一種天然l-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一株利用5-酮基-D-葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)天然L-(+)-酒石酸的惡臭假單胞菌及其生產(chǎn)方法。所述惡臭假單胞菌（Pseudomonas?pudita）突變菌株TUST于2013年5月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號為CGMCC?No.7648。該菌株能利用5-酮基-D-葡萄糖酸及其鹽生產(chǎn)天然L-(+)-酒石酸，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為1.6g/L，達(dá)到理論值的12%，發(fā)酵強度為每天3%，發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)量為7.1g/L，達(dá)到理論值的24%，發(fā)酵強度為每天4%，其發(fā)酵產(chǎn)物為天然L-(+)-酒石酸，且生產(chǎn)工藝簡單，污染少。該菌株及生產(chǎn)方法能夠為國內(nèi)天然L-(+)-酒石酸的生產(chǎn)提供新工藝，有效提升其經(jīng)濟價值。
【專利說明】—種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L_(+)_酒石酸是一種天然有機酸，存在于多種植物中，如在葡萄和羅望子等植物的果實中有較高含量，其用途廣泛且需求量逐年遞增。在食品工業(yè)中L-(+)_酒石酸可以作酸味劑、膨脹劑、抗氧化劑之輔助劑以及食用色素成分之一等，其最大的用途是飲料添加劑；在藥物工業(yè)上，可用作醫(yī)藥拆分劑；在有機合成中可以用來制備多種手性催化劑，或作為手性源來合成復(fù)雜的天然產(chǎn)物分子，是非常重要的手性配體和手性子；在制鏡工業(yè)中，是一個重要的助劑和還原劑，可以控制銀鏡的形成速度，獲得均一的鍍層；在其他行業(yè)中還可作印染防染劑、照相顯影劑等。
[0003]早期，L_(+)_酒石酸主要從葡萄酒的副產(chǎn)物酒石中提取得到，但由于受到原料的限制，產(chǎn)量無法滿足需求。近幾年，L-(+)-酒石酸的主要生產(chǎn)技術(shù)是化學(xué)合成法和半生物合成法?；瘜W(xué)合成法由于在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的廢水和廢固等環(huán)境非友好性物質(zhì)，為后期治理帶來諸多麻煩。
[0004]半生物合成法則主要利用具有順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的微生物通過酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-(+)_酒石酸。例如在申請?zhí)枮?01010609478.6的《一種L ( + )酒石酸的生產(chǎn)方法》中公開了一種L-(+)_酒石酸的 生產(chǎn)方法，步驟為:(1)將順式環(huán)氧琥珀酸氫鈉加到冷凍母液的水溶液中制成混合溶液，調(diào)PH，加紅色紅球菌水解；(2)加硫酸鈣鈣化，過濾得L (+)酒石酸鈣固體和鈣化母液，將鈣化母液冷凍，離心分離得到十水硫酸鈉固體和冷凍母液，冷凍母液回用到步驟(1) ；(3)將L-(+)-酒石酸鈣固體用硫酸酸解，過濾得到L-(+)-酒石酸水溶液，依次經(jīng)過陽離子、陰離子交換樹脂，經(jīng)濃縮、結(jié)晶、分離和烘干得到L-(+)_酒石酸。該發(fā)明在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的鈣化母液和硫酸鈣可循環(huán)利用，減少了環(huán)境污染的問題，還對鈣化母液中溶解的少量產(chǎn)物L(fēng)-(+)_酒石酸鈣和未完全反應(yīng)的順式環(huán)氧琥珀酸鈉進(jìn)行了回收，提高了產(chǎn)品收率。但是該法中生產(chǎn)L-(+)-酒石酸所使用的前體物質(zhì)順式環(huán)氧琥珀酸仍需采用化學(xué)法合成。
[0005]隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們的生活水平得到了大幅度的提高，飲食文化日益多樣化，人們對食品安全重視程度提高，食品的衛(wèi)生安全性日趨得以重視。人們對天然的食品添加劑的需求更為顯著，所以目前世界各國都致力于天然食品添加劑的開發(fā)和研究。而目前，國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)利用生物直接發(fā)酵法合成天然L- (+)-酒石酸的工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種生物法發(fā)酵生產(chǎn)天然L_(+)_酒石酸的方法，其底物5-酮基-葡萄糖酸或其鹽由氧化葡萄糖桿菌利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)而得，其產(chǎn)物為天然L-(+)_酒石酸。改變了 L-(+)-酒石酸的化學(xué)合成和半生物合成的現(xiàn)狀。[0007]本發(fā)明所述的一種天然L-(+)_酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括如下步驟:
[0008]種子液的制備:斜面菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得種子液；
[0009]發(fā)酵培養(yǎng):將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；
[0010]搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵培養(yǎng)基裝量10~20%，接種量5~10%，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min，溫度28~32°C，發(fā)酵時間為2~5d。
[0011]發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為:5L發(fā)酵罐裝液量為3L，接種量為5~10%，轉(zhuǎn)速為200~400r/min，溫度為28~32°C，發(fā)酵時間為6_8d。
[0012]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:5_酮基-葡萄糖酸鉀10~100g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素 2g/L，玉米漿 10 ~20g/L ；
[0013]檢測方法:采用高效液相色譜(HPLC)法測定L_(+)_酒石酸的含量，所述HPLC檢測條件為:
[0014]色譜柱shodex DE-613 (6.0mm IDXl 50mm),流動相為 I Ommo 1/L HClO4,流速0.2mL/min,柱溫30 °C，檢測波長210nm,進(jìn)樣量20 μ L ；
[0015]儀器型號:高效液相色譜儀，安捷倫1100，安捷倫(中國)有限公司
[0016]本發(fā)明所述的菌種具體為惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudita) TUST,該菌株于2013年5月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC N0.7648，保藏地址:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編:100101。
[0017]該菌株特點如下:
[0018]該菌株在LB固體平板上菌落顏色為淡黃色，圓形，表面光滑，邊緣整齊，濕潤。菌體呈桿狀，大小為0.6-0.8 X 2.0-2.4 μ m，革蘭氏染色陰性，為具有運動性的好氧性細(xì)菌，過氧化氫酶陽性，可以利用檸檬酸鹽，不水解明膠。最適生長溫度為28-30°C。
[0019]16SrDNA測序結(jié)果核苷酸序列表所示，將測得的序列首先采用DNAMAN軟件進(jìn)行相似性歸并，將相似性大于97%的序列歸并為一個操作單元，選取每個操作單元中的代表序列利用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16SrDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，選取1400bp以上長度進(jìn)行比對(Clustelxl.83),采用鄰位連接(Neighbour Joining)法進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析(MEGA4.1)，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。由圖可知菌株TUST與惡臭假單胞桿菌的同源性較高，可以初步認(rèn)定為惡臭假單胞桿菌。
[0020]所述惡臭假單胞桿菌TUST能利用5-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽生產(chǎn)L_(+)_酒石酸，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為1.6g/L，達(dá)到理論值的12%，發(fā)酵強度為每天3%，發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)量為
7.lg/L,達(dá)到理論值的24%，發(fā)酵強度為每天4%。
[0021]有益效果:
[0022]第一，通過根際土壤取樣篩得一株利用5-酮基-D葡糖酸或其鹽生產(chǎn)L_(+)_酒石酸的惡臭假單胞菌，該方法為生物發(fā)酵法，產(chǎn)物為天然L-(+)_酒石酸，且該菌株生產(chǎn)L-(+)_酒石酸工藝簡單，污染少。第二，利用本發(fā)明菌種，搖瓶培養(yǎng)2~5d，L-(+)_酒石酸的產(chǎn)量為理論值的12%，發(fā)酵強度為每天3%，發(fā)酵罐培養(yǎng)6~8d，L- (+)-酒石酸產(chǎn)量為理論值的24%，發(fā)酵強度為每天4%。。第三、本發(fā)明篩選出了能夠利用5-酮基-D葡糖酸或其鹽生產(chǎn)L- (+)-酒石酸的新菌株，發(fā)酵產(chǎn)物為天然L- (+)-酒石酸，滿足了人們對天然食品添加劑的需求，而且為國內(nèi)L-(+)-酒石酸的生產(chǎn)提供新的工藝，從而創(chuàng)造更多的經(jīng)濟效益?！緦＠綀D】

【附圖說明】:
[0023]圖1為惡臭假單胞菌CGMCC N0.7648的系統(tǒng)發(fā)育樹【具體實施方式】
[0024]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025]實施例1:利用5-酮基葡萄糖酸鹽生產(chǎn)L_(+)_酒石酸菌種的篩選
[0026]I根際土樣的采集
[0027]取樣時，取各點正常植株4-5穴，帶土挖出根部，剪掉地上部分，留根及附著于根的土樣裝入樣品袋，封好袋口，放入4°C冰箱，以備微生物分離。
[0028]2分尚與培養(yǎng)
[0029](I)培養(yǎng)基
[0030]富集培養(yǎng)基:蛋白胨20g/L，K2HPO4L 5g/L，甘油 10g/L，MgSO4L 5g/L，瓊脂 15g/L，ρΗ7.2。
[0031]分離培養(yǎng)基:同富集培養(yǎng)基。 [0032](2)分離培養(yǎng)
[0033]制備土壤稀釋液:稱取1.0g的根際土,放入99ml無菌水并裝有玻璃珠的250ml三角瓶中，搖床振蕩5min使土壤均勻分散,成為土壤懸液(10_2)。用Iml的無菌吸頭從中吸取
0.5ml 土壤懸液,注入事先分裝有4.5ml無菌水的試管中，吹吸、振蕩均勻(10_3)。用同樣的方法，分別配制稀釋度為10_4、10_5、IO-6 土壤懸液。
[0034]涂布:分別從各濃度土壤稀釋液中吸取100 μ 1，放入KB培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂布器涂布均勻，每個濃度做3個平板。
[0035]培養(yǎng):將KB培養(yǎng)基平板置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)48h,觀察同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，確定最佳稀釋度
[0036]3分離純化
[0037]取30°C下培養(yǎng)48小時的KB培養(yǎng)基平板，在紫外光(256nm)下挑取有熒光產(chǎn)生的菌落，在KB培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，將平板倒置于30°C恒溫箱中培養(yǎng)24h，然后將典型菌落在KB培養(yǎng)基平板上劃線純化2-3次后得到單一菌落。
[0038]實施例2L- (+)-酒石酸的發(fā)酵培養(yǎng)
[0039]從活化斜面上挑取一環(huán)TUST菌體接種至裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中培養(yǎng)，30°C、170r/min搖床培養(yǎng)24h，得種子液。種子培養(yǎng)基組成為:蛋白胨20g/L，K2HPO4L 5g/L，甘油 10g/L, MgSO4L 5g/L，瓊脂 15g/L，ρΗ7.2，121 °C 高壓蒸汽滅菌 20min。
[0040]種子液以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、170r/min搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)5d。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:5_酮基-葡萄糖酸鉀60g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素2g/L,玉米面10g/L。[0041]發(fā)酵5d后，L_(+)_酒石酸產(chǎn)量為0.3g/L，達(dá)到理論值的2%，發(fā)酵強度為每天
0.4%。
[0042]檢測條件:采用安捷倫1100高效液相色譜儀,shodex DE-613 (6.0mm IDX 150mm)色譜柱，以10mmol/L HClO4為流動相，流速0.2mL/min,柱溫30°C，檢測波長210nm，進(jìn)樣量20 μ L的高效液相色譜(HPLC)方法進(jìn)行檢測。
[0043]實施例3L- (+)-酒石酸的發(fā)酵培養(yǎng)
[0044]發(fā)酵培養(yǎng)基:5_酮基-葡萄糖酸鉀 60g/L，MgSO40.25g/L, KH2PO40.6g/L，尿素 2g/L，玉米漿10g/L，其發(fā)酵及檢測條件均同實施例2，發(fā)酵時間為4d，L-(+)-酒石酸產(chǎn)量為1.2g/L，達(dá)到理論值的10%，發(fā)酵強度為每天2.5%。
[0045]實施例4L- (+)-酒石酸的發(fā)酵培養(yǎng)
[0046]發(fā)酵培養(yǎng)基:5_酮基-葡萄糖酸鉀 10g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素 2g/L，玉米漿20g/L。其發(fā)酵及檢測條件均同實施例2，發(fā)酵時間為4d，L-(+)_酒石酸產(chǎn)量為0.2g/L，達(dá)到理論值的5%，發(fā)酵強度為每天1.25%。
[0047]實施例5L- (+)-酒石酸的發(fā)酵培養(yǎng)
[0048]發(fā)酵培養(yǎng)基:5_酮基-葡萄糖酸鉀 60g/L，MgSO40.25g/L, KH2PO40.6g/L，尿素 2g/L，玉米漿20g/L，其發(fā)酵及檢測條件均同實施例2，發(fā)酵時間為4d，L- (+)-酒石酸產(chǎn)量為1.6g/L，達(dá)到理論值的12%，發(fā)酵強度為每天3%
[0049]實施例6L- (+)-酒石酸發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0050]種子液以10%接種量接入`發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、300r/min發(fā)酵罐培養(yǎng)6d。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:5_酮基-葡萄糖酸鉀60g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素2g/L，玉米漿20g/L。檢測條件同實施例2，發(fā)酵時間為6d，L-(+)_酒石酸產(chǎn)量為7.lg/L，達(dá)到理論值得24%，發(fā)酵強度為每天4%。
【權(quán)利要求】
1.一株利用5-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽生產(chǎn)天然L-(+)_酒石酸的惡臭假單胞菌TUST,其特征在于，所述惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudita) TUST,保藏編號為CGMCCN0.7648。
2.一種天然L- (+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，以5-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽為底物，通過惡臭假單胞菌(Pseudomonas pudita) TUST經(jīng)生物發(fā)酵獲得天然L_(+)_酒石酸。
3.如權(quán)利要求2所述的一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟: 種子液的制備:惡臭假單胞菌TUST斜面菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得種子液； 發(fā)酵培養(yǎng):將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行；所述搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵培養(yǎng)基裝量10~20%，接種量5~10%，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min，溫度28~32°C，發(fā)酵時間為2_5d ;發(fā)酵罐條件為:5L發(fā)酵罐裝液量為3L，接種量為5~10%，轉(zhuǎn)速為200~400r/min，溫度為28~32°C，發(fā)酵時間為6_8d。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:5_酮基-葡萄糖酸鉀10~100g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素2g/L,玉米衆(zhòng)10~20g/L。
5.如權(quán)利要求2或3所述的一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:包括如下步驟: 種子液的制備:斜面菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得種子液； 發(fā)酵培養(yǎng):將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)在搖瓶中進(jìn)行；所述搖瓶發(fā)酵條件為:發(fā)酵培養(yǎng)基裝量20%，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速170r/min，溫度30°C，發(fā)酵時間為4d ； 發(fā)酵培養(yǎng)基:5_酮基-葡萄糖酸鉀60g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素2g/L，玉米漿20g/L。
6.如權(quán)利要求2或3所述的一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:包括如下步驟: 種子液的制備:斜面菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得種子液； 發(fā)酵培養(yǎng):將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)在發(fā)酵罐中進(jìn)行；所述發(fā)酵罐發(fā)酵條件為:5L發(fā)酵罐裝液量為3L，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為300r/min，溫度為30°C，發(fā)酵時間為6d ； 發(fā)酵培養(yǎng)基:5_酮基-葡萄糖酸鉀60g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.6g/L，尿素2g/L，玉米漿10~20g/L。
7.如權(quán)利要求2或3所述的一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于:所述惡臭假單胞菌TUST利用5-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽生產(chǎn)L-(+)_酒石酸或其鹽的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為1.6g/L，達(dá)到理論值的12%，發(fā)酵強度達(dá)到每天3%，發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)量為7.lg/L，達(dá)到理論值的24%，發(fā)酵強度達(dá)到每天4%。
8.如權(quán)利要求2所述的一種天然L-(+)-酒石酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法在生產(chǎn)L- (+)-酒石酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103509746SQ201310481586
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】賈士儒, 王洪翠, 譚之磊, 李艷艷, 鐘成, 劉淼 申請人:天津科技大學(xué)