一種檢測基因突變引物及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測基因突變引物及應(yīng)用,該引物包括錨定序列、嘌呤環(huán)和檢測序列，錨定序列位于引物5’-端與靶序列有大于14個堿基互補，嘌呤環(huán)為引物3’-端第5～8個堿基位置由3～4個黃嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷或脫氧次黃嘌呤核苷形成泡狀環(huán)，檢測序列位于引物3’-末端由5～8個堿基組成。本發(fā)明的技術(shù)方案中由于引物3’-末端起第5～8個堿基位置插入的泡狀環(huán)且與靶序列對應(yīng)位置有“0”或“1”個堿基對位形成泡狀環(huán)賦予了引物高度特異基因突變檢測能力，因此本發(fā)明的引物可抑制非特異性擴(kuò)增，提高了檢測能力，可應(yīng)用于檢測低拷貝基因突變檢測、多重PCR、基因芯片等領(lǐng)域。
【專利說明】—種檢測基因突變引物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測低拷貝突變的【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種檢測基因突變的引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著個性化醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展，SNP基因分型分子診斷技術(shù)在藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，分子診斷技術(shù)或基因診斷技術(shù)己經(jīng)逐步應(yīng)用于臨床的輔助診斷和用藥。目前，我國在SNP、突變分子等診斷技術(shù)上的檢測技術(shù)相對比較落后，隨著國家十二五中長期發(fā)展綱要的逐步實施，特別是臨床診斷技術(shù)發(fā)展規(guī)劃的提出，將逐步促進(jìn)我國臨床診斷水平的快速發(fā)展。開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的SNP檢測方法，并將其應(yīng)用于腫瘤的早期篩查、腫瘤靶向用藥和預(yù)后、細(xì)菌和病毒的耐藥性研究具有非常重要現(xiàn)實意義。
[0003]自20世紀(jì)80年代PCR技術(shù)問世，PCR技術(shù)被逐漸廣泛地應(yīng)用于分子診斷中，基于PCR技術(shù)的SNP檢測技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展，并不斷衍生出諸如:PCR-RFLP，allele-sepecific PCR, TaqMan probe, ARMS, PNA-LNA clamp 突光 PCR、Cycleave probePCR, Nanofluidic Digital PCR Arrays, MassArray 和 DNA 芯片等新的檢測手段和技術(shù)。PCR-RFLP是早期實驗開發(fā)檢測SNP分型技術(shù)，它依賴于巧妙地選擇限制性內(nèi)切酶切出用于識別突變位點的短片段長度多態(tài)，但是這種方法需要電泳分離酶消化之后的產(chǎn)物，這將嚴(yán)重限制反應(yīng)的通量和操作的自動化。ARMS技術(shù)與allele-specific PCR大致相同，利用Taq酶缺失3’~5’的外切活性，3’端錯配的引物低于正常引物的延伸速度，當(dāng)錯配數(shù)目達(dá)到一定的嚴(yán)謹(jǐn)程度時，3’ -端則無法延伸，如果PCR有條帶，說明有相應(yīng)的突變。ARMS技術(shù)敏感性和特異較高，已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床檢測SNP，但是ARMS技術(shù)最低只可以檢測到10個拷貝，很大程度上，限制了其廣泛用于臨床檢測細(xì)菌和病毒的耐藥、分型檢測。TaqMan探針是一種寡核酸探針，在探針的3’末端連接有熒光報告基團(tuán)，而5’末端連接有熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，當(dāng)PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’外切酶活性能將結(jié)合到靶DNA鏈上`的探針的淬滅基團(tuán)切除掉，使探針的熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。通過使用不同的熒光報告基團(tuán)，在同一個PCR中可以同時檢測不同的酶切消化等位基因特異性探針。這種5’外切酶實驗己經(jīng)成功用來區(qū)分只有一個堿基差異的等位基因。盡管如此，Taqman探針技術(shù)同樣遇到ARMS技術(shù)相同的開發(fā)瓶頸。
[0004]Cycleave probe PCR,技術(shù)原理類似Taqman探針,只是探針含有一個rNTP堿基于SNP互補，當(dāng)存在突變時，rNTP與突變配對，RNase H識別并切割rNTP，使探針的熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，熒光產(chǎn)生，此項技術(shù)缺點是背景較高，探針容易降解，引物探針設(shè)計受限制。PNA-LNA-c I amp 技術(shù)，米用 NestPCR 技術(shù)和 PNA-LNA-clamp 探針,PNA-LNA-clamp探針特異性的封閉野生性SNP，阻止野性性模板擴(kuò)增從而達(dá)到擴(kuò)增突變的目的。雖然這項技術(shù)很靈敏，但經(jīng)歷兩次PCR容易污染，探針設(shè)計也受到限制。上述檢測技術(shù)采用普通的引物對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測，尤其是多重PCR難以避免非特異性擴(kuò)增。Jong-Yoon Chun等發(fā)明的 DPO (Dual priming oligonucleotide system,美國專利號 US2013/0090464A1)提出在引物中插入5個黃嘌呤或次黃嘌呤且與靶序列有5個堿基對位，可以增加引物的特異性，抑制非特異性擴(kuò)增，且具有SNP的檢測能力。DPO主要為多重PCR設(shè)計，由于引物3’-端起第10個堿基位置插入5個次黃嘌呤的且與靶序列有5個堿基對位，雖然一定程度上抑制了非特異性擴(kuò)增，DPO的敏感性和基因突變的檢測能力并不明顯?；谝陨希_發(fā)出一種經(jīng)濟(jì)實用型、特異性高、敏感性強的基因突變檢測方法是當(dāng)前要研究的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:針對現(xiàn)有的檢測目的基因突變技術(shù)存在敏感性弱、檢測能力弱、特異性弱等問題，提供一種可檢測出低拷貝的基因突變，并提供一個新的檢測體系的檢測基因突變的引物及其應(yīng)用，從而可以高效、特異的擴(kuò)增需要檢測的目的基因突變。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種檢測基因突變的引物，該引物包括如下三部分:
[0007]I)錨定序列:該序列位于引物5’ -端，與模板有大于14個堿基配對；
[0008]2)嘌呤環(huán):引物3’ -端起第5~8個堿基位置插入有3~4個黃嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷或脫氧次黃嘌呤核苷，與靶序列的同等位置上有“ I”個堿基或“O”個堿基對位，形成“3:0，，、“4:1，，、“3:1，，或“4:0”的泡狀嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)；
[0009]3)檢測序列:引物3’ -末端由5~8個堿基組成的基因突變檢測序列，特異性檢測單核苷酸多態(tài)性和基因突變。
[0010]上述引物的結(jié)構(gòu)如附圖1所示，引物由16~30個堿基組成(含插入的嘌呤環(huán))，引物與靶序列結(jié)合的Tm值為40~65°C，檢測序列與靶序列結(jié)合的堿基個數(shù)為5~8個，優(yōu)選“6”或“7”堿基組成的序列；特異性檢測基因突變的堿基可放置在檢測序列3’ -末端起第“1”、“2”、“3”或“4”個堿基位置，優(yōu)選3’ -末端起第3個堿基位置；檢測探針與靶序列結(jié)合的Tm值為10~20°C。下面以引物3’ -末端起插入第6個堿基位置插入3~4個脫氧次黃嘌呤核苷(方便描述用字母“I”表示脫氧次黃嘌呤核苷)，檢測基因突變的堿基位于檢測序列3’ -末端起第3個堿基位置為例,具體如下a、b、C、d所示:
[0011]a.插入的3個脫氧次黃嘌呤核苷與靶序列有“O”堿基對位:
[0012]5，— GCC-TTG-GGT-GGC-1I1-TTT-AGG
[0013]5’......GCC-TTG-GGT-GGC-TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A......3，；
[0014]b.插入的4個脫氧次黃嘌呤核苷與靶序列有“O”對位:
[0015]5，...GCC-TTG-GGT-GGC-1111-TTT-AGG
[0016]5’......GCC-TTG-GGT-GGC-TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A......3，；
[0017]c.插入的3個脫氧次黃嘌呤核苷與靶序列有“ I ”堿基對位:
[0018]5，— GCC-TTG-GGT-GG-1I1-TTT-AGG
[0019]5，…GCC-TTG-GGT-GG-C-TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A…3，；
[0020]d.插入的4個脫氧次黃嘌呤核苷與靶序列有“ I ”堿基對位:
[0021]5’...GCC-TTG-GGT-GG-1111-TTT-AGG
[0022]5，…GCC-TTG-GGT-GG-C—TTT-AGG-ACA-TGG-ACA-TTG-A …3，。
[0023]上述引物檢測基因突變的原理如附圖2所示，當(dāng)野生型模板(A/T)存在，本發(fā)明設(shè)計的引物特異性檢測基因突變(G/C)與野生型模板結(jié)合不穩(wěn)定，DNA聚合酶無法延伸，擴(kuò)增受阻；當(dāng)突變模板(G/C)存在下，引物識別突變，DNA聚合酶結(jié)合并延伸。
[0024]“基因突變”包括堿基缺失、插入和定點突變等。引物的設(shè)計原則盡可能遵守普通引物的設(shè)計和探針的設(shè)計原則，上述引物可搭載不同的熒光探針信號系統(tǒng)或與其他的信號系統(tǒng)、引物組合形成新的基因突變檢測引物和探針，如=Taqman探針、分子信標(biāo)、楔形探針、雙環(huán)探針等。該技術(shù)可以應(yīng)用于核酸檢測技術(shù)檢測基因突變、單核苷酸多態(tài)性、多重PCR和基因芯片。這些核酸擴(kuò)增技術(shù)包括恒溫擴(kuò)增(NASBA、TMA, SDA、RCA等)和變溫擴(kuò)增(PCR)，此外本發(fā)明還可以用于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的恒溫擴(kuò)增(TMA、NASBA)、鏈置換(SDA)等恒溫擴(kuò)增的其他核酸檢測方法。
[0025]上述PCR擴(kuò)增方法，具有以下步驟:
[0026]I)初始變性2~10分鐘；
[0027]2)富集突變:需要2~10個循環(huán)來富集單核苷酸多態(tài)性和基因突變，包括變性、退火、延伸；
[0028]3)突變檢測:30~35個循環(huán)的檢測過程，包括變性、退火、延伸等過程。上述PCR擴(kuò)增的方法特征在于，第(2)和第(3)部分的退火溫度Tm均為50~65°C。
[0029]本發(fā)明應(yīng)用的PCR體系的特點在于:變性-退火-延伸等過程，做了優(yōu)化。首先SNP或者突變富集階段，采用2~10循環(huán)富集突變，這個階段的退火溫度為50~65°C ;其次，突變檢測階段，30~35 個循環(huán)，富集和突變檢測階段的退火溫度和延伸的時間視擴(kuò)增片段大小而定。
[0030]本發(fā)明的核心是在3’-端第5~8個堿基位置，插入3~4個黃嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷或脫氧次黃嘌呤核苷，其目的有三，一方面提高引物的特異性，抑制非特異性擴(kuò)增，提高診斷的準(zhǔn)確性；另一方面，由于黃嘌呤核苷與堿基(A、G、C、T)結(jié)合力弱，且與模板只有I個或者O個位置的堿基對位，形成由3~4個黃嘌呤核苷組成的泡狀環(huán)，降低了引物與模板結(jié)合的Tm值；第三，正是因為這個泡狀環(huán)的存在，使得引物3’ -末端5~8個堿基序列具有了特異性識別和檢測基因突變的能力。
[0031]本發(fā)明的有益效果在于:
[0032]I)由于引物3’ -末端起第5~8個堿基位置，優(yōu)選6~7個堿基位置插入3~4個黃嘌呤核苷且與靶序列對應(yīng)位置有“O”或“ I”個堿基對位形成泡狀環(huán)將引物分成三部分，賦予了引物高度特異基因突變檢測能力。因此本申請的技術(shù)方案可最大程度上抑制非特異性擴(kuò)增，提檢測能力。
[0033]2)本發(fā)明的引物具備高度特異性的SNP和基因突變的檢測能力，能夠從高強度背景中發(fā)現(xiàn)低拷貝的突變，使得該方法可廣泛應(yīng)用于細(xì)菌病毒耐藥突變、分型檢測，腫瘤個性化用藥、超低濃度的細(xì)菌病毒檢測、多重PCR、基因芯片等領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明；
[0035]圖1是本發(fā)明的引物的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0036]圖2是圖示解釋本發(fā)明檢測DNA突變反應(yīng)示意圖；
[0037]圖3是應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計的特異性檢測HBV C基因型的引物和探針檢測lE+7IU/mlB基因質(zhì)粒和lE+6IU/ml-lE+2IU/ml C基因質(zhì)粒；
[0038]圖4是應(yīng)用本發(fā)明設(shè)計的特異性檢測拉米夫定rtL180M耐藥；
[0039]圖中，1.錨定序列，2.嘌呤環(huán)，3.檢測探針，4.應(yīng)用C基因引物檢測lE+6IU/ml C基因質(zhì)粒，5.應(yīng)用C基因引物檢測lE+5IU/ml C基因質(zhì)粒，6.應(yīng)用C基因引物檢測1E+4IU/ml C基因質(zhì)粒，7.應(yīng)用C基因引物檢測lE+3IU/mlC基因質(zhì)粒，8.應(yīng)用C基因引物檢測lE+2IU/ml C基因質(zhì)粒，9.應(yīng)用C基因引物檢測lE+7IU/ml B基因質(zhì)粒，10.為PCR陰性對照，11.設(shè)計檢測rtL180M突變引物檢測lE+6IU/ml突變模板，12.設(shè)計檢測rtL180M突變引物檢測lE+5IU/ml突變模板，13.設(shè)計檢測rtL180M突變引物檢測lE+4IU/ml突變模板，14.設(shè)計檢測rtL180M突變引物檢測lE+3IU/ml突變模板，15.設(shè)計檢測rtL180M突變引物檢測lE+2IU/ml突變模板，16.設(shè)計檢測rtL180M突變引物檢測lE+8IU/ml野生型模板。
【具體實施方式】
[0040]以下通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0041]實施例一
[0042]乙肝病毒C基因檢測，本實例以本發(fā)明的方法設(shè)計檢測180耐藥位點。
[0043]材料:
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測基因突變引物，其特征在于:該引物包括如下三部分: 1)錨定序列:該序列位于引物5’-端，與靶序列有大于14個堿基配對； 2)嘌呤環(huán):引物3’-端起第5~8個堿基位置插入有3~4個黃嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷或脫氧次黃嘌呤核苷，與靶序列的同等位置上有“ I”個堿基或“O”個堿基對位，形成“3:0”、“4:1”、“3:1”或“4:0” 的泡狀嘌呤環(huán)； 3)檢測序列:位于引物3’-末端由5~8個堿基組成的基因突變檢測序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測基因突變引物，其特征在于:所述引物具有16~30個堿基，引物與靶序列結(jié)合的Tm值為40~65°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測基因突變引物，其特征在于:所述檢測序列與靶序列結(jié)合的堿基個數(shù)為5~8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測基因突變引物，其特征在于:所述檢測序列與靶序列結(jié)合的Tm值為10~20°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測基因突變引物，其特征在于:所述檢測基因突變的堿基放置在所述檢測序列3’ -末端起第“I”、“2”、“3”或“4”個堿基位置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測基因突變引物，其特征在于:所述檢測基因突變的堿基放置在所述檢測序列3’ -末端起第“3”個堿基位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測基因突變引物，其特征在于:所述檢測序列與靶序列結(jié)合的堿基個數(shù)為6~7。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測基因突`變引物的應(yīng)用，其特征在于:將引物與其他的信號系統(tǒng)組合形成新的基因突變檢測體系，應(yīng)用于核酸檢測技術(shù)檢測基因突變、單核苷酸多態(tài)性、多重PCR和基因芯片的擴(kuò)增，對這些核酸的擴(kuò)增包括恒溫擴(kuò)增和變溫擴(kuò)增兩種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測基因突變的引物的應(yīng)用，其特征在于:所述變溫擴(kuò)增方法，具有以下步驟: 1)初始變性2~10分鐘； 2)富集突變:需要2~10個循環(huán)來富集單核苷酸多態(tài)性和基因突變，包括變性、退火、延伸； 3)突變檢測:30~35個循環(huán)的檢測過程，包括變性、退火、延伸過程； 所述退火溫度Tm均為50~65°C。
【文檔編號】C12N15/11GK103710431SQ201310525078
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】王永忠 申請人:常州市第三人民醫(yī)院