīng)修飾的抗體、單價(jià)抗體、Fab蛋白以及單結(jié)構(gòu)域抗體。
針對(duì)本發(fā)明蛋白的抗體可用于親和層析、免疫試驗(yàn)以及區(qū)別/鑒定奈瑟球菌蛋白。
針對(duì)本發(fā)明蛋白的多克隆和單克隆抗體可用常規(guī)方法制得。通常，首先用蛋白來(lái)免疫合適的動(dòng)物，較佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。由于可獲得的血清體積多，能獲得標(biāo)記的抗家兔和抗山羊抗體，因此對(duì)于制備多克隆抗血清來(lái)說(shuō)，家兔和山羊是較佳的。免疫通常這樣進(jìn)行將蛋白以鹽水(較佳的以佐劑如弗氏完全佐劑)混合或乳化，然后腸胃外(通常是皮下或肌內(nèi))注射該混合物或乳劑。每次注射50-200微克的劑量就足夠了。2-6周后用鹽水(較佳的是用弗氏不完全佐劑)配的蛋白質(zhì)注射一次或多次以強(qiáng)化免疫。另外可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行體外免疫來(lái)產(chǎn)生抗體，從本發(fā)明的目的來(lái)看，認(rèn)為其與體內(nèi)免疫等效。將免疫后的動(dòng)物血液抽取到玻璃或塑料容器中，25℃培育該血液1小時(shí)，然后4℃培育2-18小時(shí)，獲得多克隆抗血清。離心(例如1000g 10分鐘)回收血清。家兔每次取血可獲得約20-50毫升。
用Kohler和Milstein的標(biāo)準(zhǔn)方法〔Nature(1975)256495-96〕或其改進(jìn)方法制得單克隆抗體。通常，如上所述對(duì)小鼠或大鼠免疫。然而，并非是對(duì)動(dòng)物取血然后抽提血清，而是取出脾臟(以及任選地取出幾個(gè)大的淋巴結(jié))，將其分散成單細(xì)胞。如果需要，可將細(xì)胞懸液(在除去非特異性粘附的細(xì)胞后)加入包被了蛋白質(zhì)抗原的板或孔中，對(duì)脾細(xì)胞進(jìn)行篩選。表達(dá)抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞結(jié)合到板上，不象懸液其它物質(zhì)那樣被洗去。然后對(duì)所得B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，使其與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤，培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基(如次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷培養(yǎng)基，“HAT”)中。通過(guò)有限稀釋接種所得雜交瘤，并測(cè)定特異性結(jié)合免疫抗原(且不結(jié)合無(wú)關(guān)抗原)的抗體的產(chǎn)生。然后，體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(如小鼠腹水中)培養(yǎng)所選的分泌單克隆抗體的雜交瘤。
如果需要，抗體(無(wú)論是多克隆還是單克隆抗體)可用常規(guī)技術(shù)來(lái)標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、放射活性原子(尤其是32P和125I)、密電子試劑、酶、以及具有特異性結(jié)合配偶的配體。酶通?？科浠钚詠?lái)檢測(cè)。例如，辣根過(guò)氧化物酶通常是檢測(cè)其將3，3＇，5，5＇-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的能力，可用分光光度計(jì)定量測(cè)定?！疤禺愋越Y(jié)合配偶”指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原以及對(duì)其有特異性的單克隆抗體。其它特異性結(jié)合配偶包括生物素和親和素或鏈親和素，IgG和蛋白A，以及本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對(duì)。應(yīng)理解，上述內(nèi)容并非要將各種標(biāo)記分成不同的類，因?yàn)橥粯?biāo)記可在幾種不同的模型中起作用。例如，125I可作為放射活性標(biāo)記，或作為密電子試劑。HRP可作為酶或單抗的抗原。另外，一種物質(zhì)可以和各種標(biāo)記組合以獲得所需的效果。例如，在實(shí)施本發(fā)明中，單抗和親和素也需要標(biāo)記，因此，可以用生物素標(biāo)記單抗，并用標(biāo)記了125I的親和素檢測(cè)其存在，或用標(biāo)記HRP的抗生物素單抗檢測(cè)其存在。其它替換和可能性對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，所以應(yīng)認(rèn)作屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的等價(jià)物。
藥物組合物藥物組合物可包含本發(fā)明的多肽、抗體或核酸。該藥物組合物將包含治療有效量的本發(fā)明的多肽、抗體或多核苷酸。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果的量。該效果例如可通過(guò)化學(xué)標(biāo)記或抗原水平來(lái)檢測(cè)。治療效果也包括生理性癥狀的減輕，例如導(dǎo)致體溫降低。對(duì)于某一對(duì)象的精確有效量取決于該對(duì)象的體型和健康狀況、病癥的性質(zhì)和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒(méi)用的。然而，對(duì)于某給定的癥狀而言，可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來(lái)的。
為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個(gè)體約0.01毫克/千克至50毫克/千克或0.05毫克/千克至10毫克/千克的DNA構(gòu)建物。
藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑(例如抗體、多肽、基因或其它治療劑)給藥的載體。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，且給藥后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體可能是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物以及無(wú)活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
本文可用的藥學(xué)上可接受的鹽例如有無(wú)機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機(jī)酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。在Remington＇s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中。
給藥方法一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其直接給予對(duì)象。待治療的對(duì)象可以是動(dòng)物；尤其可以治療人對(duì)象。
直接輸送該組合物通?？赏ㄟ^(guò)皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸送至組織間隙來(lái)實(shí)現(xiàn)。組合物也可輸送至病灶區(qū)。其它給藥方式包括口服和肺給藥、栓劑和透皮或經(jīng)皮膚施用(參見(jiàn)例如WO98/20734)、用針、基因槍或手持無(wú)針注射器(hypospray)。治療劑量方案可以是單劑份方案或多劑份方案。
疫苗疫苗包含免疫性抗原、免疫原、多肽、蛋白或核酸，通常與“藥學(xué)上可接受的載體”組合，這些載體包括本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無(wú)活性的病毒顆粒。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(“佐劑”)作用。另外，抗原或免疫原可以和細(xì)菌類毒素(如白喉、破傷風(fēng)、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。
增強(qiáng)組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(1)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒(méi)有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見(jiàn)下文)或細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如，(a)MF59TM(WO90/14837；第10章“疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法”，Powell和Newman編，Plenum Press，1995)，其含有5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span85(任選地含有不同量的MTP-PE(見(jiàn)下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亞微米級(jí)顆粒；(b)SAF，其含有10％鯊烯、0.4％吐溫80、5％普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L(fēng)121以及thr-MDP(見(jiàn)下文)，微量流化成亞微米級(jí)乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑，和(c)RibiTM佐劑系統(tǒng)(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，其含有2％鯊烯、0.2％吐溫80以及選自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細(xì)胞壁骨架(CWS)的一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(DetoxTM)；(3)皂素佐劑，例如可采用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或從其產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性復(fù)合物)；(4)弗氏完全佐劑(CFA)和弗氏不完全佐劑(IFA)；(5)細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如γ干擾素)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等；以及(6)作為免疫刺激劑來(lái)增強(qiáng)組合物效果的其它物質(zhì)。Alum和MF59TM是較佳的。
如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨?；?L-丙氨酸-2-(1＇-2＇-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。
免疫原性組合物(如用于免疫的抗原/免疫原/多肽/蛋白/核酸，藥學(xué)上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運(yùn)載體中。
通常，可將免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學(xué)上可接受的載體下增強(qiáng)佐劑效果。
用作疫苗的免疫原性組合物，包含免疫學(xué)有效量的抗原性或免疫原性多肽以及上述其它所需的組分?！懊庖邔W(xué)有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別(如非人靈長(zhǎng)類、靈長(zhǎng)類等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
常規(guī)方法是從腸胃外途徑通過(guò)注射給予免疫原性組合物，例如皮下、肌內(nèi)或皮下/透皮給藥(例如WO98/20734)。適合其它給藥方式的其它配方包括口服和肺制劑、栓劑和透皮施藥。治療劑量可以是單劑份方案或多劑份方案。疫苗可以結(jié)合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。
作為以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的疫苗的一種替代方案是，可以采用DNA疫苗接種〔例如，Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9271-283；Donnelly等人(1997)Annu Rev.Immunol 15617-648；見(jiàn)下文〕。
基因傳送工具可局部或全身向哺乳動(dòng)物給予用于傳送含有本發(fā)明治療劑的編碼序列的構(gòu)建物的基因治療工具，以使其在該哺乳動(dòng)物中表達(dá)。這些構(gòu)建物可利用體內(nèi)或體外形式的病毒或非病毒載體方法?？墒褂脙?nèi)源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子誘導(dǎo)這種編碼序列的表達(dá)。該編碼序列的體內(nèi)表達(dá)可以是組成型的或調(diào)節(jié)型的。
本發(fā)明包括能表達(dá)預(yù)期的核酸序列的基因傳送工具。該基因傳送工具較佳是病毒載體，更佳是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒或甲病毒載體。病毒載體還可以是星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒、細(xì)小病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、痘病毒或者披膜病毒載體。通?？蓞⒁?jiàn)Jolly(1994)，Cancer Gene Therapy，151-64；Kimura(1994)，Human Gene Therapy，5845-852；Connelly(1995)，Human Gene Therapy，6185-193；和Kaplitt1994)，Nature Genetics，6148-153。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本領(lǐng)域中是周知的，我們認(rèn)為任何逆轉(zhuǎn)錄基因治療載體都可用在本發(fā)明中，包括B、C和D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒〔例如，NZB-X1、NZB-X2和NZB9-1(參見(jiàn)O＇Neill(1985)，J.Viro1.，53160)〕、多嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒如MCF和MCF-MLV〔參見(jiàn)Kelly(1983)，J.Virol.，45291〕、泡沫病毒和慢病毒。參見(jiàn)RNA Tumor Viruses，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，1985。
可從不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的各個(gè)部分。例如，可從鼠肉瘤病毒獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的LTR、從勞氏肉瘤病毒獲得tRNA結(jié)合位點(diǎn)、從鼠白血病毒獲得包裝信號(hào)、從鳥(niǎo)類白血病毒得到第二條鏈的合成來(lái)源。
通過(guò)將這些重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系中，可使它們產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)競(jìng)爭(zhēng)性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體粒子(參見(jiàn)美國(guó)專利第5,591,624號(hào))。通過(guò)將嵌合型整合酶結(jié)合到該逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子中，可構(gòu)建可以位點(diǎn)特異性整合到宿主細(xì)胞DNA中的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見(jiàn)WO96/37626)。較佳的是，該重組病毒載體是復(fù)制缺陷性重組病毒。
適合用于上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是周知的，并且易于制備(參見(jiàn)WO95/30763和WO92/05266)，并且，這些細(xì)胞系可用于產(chǎn)生用于生產(chǎn)重組載體粒子的生產(chǎn)性細(xì)胞系(也稱為載體細(xì)胞系或“VCL”)。較佳的是，這些包裝細(xì)胞系由人的親本細(xì)胞(如HT1080細(xì)胞)或水貂的親本細(xì)胞系(在人血清中可恢復(fù)活性)制得。
用于構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的較佳逆轉(zhuǎn)錄病毒包括鳥(niǎo)類白血病毒、牛白血病毒、鼠類白血病毒、水貂細(xì)胞病灶誘導(dǎo)性病毒、鼠類肉瘤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒和勞氏肉瘤病毒。特別優(yōu)選的鼠類白血病毒包括4070A和1504A〔Hartley和Rowe(1976)，J Virol，1919-25〕、Abelson(ATCC第VR-999號(hào))、Friend(ATCC第VR-245號(hào))、Graffi、Gross(ATCC第VR-590號(hào))、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC第VR-998號(hào))和莫洛尼鼠類白血病毒(ATCC第VR-190號(hào))?？蓮氖詹靥幓虮２厮缭隈R里蘭Rockville的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏所(“ATCC”)獲得這些逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者使用通?？色@得的技術(shù)從已知的來(lái)源中分離得到。
可用在本發(fā)明中的已知逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療載體的例子包括那些在下述專利申請(qǐng)中描述的載體GB2200651、EP0415731、EP0345242、EP0334301、WO89/02468、WO89/05349、WO89/0927l、WO90/02806、WO90/07936、WO94/03622、WO93/25698、WO93/25234、WO93/11230、WO93/10218、WO91/02805、WO91/02825、WO95/07994、US5,219,740、US4,405,712、US4,861,719、US4,980,289、US4,777,127、US5,591,624。還可參見(jiàn)Vile(1993)，CancerRes，533860-3864；Vile(1993)，CancerRes，53962-967；Ram(1993)，CancerRes 53(1993)，83-88；Takamiya(1992)，J Neurosci Res，33493-503；Baba(1993)，J Neurosurg，79729-735；Mann(1983)，Cell，33153；Cane(1984)，Proc Natl AcadSci，816349；和Miller(1990)，Human Gene Therapy 1。
人的腺病毒基因治療載體在本領(lǐng)域中也是已知的，并可用在本發(fā)明中。例如可參見(jiàn)Berkner(1988)，Biotechniques，6616和Rosenfeld(1991)，Science，252431；和WO93/07283、WO93/06223和WO 93/07282。可用在本發(fā)明的已知的腺病毒基因治療載體的例子包括上述文獻(xiàn)所述的載體以及下述文獻(xiàn)中描述的載體WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984、WO95/00655、WO95/27071、WO95/29993、WO95/34671、WO96/05320、WO94/08026、WO94/11506、WO93/06223、WO94/24299、WO95/14102、WO95/24297、WO95/02697、WO94/28152、WO94/24299、WO95/09241、WO95/25807、WO95/05835、WO94/18922和WO95/09654?；蛘撸墒褂肅uriel(1992)，Hum.Gene Ther.，3147-154所述給予連接于被殺死的腺病毒的DNA。本發(fā)明的基因傳送工具還可包括腺伴隨病毒(AAV)載體。用于本發(fā)明的這些載體的主要和較佳的例子是Srivastava的WO93/09239中公開(kāi)的以AAV-2為基礎(chǔ)的載體。大多數(shù)較佳的AAV載體含有這兩個(gè)AAV反向末端重復(fù)單元，在該單元中，天然的D-序列經(jīng)核苷酸的取代而被修飾，這樣至少5個(gè)天然核苷酸到18個(gè)天然核苷酸、較佳至少10個(gè)到18個(gè)、最佳10個(gè)天然核苷酸被保留，該D-序列的其余核苷酸則被刪除或被非天然核苷酸取代。這些AAV反向末端重復(fù)單元的天然D-序列是在各AAV反向末端重復(fù)單元(即每端各有一條序列)有20個(gè)連續(xù)的核苷酸的序列，這些序列不參與HP的形成。非天然取代核苷酸可以是除了在天然D-序列的相同位置上發(fā)現(xiàn)的核苷酸以外的任何核苷酸。其它可使用的AAV載體的例子是pWP-19、pWN-1，這兩個(gè)載體已在Nahreini(1993)，Gene，124257-262中公開(kāi)。這種AAV載體的另一例子是psub201〔參見(jiàn)Samulski(1987)，J.Virol.，613096〕。AAV載體的另一例子是Double-D ITR載體。Double-D ITR載體的構(gòu)建已在美國(guó)專利第5,478,745中公開(kāi)。還有其它的例子在Carter的美國(guó)專利第4,797,368號(hào)和Muzyczka的美國(guó)專利第5,139,941號(hào)、Chartejee的美國(guó)專利第5,474,935號(hào)和Kotin的WO94/288157中公開(kāi)?？捎迷诒景l(fā)明中的AAV載體又一例子是SSV9AFABTKneo，它含有AFP增強(qiáng)子和清蛋白啟動(dòng)子，它主要在肝中指導(dǎo)表達(dá)。它的結(jié)構(gòu)和構(gòu)造在Su(1996)，Human Gene Therapy，7463-470中公開(kāi)。另外一些AAV基因治療載體已在US5,354,678、US5,173,414、US5,139,941和US5,252,479中公開(kāi)。
本發(fā)明的基因治療載體還包括皰疹載體。主要的和較佳的例子是含有編碼胸苷激酶多肽的序列的單純皰疹病毒載體，如US5,288,641和EP0176170(Roizman)中公開(kāi)的那些載體。單純皰疹病毒載體的另外的例子包括WO95/04139(WistarInstitute)中公開(kāi)的HFEM/ICP6-LacZ、Geller(1998，Science，2411667-1669)和WO99/0944 1以及WO92/07945中描述的pHSVlac、Fink(1992，Human GeneTherapy，311-19)描述的HSVpgC-lacZ和EP0453242(Breakefield)中所述的HSV7134、2 RH 105和GAL4，以及那些保藏在ATCC中登記號(hào)為ATCC VR-977和ATCC VR-260的載體。
還考慮的是甲病毒基因治療載體，這種載體也可用在本發(fā)明中。較佳的甲病毒載體是新培斯病毒載體。披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCC VR-67、ATCCVR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Rose River病毒(ATCC VR-373、ATCCVR-1246)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250、ATCC VR-1249、ATCC VR-532)和在美國(guó)專利第5,091,309號(hào)、第5,217,879號(hào)和WO92/10578中描述的那些載體。更具體而言，在美國(guó)系列號(hào)08/405627(1995年3月15日提交)、WO94/21792、WO92/10578、WO95/07994、US5,091,309和US5,217,879中所述的那些甲病毒載體也可在本發(fā)明中使用?？蓮娜珩R里蘭Rockville的ATCC中獲得這類甲病毒，或者使用常規(guī)可獲得的技術(shù)從已知的來(lái)源中分離獲得。較佳是使用減弱的細(xì)胞毒性的甲病毒載體(參見(jiàn)USSN08/679640)。
還將DNA載體系統(tǒng)(如真核生物分層表達(dá)系統(tǒng))用于本發(fā)明的核酸的表達(dá)。參見(jiàn)WO95/07994，該文有關(guān)于真核生物分層表達(dá)系統(tǒng)的詳細(xì)描述。較佳的是，本發(fā)明的真核生物分層表達(dá)系統(tǒng)從甲病毒載體中獲得，最佳是從新培斯病毒載體獲得。
適合用于本發(fā)明的其它病毒載體包括，從脊髓灰質(zhì)炎病毒獲得的那些載體(例如ATCC VR-58)；和Evans〔Nature，339(1989)，385〕和Sabin(1973，J.Biol.Standardization，1115)描述的那些載體；鼻病毒，如ATCC VR-1110和Amold(1990，J Cell Biochem，L401)描述的那些；痘病毒，如金絲雀痘病毒或牛痘病毒，例如ATCC VR-111和ATCC VR-2010和Fisher-Hoch(1989，Proc Natl Acad Sci，86317)、Flexner(1989，Ann NY Acad Sci，56986)、Flexner(1990，Vaccine，817)、US4,603,112和US4,769,330以及WO89/01973中所述的那些載體；SV40病毒，例如，ATCC VR-305和那些在Mulligan(1979，Nature，277108)和Madzak(1992，J Gen Virol，731533)所述的載體；流感病毒，例如ATCC VR-797和使用如US5,166,057和Enami(1990，Proc Natl Acad Sci，873802-3805)、Enami和Palese(1991，J Virol，652711-2713)和Luytjes〔1989，Cell，59110，還可參見(jiàn)McMichael(1983)，NEJ Med，30913和Yap(1978)，Nature，273238和Nature(1979)，277108〕中所述的反向遺傳學(xué)技術(shù)制得的重組流感病毒；EP-0386882和Buchschacher(1992，J.Vrol.，662731)中所述的人免疫缺陷病毒；麻疹病毒，如ATCC VR-67和VR-1247和EP-0440219中所述；Aura病毒，例如ATCC VR-368；Bebaru病毒，例如，ATCC VR-600和ATCC VR-1240；Cabassou病毒，例如ATCCVR-922；Chikungunya病毒，例如ATCC VR-64和ATCC VR-1241；Fort Morgan病毒，例如ATCC VR-924；Getah病毒，例如ATCC VR-369和ATCC VR-1243；Kyzylagach病毒，例如ATCC VR-927；Mayaro病毒，例如ATCC VR-66；Mucambo病毒，例如ATCC VR-580和ATCC VR-1244；Ndumu病毒，例如ATCC VR-371；Pixuna病毒，例如ATCC VR-372和ATCC VR-1245；Tonate病毒，例如ATCCVR-925；Triniti病毒，例如ATCC VR-469；Una病毒，例如ATCC VR-374；Whataroa病毒，例如ATCC VR-926；Y-62-33病毒，例如ATCC VR-375；O＇Nyong病毒、東部腦炎病毒，例如ATCC VR-65和ATCC VR-1242；西部腦炎病毒，例如ATCCVR-70、ATCC VR-1251、ATCC VR-622和ATCC VR-1252；和冠狀病毒，例如ATCC VR-740和Hamre(1966，Proc Soc Exp Biol Med，121190)中所述。
并不限于使用上述載體將本發(fā)明的組合物傳送到細(xì)胞中?？墒褂闷渌膫魉头椒ê徒橘|(zhì)，如核酸表達(dá)載體、僅連接或未連接被殺死的腺病毒的多陽(yáng)離子濃縮的DNA〔例如參見(jiàn)美國(guó)系列號(hào)08/366,787(1994年12月30日提交)和Curiel(1992)，Hum Gene Ther，3147-154〕、配體連接的DNA〔例如參見(jiàn)Wu(1989)，J Biol Chem，26416985-16987〕、原核生物細(xì)胞傳送工具細(xì)胞〔如參見(jiàn)美國(guó)系列號(hào)08/240,030(1994年5月8日提交)和美國(guó)系列號(hào)08/404,796〕、如美國(guó)專利第5,149,655號(hào)所述的使光聚合的水凝膠物質(zhì)沉積和手控基因轉(zhuǎn)移粒子槍、如US5,206,152和WO92/11033中所述的電離輻射、核電荷中和或與細(xì)胞膜的融合。其它的方法在Philip(1994)，Mol CellBiol，142411-2418和Woffendin(1994)，Proc NatlAcad Sci，911581-1585中有所描述。
可使用粒子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，如可參見(jiàn)美國(guó)系列號(hào)60/023,867。簡(jiǎn)言之，可將該序列插入含有用于高水平表達(dá)的常規(guī)控制序列的常規(guī)載體中，然后使其與合成的基因轉(zhuǎn)移分子(如聚合的DNA結(jié)合陽(yáng)離子，如聚賴氨酸、魚(yú)精蛋白和清蛋白)，使其連接于細(xì)胞靶向配體，如Wu和Wu(1987，J.Biol.Chem.，2624429-4432)所述的脫唾液酸血清類粘蛋白、Hucked(1990，Biochem Pharmacol，40253-263)所述的胰島素、Plank(1992，Bioconjugate Chem，3533-539)所述的半乳糖、乳糖或運(yùn)鐵蛋白。
也可使用裸DNA。導(dǎo)入裸DNA的方法的例子在WO90/11092和US5,580,859中有所描述。使用生物可降解的膠乳珠可改進(jìn)攝取的效率。包涂在膠乳珠上的DNA在這些珠啟動(dòng)的胞吞作用后可有效地被輸送到細(xì)胞中。通過(guò)對(duì)這些珠進(jìn)行處理，使它們的疏水性增加，從而促進(jìn)內(nèi)涵體的破壞并將DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這樣可進(jìn)一步改進(jìn)此方法。
在US5,422,120、WO95/13796、WO94/23697、WO91/14445和EP-524,968中描述了可用作基因傳送工具的脂質(zhì)體。如USSN60/023,867中所述，對(duì)于非病毒傳送，可將編碼多肽的核酸序列插入含有用于高水平表達(dá)的常規(guī)控制序列的常規(guī)載體中，然后使其與合成的基因轉(zhuǎn)移分子培育，如聚合的DNA結(jié)合陽(yáng)離子(如聚賴氨酸、魚(yú)精蛋白和清蛋白)，使其連接于細(xì)胞靶向配體，如脫唾液酸血清類粘蛋白、胰島素、半乳糖、乳糖或運(yùn)鐵蛋白。其它的傳送系統(tǒng)包括使用脂質(zhì)體包被含有在各種組織特異性或普遍存在的活躍的啟動(dòng)子控制之下的基因的DNA。適合使用的非病毒傳送系統(tǒng)還包括機(jī)械傳送系統(tǒng)，如Woffendin等人〔1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(24)11581-11585〕所述的方法。此外，可通過(guò)光聚合水凝膠物質(zhì)的沉積作用傳送該編碼序列或其表達(dá)產(chǎn)物。可用于傳送編碼序列的基因傳送的其它常規(guī)方法包括，如使用手控基因轉(zhuǎn)移粒子槍(如US5149,655所述)、使用電離輻射以激活轉(zhuǎn)移的基因(如US5,206,152和WO/9211033所述)。
示范性的脂質(zhì)體和多陽(yáng)離子基因傳送工具是下述文獻(xiàn)中描述的那些US5,422,120和4,762,915，WO95/13796，WO94/23697和WO91/14445，EP-0524968，Stryer〔Biochemistry，第236-240頁(yè)(1975)〕，W.H.Freeman，洛杉磯；Szoka〔(1980)，Biochem Biophys Acta，6001〕，Bayer〔(1979)，Biochem Biophys Acta，550464；Rivnay〔(1987)，Meth Enzymol，149119〕；Wang〔(1987)，Proc Natl Acad Sci，847851〕；Plant〔(1989)，AnalBiochem，176420〕。
多核苷酸組合物可含有治療有效量(定義如上)的基因治療工具。對(duì)于本發(fā)明的目的，有效的劑量是每個(gè)給藥個(gè)體約0.01mg/kg到50mg/kg或者約0.05mg/kg到約10mg/kg的DNA構(gòu)建物。
傳送方法一旦配制成藥劑，本發(fā)明的多核苷酸組合物就可以下述方式給予(1)直接給予；(2)離體傳送給從受試對(duì)象獲得的細(xì)胞；或者(3)體外用于重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。要治療的對(duì)象可以是哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類。也可治療人。
通常通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)、靜脈或肌肉內(nèi)注射或者傳送到組織間隙中，以實(shí)現(xiàn)這些組合物的傳送。也可將這些組合物施加到病灶中。給藥的其它模式包括口服和肺部給藥、栓劑和經(jīng)皮或皮下使用(如參見(jiàn)WO98/20734)、使用針頭和基因槍或無(wú)針注射器給藥。劑量治療可以是單劑份方案或多劑份方案。
離體傳送然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再移植到受試對(duì)象體中的方法在本領(lǐng)域中是已知的，在如WO93/14778中有所描述。用于離體用途的細(xì)胞的例子包括，例如干細(xì)胞，尤其是造血干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞。
通常，通過(guò)下述方法可實(shí)現(xiàn)用于離體和體外用途的核酸的傳送，例如，葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染作用、磷酸鈣沉淀作用、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染作用、原生質(zhì)體融合作用、電穿孔作用、將多核苷酸包被在脂質(zhì)體中和將DNA直接顯微注射到細(xì)胞核中，這些方法在本領(lǐng)域中都是已知的。
多核苷酸和多肽藥物組合物除了上述的藥學(xué)上可接受的載體和鹽外，多核苷酸和多肽組合物中還可采用下列附加試劑。
A.多肽一個(gè)例子是多肽，其包括但不局限于脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)；運(yùn)鐵蛋白；脫唾液酸糖蛋白；抗體；抗體片段；鐵蛋白；白介素；干擾素；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、干細(xì)胞因子和促紅細(xì)胞生成素。還可使用病毒抗原，如包膜蛋白。另外，可用來(lái)自其它侵襲性生物的蛋白，例如瘧原蟲(chóng)惡性瘧疾的環(huán)孢子蛋白的17個(gè)氨基酸的肽(稱為RII)。
B.激素，維生素等其它可包括的種類例如是激素、類固醇、雄激素、雌激素、甲狀腺激素或維生素、葉酸。
C.聚亞烷基、多糖等另外，聚(亞烷基)二醇可以和所需的多核苷酸或多肽組合在一起。在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，聚(亞烷基)二醇是聚乙二醇。另外，可以加入單糖、二糖或多糖。在此方面的一個(gè)較佳實(shí)施方案中，多糖是葡聚糖或DEAE-葡聚糖。另外有脫乙酰殼多糖和聚(丙交酯-共-乙交酯)。
D.脂質(zhì)和脂質(zhì)體所需的多核苷酸或多肽還可在輸送給對(duì)象或?qū)ο笱苌募?xì)胞之前包裹在脂質(zhì)中或包裹在脂質(zhì)體中。
脂質(zhì)包裹通常用能穩(wěn)定結(jié)合或捕獲并保留核酸的脂質(zhì)體來(lái)實(shí)現(xiàn)。濃縮的多核苷酸與脂質(zhì)制劑之比可以不同，但是通常在約1∶1(毫克DNA∶微摩爾脂質(zhì))之間，或脂質(zhì)更多。關(guān)于脂質(zhì)體作為輸送核酸的載體的綜述參見(jiàn)Hug和Sleight(1991)Biochim.Biophys.Acta.10971-17；Straubinger(1983)Meth.Enzymol.101512-527。
用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包括陽(yáng)離子(帶正電荷)、陰離子(帶負(fù)電荷)和中性制劑。陽(yáng)離子脂質(zhì)體已經(jīng)顯示出能以有功能的形式介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的胞內(nèi)輸送(Felgner(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7416)；mRNA(Malone(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081)；和純化的轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)輸送(Debs(1990)J.Biol.Chem.26510189-10192)。
陽(yáng)離子脂質(zhì)體很容易購(gòu)得。例如，N〔1-2，3-二油烯基氧)丙基〕-N，N，N-三乙銨(DOTMA)脂質(zhì)體可以以Lipofectin的商標(biāo)從GIBCO BRL，Grand Island，NY購(gòu)得。(另見(jiàn)Felgner，同上)。其它商品脂質(zhì)體包括transfectace(DDAB/DOPE)和DOTAP/DOPE(Boerhinger)。其它陽(yáng)離子脂質(zhì)體可用本領(lǐng)域熟知的方法從易購(gòu)得的材料制得。例如參見(jiàn)，Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754194-4198；WO90/11092關(guān)于DOTAP(1，2-二(油?；?-3-(三甲基銨溶)丙烷〕脂質(zhì)體合成的描述。
同樣，陰離子和中性脂質(zhì)體也是容易獲得的，例如購(gòu)自Avanti PolarLipids(birmingham，AL)，或容易用易購(gòu)得的材料制得。這種材料包括磷脂酰膽堿、膽固醇、磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二油?；字８视?DOPG)、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)。這些材料還能以合適比例與DOTMA和DOTAP原料混合。用這些材料制備脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域熟知的。
脂質(zhì)體可包含多層脂質(zhì)體(MLV)，小的單層脂質(zhì)體(SUV)、或大的單層脂質(zhì)體(LUV)。各種脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物可用本領(lǐng)域已知的方法制得。例如參見(jiàn)Straubinger(1983)Meth.Immunol.101512-527；Szoka(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754194-4198；Papahadjopoulos(1975)Biochim.Biophys.Acta 394483；Wilson(1979)Cell 1777)；Deamer和Bangham(1976)Biochim.Biophys.Acta 443629；Ostro(1977)Biochem.Biophys.Res.Commun.76836；Fraley(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 763348)；Enoch和Strittmatter(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76145；Fraley(1980)J.Biol.Chem.(1980)25510431；Szoka和Papahadjopoulos(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75145；以及Schaefer-Ridder(1982)Science 215166。
E.脂蛋白另外，脂蛋白也可加入待輸送的多核苷酸或多肽中。采用的脂蛋白的例子包括乳糜微粒、HDL、IDL、LDL和VLDL。還可采用這些蛋白的突變體、片段或融合蛋白。另外，可采用天然存在的脂蛋白的修飾物，例如乙?；腖DL。這些脂蛋白能使多核苷酸的輸送指向表達(dá)脂蛋白受體的細(xì)胞。較佳的是，如果待輸送的多核苷酸中加入了脂蛋白，則組合物中不加入其它尋靶的配體。
天然存在的脂蛋白包含脂質(zhì)和蛋白部分。蛋白部分稱為脫輔基蛋白。目前，已經(jīng)分離并鑒定出了脫輔基蛋白A、B、C、D和E。其中至少有兩個(gè)含有幾種蛋白，用羅馬數(shù)字AI、AII、AIV；CI、CII、CIII命名。
脂蛋白可包含多個(gè)脫輔基蛋白。例如，天然存在的乳糜微粒包含A、B、C和E，隨著時(shí)間的推移，這些脂蛋白失去A，得到C和E脫輔基蛋白。VLDL包含A、B、C、和E脫輔基蛋白，LDL包含脫輔基蛋白B；HDL包含脫輔基蛋白A、C和E。
這些脫輔基蛋白的氨基酸是已知的，并且在下列文獻(xiàn)中有所描述Breslow(1985)Annu Rev.Biochem 54699；Law(1986)Adv.Exp Med.Biol.151162；Chen(1986)J Biol Chem 26112918；Kane(1980)Proc Natl Acad Sci USA 772465；andUtermann(1984)Hum Genet 65232。
脂蛋白含有各種脂質(zhì)，包括甘油三酯、膽固醇(游離的和酯型)以及磷脂。天然存在的脂蛋白中脂質(zhì)的組成是不同的。例如，乳糜微粒主要含甘油三酯。關(guān)于天然存在的脂蛋白的脂質(zhì)含量更詳細(xì)的描述可在例如Meth.Enzymol.128(1986)中找到。選擇脂質(zhì)的組成，以使脫輔基蛋白的構(gòu)型有利于受體結(jié)合活性。還可選擇脂質(zhì)的組成，以促進(jìn)與多核苷酸結(jié)合分子中的疏水性相互作用和結(jié)合。
天然存在的脂蛋白可以用諸如超離心方法從血清中分離出來(lái)。這些方法在Meth.Enzymol.(同上)；Pitas(1980)J.BioChem.2555454-5460以及Mahey(1979)JClin.Invest 64743-750中有所描述。脂蛋白還可在體外產(chǎn)生，或通過(guò)在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)脫輔基蛋白基因的重組方法產(chǎn)生。例如參見(jiàn)Atkinson(1986)Annu RevBiophys Chem 15403和Radding(1958)Biochim Biophys Acta 30443。脂蛋白也可購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商，如Biomedical Techniologies，Inc.，Stoughton，Massachusetts，USA。關(guān)于脂蛋白的進(jìn)一步描述可在Zuckermann等人的WO98/06437中找到。
F.聚陽(yáng)離子試劑聚陽(yáng)離子試劑可以與或不與脂蛋白一起包括在含所需待輸送多核苷酸/多肽的組合物中。
聚陽(yáng)離子試劑通常在生理性相關(guān)的pH下表現(xiàn)出凈的正電荷，并能中和核酸的電荷，而有助于輸送至所需位置。這些試劑具有體外、活體外和體內(nèi)的用途。聚陽(yáng)離子試劑可用來(lái)將核酸通過(guò)肌內(nèi)或皮下等輸送至活的對(duì)象。
下面是用作聚陽(yáng)離子試劑的多肽例子聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸和魚(yú)精蛋白。其它例子包括組蛋白、魚(yú)精蛋白、人血清白蛋白、DNA結(jié)合蛋白、非組蛋白染色體蛋白、DNA病毒的外殼蛋白，如(X174，轉(zhuǎn)錄因子還含有結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域，因此可用作核酸凝聚劑。簡(jiǎn)言之，轉(zhuǎn)錄因子如C/CEBP、c-jun、c-fos、AP-1、AP-2、AP-3、CPF、Prot-1、Sp-1、Oct-1、Oct-2、CREP、和TFIID含有結(jié)合DNA序列的基本結(jié)構(gòu)域。聚陽(yáng)離子有機(jī)試劑包括精胺、亞精胺和腐胺。
從上面的清單可以推出聚陽(yáng)離子試劑的尺寸和物理性能，以構(gòu)建其它多肽聚陽(yáng)離子試劑或產(chǎn)生合成的聚陽(yáng)離子試劑。有用的合成聚陽(yáng)離子試劑例如包括，DEAE-葡聚糖、Polybrene。LipofectinTM和lipofectAMINETM是與多核苷酸/多肽組合時(shí)形成聚陽(yáng)離子復(fù)合物的單體。
免疫診斷檢測(cè)本發(fā)明的奈瑟球菌抗原可用在免疫測(cè)定中，以檢測(cè)抗體水平(或者相反地，可使用抗奈瑟球菌抗體檢測(cè)抗原的水平)?？砂l(fā)展以明確的重組抗原為基礎(chǔ)的免疫測(cè)定，以替換侵入性診斷方法。可檢測(cè)針對(duì)生物樣品(包括血液和血清樣品)中奈瑟球菌蛋白質(zhì)的抗體。免疫測(cè)定的設(shè)計(jì)變化極大，其中多數(shù)是本領(lǐng)域已知的。免疫測(cè)定的方案可以如競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)、或直接反應(yīng)或者夾心式試驗(yàn)為基礎(chǔ)。這些方案也可使用如固相支持物，或者通過(guò)免疫沉淀進(jìn)行。大多數(shù)的測(cè)定涉及使用標(biāo)記的抗體或多肽；這些標(biāo)記物可以是如熒光素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)或染料分子。由探針?lè)糯笮盘?hào)的試驗(yàn)也是已知的；這類試驗(yàn)的例子是使用生物素和抗生物素蛋白的測(cè)定以及酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫測(cè)定(如ELISA)。
通過(guò)使適當(dāng)?shù)牟牧?包括本發(fā)明的組合物)與進(jìn)行試驗(yàn)所需的剩余的試劑以及材料(如適當(dāng)?shù)木彌_液、鹽溶液等)包裝在合適的容器中，構(gòu)建適合用于免疫診斷并含有適當(dāng)?shù)臉?biāo)記試劑的試劑盒，同時(shí)提供適當(dāng)?shù)臏y(cè)定說(shuō)明。
核酸雜交“雜交”指兩個(gè)核酸序列相互之間通過(guò)氫鍵而結(jié)合。通常，一個(gè)序列固定于固體載體，另一個(gè)將游離于溶液內(nèi)。然后，在有利于形成氫鍵的條件下使兩個(gè)序列相互接觸。影響這種結(jié)合的因素包括溶劑的類型和體積；反應(yīng)溫度；雜交時(shí)間；攪拌；封閉液相序列與固體載體非特異性結(jié)合的試劑(Denhardt＇s試劑或BLOTTO)；各序列的濃度；是否使用化合物來(lái)增加序列結(jié)合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及雜交后洗滌條件的嚴(yán)謹(jǐn)程度。見(jiàn)Sambrook等人〔同上〕第2卷，第9章，9.47至9.57頁(yè)。
“嚴(yán)謹(jǐn)性”指有利于非常相似的序列結(jié)合而不利于不同序列結(jié)合的雜交反應(yīng)條件。例如，應(yīng)選擇溫度和鹽濃度的組合，使溫度比所研究的雜交的Tm計(jì)算值低大約120至200℃。溫度和鹽濃度?？赏ㄟ^(guò)初步實(shí)驗(yàn)中憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，在初步實(shí)驗(yàn)中，固定在濾膜上的基因組DNA樣品與感興趣的序列雜交，然后在不同的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下洗滌。見(jiàn)Sambrook等人第9.50頁(yè)。
在進(jìn)行例如Southern印跡時(shí)，要考慮的參數(shù)是(1)待印跡的DNA的復(fù)雜性以及(2)探針與受檢測(cè)序列之間的同源性。對(duì)于高度復(fù)雜的真核基因組中的單拷貝基因，待研究片段的總量可以在10的一個(gè)數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)變化，質(zhì)粒為0.1至1微克，或?qū)⑹删w消化至10-9至10-8克。對(duì)于復(fù)雜性較低的多核苷酸，可以采用實(shí)際上更短的印跡、雜交以及接觸時(shí)間，更少量的起始多核苷酸，以及比活更低的探針。例如，從1微克酵母DNA開(kāi)始，用僅僅1小時(shí)的接觸時(shí)間，印跡2小時(shí)，然后和108cpm/μg的探針雜交4-8小時(shí)，就可以檢測(cè)單拷貝酵母基因。對(duì)于單拷貝哺乳動(dòng)物基因而言，一種保守的方法是從10微克DNA開(kāi)始，印跡過(guò)夜，在10％硫酸葡聚糖存在下用108cpm/μg以上的探針雜交過(guò)夜，導(dǎo)致接觸時(shí)間約為24小時(shí)。
有幾個(gè)因素可能會(huì)影響探針與感興趣片段之間的DNA-DNA雜交物的解鏈溫度(Tm)，因而影響雜交和洗滌的合適條件。在許多情況下，探針并非與待測(cè)片段100％同源。其它常常遇到的變量包括雜交序列的長(zhǎng)度和G+C總含量，以及雜交緩沖液的離子強(qiáng)度和甲酰胺含量。所有這些因素的作用可近似表示成一個(gè)方程式Tm＝81+16.6(log10Ci)+0.4〔％(G+C)〕-0.6(％甲酰胺)-600/n-1.5(％錯(cuò)配)式中Ci是鹽濃度(單價(jià)離子)，n是雜交物堿基對(duì)的長(zhǎng)度(對(duì)Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284的方法稍作了修改)。
在設(shè)計(jì)雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，影響核酸雜交的一些因素可以方便地予以改變。雜交和洗滌時(shí)的溫度以及洗滌時(shí)的鹽濃度的調(diào)節(jié)最為簡(jiǎn)單。隨著雜交溫度(即嚴(yán)謹(jǐn)度)的升高，不同源的鏈之間發(fā)生雜交的可能性變得更少，結(jié)果背景值降低。如果放射性標(biāo)記的探針并非與固定的片段完全同源(這在基因家族和種間雜交實(shí)驗(yàn)中是常見(jiàn)的)，則必須降低雜交溫度，而背景值將會(huì)增加。洗滌溫度以類似的方式影響雜交帶的強(qiáng)度和背景值的程度。洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性也隨鹽濃度的降低而升高。
通常，在50％甲酰胺存在下的方便的雜交溫度是對(duì)于靶片段同源性達(dá)95％至100％的探針而言，是42℃；對(duì)于同源性為90％至95％的探針，為37℃；對(duì)于同源性為85％和90％的探針，為32℃。對(duì)于較低的同源性，應(yīng)用上述方程式應(yīng)相應(yīng)地降低甲酰胺含量和調(diào)節(jié)溫度。如果探針和靶片段之間的同源性是未知的，則最簡(jiǎn)單的方法是從非嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交和洗滌條件開(kāi)始。如果在放射自顯影后發(fā)現(xiàn)了非特異性的條帶或高背景值，則可在高嚴(yán)謹(jǐn)性下洗滌濾膜，并重新曝光。如果曝光所需時(shí)間使得該方法不切實(shí)際，則應(yīng)平行測(cè)試幾種雜交和/或洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性。
腦膜炎球菌80-85kDa蛋白質(zhì)的鑒定已發(fā)現(xiàn)從腦膜炎奈瑟球菌血清群B制備的多種外膜小泡制劑含有約80-85kDa的成分。用SDS-PAGE凝膠純化該蛋白質(zhì)并進(jìn)行N-端測(cè)序(SEQ ID 1)。
制備的抗SDS-PAGE純化蛋白的抗體與50種以上的不同血清群和血清型的腦膜炎奈瑟球菌菌株中的當(dāng)量蛋白質(zhì)相互反應(yīng)。還觀察到與淋病奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌(N.polysaccharia)和乳糖奈瑟球菌(N.lactamica)的交叉反應(yīng)。接受過(guò)疫苗的患者的血清也與該蛋白質(zhì)反應(yīng)。
從血清群B腦膜炎奈瑟球菌克隆了完整的基因(SEQ ID 2)，并推斷其編碼的蛋白質(zhì)(SEQ ID 3)。通過(guò)與上述N-端測(cè)序相比較，推斷出信號(hào)肽(SEQ ID 4)和成熟序列(SEQ ID 5)。
腦膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌中相應(yīng)基因的鑒定在血清群B腦膜炎奈瑟球菌序列的基礎(chǔ)上，克隆和測(cè)序了腦膜炎奈瑟球菌血清群A和淋病奈瑟球菌的相應(yīng)序列(稱為‘ORF21’)。
SEQ ID 6列出了血清群A腦膜炎奈瑟球菌的完整基因，SEQ ID 7列出了其所編碼的蛋白質(zhì)。SEQ ID 8和9是信號(hào)肽和成熟序列。
SEQ ID 10列出了淋病奈瑟球菌的完整序列，SEQ ID 11列出了其編碼的蛋白質(zhì)。SEQ ID 12和13為信號(hào)肽和成熟序列。
序列的比較將這些蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們是高度同源的。
腦膜炎奈瑟球菌血清群B序列和淋病奈瑟球菌序列顯示在797aa重疊的片段中有95.4％相同。
10 2030405060orf21.pepMKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA|||||||||||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep MKLKQIASALMMLGISPLAFADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA10 203040506070 8090 100 110 120orf21.pepIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ70 8090 100 110 120130 140 150 160 170 180orf21.pepSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240orf21.pepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL||||||||||||||||||||||||||||||::|::|||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep FEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSDRFDRQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300orf21.pepDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ|||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep DTDIQTNEDKTRQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ250 260 270 280 290 300310 320 330 340 350 360orf21.pepMTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT|||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAGTKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT310 320 330 340 350 360370 380 390 400 410 420orf21.pepRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE370 380 390 400 410 420430 440 450 460 470 480orf21.pepRSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA430 440 450 460 470 480490 500 510 520 530 540orf21.pepDGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT||||||||:|||||||||||||:|||||||||:|:||::||||||||||||:||||||||orf21ng.pep DGVSLGYDIYGKAFDPRKASTSVKQYKTTTAGGGVRMGIPVTEYDRVNFGLAAEHLTVNT490 500 510 520 530 540550 560 570 580 590 600orf21.pepYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA||||||:|||||:|||||||:|||||| |||||||||||||||| |||||||||||||||orf21ng.pep YNKAPKRYADFIRKYGKTDGADGSFKGLLYKGTVGWGRNKTDSASWPTRGYLTGVNAEIA550 560 570 580 590 600610 620 630 640 650 660orf21.pepLPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR610 620 630 640 650 660670 680 690 700 710 720orf21.pepGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG670 680 690 700 710 720730 740 750 760 770 780orf21.pepKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK:||::| :| :::|: |:||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21ng.pep RTY----TAAENGNNKSVYSE-NAHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK730740 750 760 770790orf21.pepKPEDEIQRFQFQLGTTF|||||||||||||||||orf21nG.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX780 790腦膜炎奈瑟球菌A血清群和B血清群在797個(gè)氨基酸重疊序列中顯示出99.9％的同一性102030405060orf21.pepMKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA|||||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep MKLKQIASALMVLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSA102030405060708090 100 110 120orf21.pepIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep IIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQ708090 100 110 120130 140 150 160 170 180orf21.pepSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep SQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIE130 140 150 160 170 180190 200 210 220 230 240orf21.pepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21apepFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRIL190 200 210 220 230 240250 260 270 280 290 300irf21.pepDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep DTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ250 260 270 280 290 300310 320 330 340 350 360irf21pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep MTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKT310 320 330 340 350 360370 380 390 400 410 420orf21.pepRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep RDEVVRRELRQMESAPYDTSkLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTE370 380 390 400 410 420
430 440 450 450 470 480orf21.pepRSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep RSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA430 440 450 460 470 480490 500 510 520 530 540orf21.pepDGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep DGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNT490 500 510 520 530 540550 560 570 580 590 600orf21.pepYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIA550 560 570 580 590 600610 620 630 640 650 660orf21.pepLPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep LPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVR610 620 630 640 650 660670 680 690 700 710 720orf21.pepGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep GYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDG670 680 690 700 710 720730 740 750 760 770 780orf21.pepKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||orf21a.pep KTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKK730 740 750 760 770 780790orf21.pepKPEDEIQRFQFQLGTTF|||||||||||||||||orf21a.pep KPEDEIQRFQFQLGTTFX790高度的保守說(shuō)明，單一的蛋白質(zhì)可能會(huì)針對(duì)各種奈瑟球菌種類誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
疫苗使上述鑒別的三種蛋白質(zhì)表達(dá)，然后將它們用于免疫接種。觀察到針對(duì)這些蛋白質(zhì)的良好的免疫應(yīng)答。
組合疫苗此外，使這些蛋白質(zhì)各自與針對(duì)其它病原生物體(如針對(duì)腦膜炎C血清群的Chiron多糖疫苗)的抗原混合，并用于免疫接種。觀察到良好的免疫應(yīng)答。
另外的NmB組分雖然這種挪威OMV疫苗是有效的，但是它產(chǎn)生的保護(hù)作用受到制備它的菌株的限制。使用這種疫苗對(duì)青少年進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在29個(gè)月后僅獲得57.2％的有效率，雖然觀察到幾乎100％的患者有IgG應(yīng)答〔如Rosenqvist等人(1995)，Infect.Immun.，634642-4652〕。
令人意外的是，已發(fā)現(xiàn)將另外確定的組分加到該挪威OMV疫苗中的做法明顯擴(kuò)大了該疫苗的有效率。
挪威疫苗并沒(méi)有產(chǎn)生針對(duì)NmB 2996菌株的保護(hù)作用。將從2996菌株獲得的確定的蛋白質(zhì)加到該挪威疫苗中，結(jié)果顯示該疫苗的藥學(xué)以令人驚訝的程度增加。而且，加入NmC多糖連接抗原〔如Costantino等人(1992)，Vaccine，10691-698〕獲得優(yōu)異的結(jié)果。
下表給出這些組合物的殺菌活性

*使用3種不同的NmB抗原#1ORF1——如WO99/24578(還可參見(jiàn)WO99/55873)的實(shí)施例77#2＇287＇蛋白——如WO99/57280的圖21(還可參見(jiàn)SEQ ID 3103-3108)#3#1、#2和＇919＇蛋白在Al(OH)3中的混合物(本文的SEQ ID 14，還可參見(jiàn)WO99/57280的圖23和該文獻(xiàn)中的SEQ ID 3069-3074)可易于看出，通過(guò)加入從2996菌株獲得的確定的抗原，可克服該挪威OMV疫苗抗2996菌株的無(wú)效問(wèn)題(組1)。使用NmB蛋白＇287＇的結(jié)果特別好。由此可改善該挪威疫苗，而不需由各種不同菌株制備OMV。
這種疫苗還提供了針對(duì)異源MenB菌株的保護(hù)作用。測(cè)試使用2996菌株蛋白質(zhì)制得的相同的疫苗抗5種其它菌株的情況。滴度如下

*對(duì)照2996菌株、BZ133株和1000株＝由同源菌株制得的OMV；BZ232株＝由2996菌株制得的OMV；MC56和NGH38＝SEAM3。
另一研究使用從NmB2996菌株獲得的蛋白質(zhì)添加到“挪威”O(jiān)MV中——919蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)，沒(méi)有任何融合配偶體——ORF1，在大腸桿菌中表達(dá)為His標(biāo)記的融合蛋白——287蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)為GST融合蛋白——這3種蛋白質(zhì)的混合物，任選含有NmC偶聯(lián)物使用Al(OH)3作為這些制品的佐劑，進(jìn)行殺菌測(cè)試，測(cè)試它們抗同源菌株的能力。結(jié)果如下

*該抗體抑菌而非殺菌。
使用抗原287進(jìn)行的進(jìn)一步的工作進(jìn)一步研究挪威OMV與抗原287的組合物。將20μg的287抗原和挪威OMP疫苗(15μg OMP+Al(OH)3〕混合，用所得混合物對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。在殺菌測(cè)試中測(cè)試抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它能有效抗所有測(cè)試的菌株。結(jié)果如下

因此，幾乎在大多數(shù)例子中，OMV+287蛋白的組合令人驚訝地產(chǎn)生比單獨(dú)的OMV要好的結(jié)果。
重組的OMV轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使其表達(dá)ORF1、ORF40和ORF46。由重組的大腸桿菌制得的OMV能誘導(dǎo)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的殺菌性抗體。
ORF1、ORF40和ORF46(2996菌株)在大腸桿菌中表達(dá)為His標(biāo)記的融合蛋白質(zhì)，并以純蛋白質(zhì)的形式或者OMV的形式制得它們。使用2996菌株作為攻擊源測(cè)試針對(duì)這兩種制品的殺菌滴度

還測(cè)量了使用異源攻擊菌株的殺菌滴度。純化的ORF46抗MC58株的滴度是4096，其OMV形式抗MC58的滴度升高到32000。純化的ORF1抗NmA F6124株的滴度是128，其OMV形式抗此菌株的滴度升高到512。純化的ORF40抗MC58株的滴度是512，其OMV形式是這個(gè)滴度的兩倍。
這些數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)在大腸桿菌中將NmB抗原制成OMV形式時(shí)，它們保留了免疫原性，而且該免疫原性實(shí)際上被提高。
可以理解，本申請(qǐng)僅通過(guò)實(shí)施例的方式描述本發(fā)明，在不偏離本發(fā)明的范圍和精神的情況下可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改。
序列表序列表<110>啟龍股份公司(CHIRON SpA)<120>含有腦膜炎奈瑟球菌B血清群外膜蛋白質(zhì)的外膜囊(OMV)疫苗<130>P023785WO<141>2001-01-17<150>GB-0001067.8<151>2000-01-17<150>GB-0005699.4<151>2000-03-09<160>14<170>SeqWin99，version1.02<210>1<211>15<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>1Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr1 5 10 15<210>2<211>2394<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>2atgaaactga aacagattgc ttccgcactg atgatgttgg gcatatcgcc tttggcactt 60gccgacttca ccatccaaga catccgcgtc gaaggcttgc agcgtaccga gccgagtacc 120gtattcaact acctgcccgt caaagtcggc gacacctaca acgacacaca cggcagtgcc 180atcatcaaaa gcctgtacgc caccggtttc tttgacgacg tacgcgtcga aactgcggac 240gggcagctcc tgctgaccgt tatcgaacgc cccaccatcg gctcgctcaa catcaccggc 300gcaaaaatgc tgcaaaacga cgccattaag aaaaacctcg aatcgttcgg gctggcgcag 360tcgcaatact ttaatcaggc gacactcaat caggcagtcg ccggcctgaa agaagaatac 420ctcgggcgcg gcaaactcaa tatccaaatc acgcccaaag taaccaaact cgcccgcaac 480cgcgtcgaca tcgacatcac gattgacgag ggcaaatccg ccaaaatcac cgacatcgaa 540tttgaaggca accaagtcta ttccgaccgc aaactgatgc ggcaaatgtc cctgaccgaa 600ggcggcattt ggacatggct gacacgaagc aaccaattca acgagcagaa atttgcccaa 660gatatggaaa aagtaaccga cttctaccaa aataacggct acttcgattt ccgtatcctc 720gataccgaca tccaaaccaa cgaagacaaa accaagcaga ccatcaaaat caccgtccac 780gaaggcggac gtttccgttg gggcaaagtc tccatcgaag gcgacaccaa cgaagtcccc 840aaagccgaac tggaaaaact gctgaccatg aagcccggca aatggtacga acgccagcag 900atgaccgccg ttttgggtga gattcagaac cgcatgggct cggcaggcta cgcatacagc 960gaaatcagcg tacagccgct gccgaacgct gaaaccaaaa ccgtcgattt cgtcctgcac 1020atcgaaccgg gccggaaaat ctacgtcaac gaaatacaca tcaccggcaa caacaaaacc 1080cgcgacgaag tcgtccgccg tgaattacgc caaatggaat ccgcacctta cgacacctcc 1140aagctgcaac gttccaaaga gcgcgtcgag cttttgggct acttcgacaa tgtccagttt 1200gatgctgtcc cgcttgccgg cacgcccgac aaagtcgatt tgaacatgag tctgaccgaa 1260cgttccaccg gttccctgga tttgagcgcg ggttgggttc aagataccgg gttggtcatg 1320tccgcaggcg tttcccaaga caacctgttc ggtacgggca agtcggccgc actgcgcgcc 1380tccaggagca aaaccacgct taacggctcg ctgtcgttta ctgacccgta cttcacggca 1440gacggggtca gcctgggcta cgatgtttac ggaaaagcct tcgacccgcg caaagcatcg 1500accagcatca aacaatataa aaccaccacg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct 1560gttaccgaat acgaccgcgt gaatttcggt ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc 1620tacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac tttatcaaga aatacggcaa aaccgacggc 1680acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa 1740accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc 1800ctgcctggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc 1860ctgagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc 1920agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc 1980ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtctatgacg aatacggcga aaaaatcagc 2040tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg 2100aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc 2160aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc 2220gccggcaata cccataaatc cacctttacc aacgaattgc gctattccgc cggcggcgcg 2280gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa 2340aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa 2394<210>3<211>797<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>3Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser1 5 10 15Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly20 25 30Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys35 40 45Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser50 55 60Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp65 70 75 80Gly Gln Leu Leu Leu Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu85 90 95Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn100 105 110Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr115 120 125Leu Asn Gln Ala Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly130 135 140Lys Leu Asn Ile Gln Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn145 150 155 160Arg Val Asp Ile Asp Ile 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Leu Gln Arg370 375 380Ser Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Val Gln Phe385 390 395 400Asp Ala Val Pro Leu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Ash Met405 410 415Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp420 425 430Val Gln Asp Thr Gly Leu Val Met Ser Ala Gly Val Ser Gln Asp Asn435 440 445Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys450 455 460Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala465 470 475 480Asp Gly Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro485 490 495Arg Lys Ala Ser Thr Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly500 505 510Ala Gly Ile Arg Met Ser Val Pro Val Thr Glu Tyr Asp Arg Val Asn515 520 525Phe Gly Leu Val Ala Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tyr Asn Lys Ala530 535 540Pro Lys His Tyr Ala Asp Phe Ile Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly545 550 555 560Thr Asp Gly Ser Phe Lys Gly Trp Leu Tyr Lys Gly Thr Val Gly Trp565 570 575Gly Arg Asn Lys Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu580 585 590Thr 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aaccaccacg gcaggcgcag gcatccgcat gagcgtgcct 1560gttaccgaat acgaccgcgt gaatttcggt ttggtggcag aacacctgac cgtcaacacc 1620tacaacaaag cgcccaaaca ctatgccgac tttatcaaga aatacggcaa aaccgacggc 1680acagacggca gcttcaaagg ctggctgtac aaaggtaccg tcggctgggg gcgcaacaaa 1740accgacagcg cgttatggcc gacgcgcggc tacctgacgg gcgtgaacgc cgaaatcgcc 1800ctgcccggca gcaaactgca atactactcc gccacccaca accaaacctg gttcttcccc 1860ttaagcaaaa ccttcacgct gatgctcggc ggcgaagtcg gcattgcggg cggctacggc 1920agaaccaaag aaatcccctt ctttgaaaac ttctacggcg gcggcctggg ttcggtgcgc 1980ggatacgaaa gcggcacgct cggtccgaaa gtgtatgacg aatacggcga aaaaatcagc 2040tacggcggca acaaaaaagc caacgtctcc gccgagctgc tcttcccgat gcccggcgcg 2100aaagacgcgc gcaccgtccg cctgagcctg tttgccgacg caggcagcgt gtgggacggc 2160aaaacctacg acgacaacag cagttccgcg accggcggca gggttcaaaa catttacggc 2220gccggcaata cccataaatc cacctttacc aacgaattgc gctattccgc cggcggcgcg 2280gttacctggc tctcgccttt aggcccgatg aaattcagct acgcctaccc gctgaagaaa 2340aaaccggaag acgaaatcca acgcttccaa ttccaactcg gcacgacgtt ctaa 2394<210>11<211>797<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>11Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Set Ala Leu Met Val Leu Gly Ile Ser1 5 10 15Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly20 25 30Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys35 40 45Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser50 55 60Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp65 70 75 80Gly Gln Leu Leu Leu Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu85 90 95Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn100 105 110Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gln Set Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr
115 120 125Leu Asn Gln Ala Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gty130 135 140Lys Leu Asn Ile Gln Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn145 150 155 160Arg Val Asp Ile Asp Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile165 170 175Thr Asp Ile Glu Phe Glu Gly Asn Gln Val Tyr Ser Asp Arg Lys Leu180 185 190Met Arg Gln Met Ser Leu Thr Glu Gly Gly Ile Trp Thr Trp Leu Thr195 200 205Arg Ser Asn Gln Phe Asn Gtu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys210 215 220Val Thr Asp Phe Tyr Gln Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu225 230 235 240Asp Thr Asp Ile Gln Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln Thr Ile Lys245 250 255Ile Thr Val His Glu Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Val Ser Ile260 265 270Glu Gly Asp Thr Asn Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu275 280 285Thr Met Lys Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gln Gln Met Thr Ala Val290 295 300Leu Gly Glu Ile Gln Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser305 310 315 320Glu Ile Ser Val Gln Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp325 330 335Phe Val Leu His Ile Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Val Asn Glu Ile340 345 350His Ile Thr Gly Asn Asn Lys Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu355 360 365Leu Arg Gln Met Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Set Lys Leu Gln Arg370 375 380Ser Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Val Gln Phe385 390 395 400Asp Ala Val Pro Leu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Asn Met405 410 415Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp420 425 430Val Gln Asp Thr Gly Leu Val Met Ser Ala Gly Val Ser Gln Asp Asn
435 440 445Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys450 455 460Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala465 470 475 480Asp Gly Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro485 490 495Arg Lys Ala Ser Thr Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly500 505 510Ala Gly Ile Arg Met Ser Val Pro Val Thr Glu Tyr Asp Arg Val Asn515 520 525Phe Gly Leu Val Ala Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tyr Asn Lys Ala530 535 540Pro Lys His Tyr Ala Asp Phe Ile Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly545 550 555 560Thr Asp Gly Ser Phe Lys Gly Trp Leu Tyr Lys Gly Thr Val Gly Trp565 570 575Gly Arg Asn Lys Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu580 585 590Thr Gly Val Asn Ala Glu Ile Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gln Tyr595 600 605Tyr Ser Ala Thr His Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr610 615 620Phe Thr Leu Met Leu Gly Gly Glu Val Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly625 630 635 640Arg Thr Lys Glu Ile Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu645 650 655Gly Ser Val Arg Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr660 665 670Asp Glu Tyr Gly Glu Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn675680 685Val Ser Ala Glu Leu Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg690 695 700Thr Val Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly705 710 715 720Lys Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln725 730 735Asn Ile Tyr Gly Ala Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu740 745 750Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly
755 760 765Pro Met Lys Phe Ser Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp770 775 780Glu Ile Gln Arg Phe Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe785 790 795<210>12<211>21<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>12Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Gly Ile Ser1 5 10 15Pro Leu Ala Leu Ala20<210>13<211>776<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>13Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly Leu Gln Arg Thr Glul 5 10 15Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys Val Gly Asp Thr Tyr20 25 30Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser Leu Tyr Ala Thr Gly35 40 45Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp Gly Gln Leu Leu Leu50 55 60Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu Asn Ile Thr Gly Ala65 70 75 80Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn Leu Glu Ser Phe Gly85 90 95Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr Leu Asn Gln Ala Val100 105 110Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly Lys Leu Asn Ile Gln115 120 125Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn Arg Val Asp Ile Asp130 135 140Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile Thr Asp Ile Glu Phe145 150 155 160Glu Gly Asn Gln Val Tyr Ser Asp Arg Lys Leu Met Arg Gln Met Ser165 170 175Leu Thr Glu Gly Gly Ile Trp Thr Trp Leu Thr Arg Ser Asn Gln Phe
180 185 190Asn Glu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys Val Thr Asp Phe Tyr195 200 205Gln Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu Asp Thr Asp Ile Gln210 215 220Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln Thr Ile Lys Ile Thr Val His Glu225 230 235 240Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Val Ser Ile Glu Gly Asp Thr Asn245 250 255Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu Thr Met Lys Pro Gly260 265 270Lys Trp Tyr Glu Arg Gln Gln Met Thr Ala Val Leu Gly Glu Ile Gln275 280 285Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser Glu Ile Ser Val Gln290 295 300Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp Phe Val Leu His Ile305 310 315 320Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Val Asn Glu Ile His Ile Thr Gly Asn325 330 335Asn Lys Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu Leu Arg Gln Met Glu340 345 350Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gln Arg Ser Lys Glu Arg Val355 360 365Glu Leu Leu Gly Tyr phe Asp Asn Val Gln Phe Asp Ala Val Pro Leu370 375 380Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Asn Met Ser Leu Thr Glu Arg385 390 395 400Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp Val Gln Asp Thr Gly405 410 415Leu Val Met Ser Ala Gly Val Ser Gln Asp Asn Leu Phe Gly Thr Gly420 425 430Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys Thr Thr Leu Asn Gly435 440 445Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala Asp Gly Val Ser Leu450 455 460Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro Arg Lys Ala Ser Thr465 470 475 480Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly Ala Gly Ile Arg Met485 490 495Ser Val Pro Val Thr Glu Tyr Asp Arg Val Asn Phe Gly Leu Val Ala
500 505 510Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tyr Asn Lys Ala Pro Lys His Tyr Ala515 520 525Asp Phe Ile Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly Thr Asp Gly Ser Phe530 535 540Lys Gly Trp Leu Tyr Lys Gly Thr Val Gly Trp Gly Arg Asn Lys Thr545 550 555 560Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Val Asn Ala565 570 575Glu Ile Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Tyr Ser Ala Thr His580 585 590Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr Phe Thr Leu Met Leu595 600 605Gly Gly Glu Val Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Ile610 615 620Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu Gly Ser Val Arg Gly625 630 635 640Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr Asp Glu Tyr Gly Glu645 650 655Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn Val Ser Ala Glu Leu660 665 670Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg Thr Val Arg Leu Ser675 680 685Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Asp690 695 700Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln Asn Ile Tyr Gly Ala705 710 715 720Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu Leu Arg Tyr Ser Ala725 730 735Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly Pro Met Lys Phe Ser740 745 750Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp Glu Ile Gln Arg Phe755 760 765Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe770 775<210>14<211>441<212>PRT<213>腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)<400>14Met Lys Lys Tyr Leu Phe Arg Ala Ala Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Ala1 5 10 15Ile Leu Ala Ala Cys Gln Ser Lys Ser Ile Gln Thr Phe Pro Gln Pro20 25 30Asp Thr Ser Val Ile Asn Gly Pro Asp Arg Pro Val Gly Ile Pro Asp35 40 45Pro Ala Gly Thr Thr Val Gly Gly Gly Gly Ala Val Tyr Thr Val Val50 55 60Pro His Leu Ser Leu Pro His Trp Ala Ala Gln Asp Phe Ala Lys Ser65 70 75 80Leu Gln Ser Phe Arg Leu Gly Cys Ala Asn Leu Lys Asn Arg Gln Gly85 90 95Trp Gln Asp Val Cys Ala Gln Ala Phe Gln Thr Pro Val His Ser Phe100 105 110Gln Ala Lys Gln Phe Phe Glu Arg Tyr Phe Thr Pro Trp Gln Val Ala115 120 125Gly Asn Gly Ser Leu Ala Gly Thr Val Thr Gly Tyr Tyr Glu Pro Val130 135 l40Leu Lys Gly Asp Asp Arg Arg Thr Ala Gln Ala Arg Phe Pro Ile Tyr145 150 155 160Gly Ile Pro Asp Asp Phe Ile Ser Val Pro Leu Pro Ala Gly Leu Arg165 170 175Ser Gly Lys Ala Leu Val Arg Ile Arg Gln Thr Gly Lys Asn Ser Gly180 185 190Thr Ile Asp Asn Thr Gly Gly Thr His Thr Ala Asp Leu Ser Arg Phe195 200 205Pro Ile Thr Ala Arg Thr Thr Ala lle Lys Gly Arg Phe Glu Gly Ser210 215 220Arg Phe Leu Pro Tyr His Thr Arg Asn Gln Ile Asn Gly Gly Ala Leu225 230 235 240Asp Gly Lys Ala Pro Ile Leu Gly Tyr Ala Glu Asp Pro Val Glu Leu245 250 255Phe Phe Met His Ile Gln Gly Ser Gly Arg Leu Lys Thr Pro Ser Gly260 265 270Lys Tyr lle Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Lys Asn Glu His Pro Tyr Val275 280 285Ser Ile Gly Arg Tyr Met Ala Asp Lys Gly Tyr Leu Lys Leu Gly Gln290 295 300Thr Ser Met Gln Gly Ile Lys Ala Tyr Met Arg Gln Asn Pro Gln Arg305 310 315 320Leu Ala Glu Val Leu Gly Gln Asn Pro Ser Tyr Ile Phe Phe Arg Glu
325 330 335Leu Ala Gly Ser Ser Asn Asp Gly Pro Val Gly Ala Leu Gly Thr Pro340 345 350Leu Met Gly Glu Tyr Ala Gly Ala Val Asp Arg His Tyr Ile Thr Leu355 360 365Gly Ala Pro Leu Phe Val Ala Thr Ala His Pro Val Thr Arg Lys Ala370 375 380Leu Asn Arg Leu Ile Met Ala Gln Asp Thr Gly Ser Ala Ile Lys Gly385 390 395 400Ala Val Arg Val Asp Tyr Phe Trp Gly Tyr Gly Asp Glu Ala Gly Glu405 4l0 415Leu Ala Gly Lys Gln Lys Thr Thr Gly Tyr Val Trp Gln Leu Leu Pro420 425 430Asn Gly Met Lys Pro Glu Tyr Arg Pro435 440
權(quán)利要求
1.一種組合物，它含有(a)腦膜炎奈瑟球菌B血清群的外膜制劑，和(b)一種或多種下列免疫原性成分·WO99/57280中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/36544中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/24578中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/66791中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·Tettelin等人〔Science(2000)，2871809-1815〕公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO97/28273中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO96/29412中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO95/03413中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/31132中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/58683中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/55873中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·腦膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白、Omp85蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述成分(b)是NmB蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述NmB蛋白質(zhì)是919蛋白、235蛋白、519蛋白、225蛋白、ORF40蛋白、287蛋白、ORF1、ORF4或ORF46。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述成分(b)包括從獲得所述成分(a)的不同的NmB菌株獲得的蛋白質(zhì)。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物的一種或多種成分被吸附在Al(OH)3上。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述成分(a)含有OMV。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述OMV是NmB的脫氧膽酸鹽抽提物。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述成分(a)被吸附在Al(OH)3上。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有一種或多種下述成分·抗腦膜炎奈瑟球菌A血清群的保護(hù)性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌C血清群的保護(hù)性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌Y血清群的保護(hù)性抗原；·抗腦膜炎奈瑟球菌W血清群的保護(hù)性抗原；·抗流感嗜血桿菌的保護(hù)性抗原；·抗肺炎球菌的保護(hù)性抗原；·抗白喉的保護(hù)性抗原；·抗破傷風(fēng)的保護(hù)性抗原；·抗百日咳的保護(hù)性抗原；·抗幽門螺桿菌的保護(hù)性抗原；·抗脊髓灰質(zhì)炎的保護(hù)性抗原；和/或·抗B型肝炎病毒的保護(hù)性抗原。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物是疫苗。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物可用作藥劑。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物在制備下列藥劑中的應(yīng)用(i)治療或預(yù)防奈瑟球菌感染的藥劑；(ii)檢測(cè)奈瑟球菌或抗奈瑟球菌的抗體的診斷用試劑；(iii)可產(chǎn)生針對(duì)奈瑟球菌的抗體的試劑。
13.一種治療患者的方法，它包括向該患者給予治療有效量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物。
14.一種細(xì)菌外膜制劑，它含有下述一種或多種免疫原性成分·WO99/57280中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/36544中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/24578中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/66791中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·Tettelin等人〔Science(2000)，2871809-1815〕公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO97/28273中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO96/29412中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO95/03413中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/31132中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/58683中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·WO99/55873中公開(kāi)的蛋白質(zhì)或其免疫原性片段；·腦膜炎奈瑟球菌PorA蛋白、TbpA蛋白、TbpB蛋白、PilC蛋白、OpA蛋白、Omp85蛋白。
全文摘要
含有(a)腦膜炎奈瑟球菌B血清群(Neisseria meningitidis serogroup B，NmB)外膜囊(OMV)和(b)選自其它奈瑟球菌蛋白質(zhì)的免疫原性成分或其免疫原性片段的組合物。成分(b)較佳包括獲得成分(a)的OMV的不同NmB菌株的蛋白質(zhì)。較佳通過(guò)脫氧膽酸鹽抽提法獲得所述OMV。任選地，該組合物還可含有抗其它病原體的保護(hù)性抗原。
文檔編號(hào)A61K39/116GK1416352SQ01805920
公開(kāi)日2003年5月7日 申請(qǐng)日期2001年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月17日
發(fā)明者M·皮扎, R·拉普奧利, M·朱利亞尼 申請(qǐng)人:啟龍股份公司