一種制備重組腸道病毒ev71型病毒樣顆粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫【技術領域】，具體涉及一種制備重組腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的方法，為通過酵母表達系統(tǒng)，在多順反子真核表達載體中表達EV71的PI蛋白和特異性蛋白酶。為了實現(xiàn)EV71病毒樣顆粒的制備，本發(fā)明構建了一種EV71病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體及表達系統(tǒng)，所述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體，含有分別受MOX啟動子調控的P1蛋白表達序列和受DAS啟動子調控的蛋白酶表達序列。本發(fā)明通過密碼子的優(yōu)化以及載體的設計，構建了一種高效表達重組腸道病毒EV71型病毒顆粒的方法，本發(fā)明的方法能夠獲得高純度、形態(tài)均一、性狀穩(wěn)定的病毒顆粒，用于手足口病疫苗的制備，極具市場價值。
【專利說明】一種制備重組腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫【技術領域】，具體涉及一種制備重組腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的方法、多順反子表達載體和表達系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002]手足口病是一種主要由腸道病毒引起的威脅5歲以下低齡兒童健康的病毒性傳染病，主要感染途徑為糞-口傳播。癥狀包括發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，少數(shù)患兒可出現(xiàn)心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎、急性遲緩性麻痹、神經源性肺水腫等并發(fā)癥，個別病情進展較快的重癥患兒會導致死亡。手足口病已在世界多個國家引起爆發(fā)性流行，尤其近幾年的大規(guī)模爆發(fā)流行及死亡率明顯升高。中國最早的手足口病報道于上世紀80年代初，而爆發(fā)性流行始于2007年。自2008年5月起，中國將其規(guī)定為法定報告管理的丙類傳染病。根據衛(wèi)生部(http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/wsb/)統(tǒng)計，2008-2011年中國手足口病發(fā)病及死亡人數(shù)急速增長，自2008年開始，中國的手足口病疫情呈現(xiàn)了不可控的爆發(fā)性流行，發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)明顯上升，2010年的發(fā)病人數(shù)近180萬，而2007年的時候僅8萬多，僅僅3年手足口病的發(fā)病人數(shù)就增長了 20倍，如此可怕的增長趨勢不得不引起衛(wèi)生部門的極大重視，如何預防和治療手足口病是中國政府必須在短期內克服的一大公共衛(wèi)生難題。
[0003]手足口病可由20多種腸道病毒感染引起，其中以腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV) A組16型的感染率和發(fā)病率最高。
[0004]腸道病毒71型根據基因序列同源性差異，可分為A、B、C三種基因型，其中B型與C型又可進一步細分為BI~ B5、C1~C4亞型。不同基因型的流行趨勢呈現(xiàn)一定的地域差異，而同一地區(qū)不同時間流行的EV71基因型又有所不同。但是從1997年開始，EV71在中國的流行趨勢較穩(wěn)定，主要以C4型為主。
[0005]腸道病毒71型屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。EV71的病毒顆粒為二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突起，直徑約為24-30nm。病毒衣殼蛋白內部包裹著一條單股正鏈RNA,全長約7408核苷酸，由一個開放閱讀框(open reading frame, 0RF)和兩端的5’，3’非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)組成。ORF編碼一個較大的多聚前體蛋白，由P1、P2、P3三個前體蛋白組成，Pl編碼病毒的結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，其中VPl包含主要的中和抗原表位所在的區(qū)域，VPl常作為EV71的基因型鑒別依據。VP1、VP2、VP3、VP4蛋白先形成亞基，再由亞基組成病毒顆粒，其中VP4包埋在病毒顆粒的內側，其他三種衣殼蛋白均暴露在病毒顆粒的表面。P2、P3編碼非結構蛋白，包括2A、2B、2C、3A、VPg (3B)、3C和3D。2A、3C是特異性蛋白水解酶，主要負責自裂解P1、P2、P3前體蛋白，VPg是病毒基因組RNA的5’末端結合蛋白，3D是RNA聚合酶。
[0006]腸道病毒家族的前體蛋白的剪切過程比較復雜，不過大多都大同小異，以脊髓灰質炎與EV71為例，01^表達的多聚前體蛋白首先裂解為？1、？2、？3，繼而再進一步經2么、3〇和病毒RNA等的作用裂解為各種衣殼蛋白亞基和非結構功能蛋白。其中VPO (VP2+VP4)的裂解位點可能主要與病毒成熟和RNA包裹有關，VPl與2A之間(Pl與P2之間)的位點由2A蛋白酶識別，其他單體蛋白之間的裂解都與3C/3CD有關。
[0007]EV71呈全球分布，無明顯的地域性，流行季節(jié)為夏秋季，但全年均可發(fā)生感染。人是EV71的唯一自然宿主，感染者為唯一傳染源。
[0008]EV71的衣殼蛋白VPl具有最多的型特異性中和位點，因此VPl蛋白編碼基因序列與病毒血清型具有較高的相關性，被用于病毒的型別鑒定和基因進化分析，除了 VPl蛋白編碼基因外，也有利用VP2、VP4蛋白的編碼序列進行分析，但VPl全基因序列為公認的進行基因特征和進化分析的標準區(qū)域，用于EV分子流行病學研究。B亞型主要流行于20世紀70年代的美國和澳大利亞，A、B1、B2型毒株自1987年以來未見報道，其流行似乎已經終止。中國大陸地區(qū)，自1998年以來只有C4亞型EV71流行的報道。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定、高效表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的表達質粒、表達系統(tǒng)以及表達EV71病毒樣顆粒的方法。
[0010]本發(fā)明首先公開了一種表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體，含有分別受MOX啟動子調控的Pl蛋白表達序列和受DAS啟動子調控的蛋白酶表達序列。
[0011]較優(yōu)的，所述蛋白酶表達序列為3C蛋白表達序列；或者，所述蛋白酶表達序列為3⑶蛋白表達序列。本發(fā)明中，3C蛋白表達序列和3⑶蛋白表達序列均能在啟動子控制下表達特異性蛋白水解酶，用于前體蛋白Pi的剪切。
[0012]較優(yōu)的，所述Pl蛋白表達序列如SEQ ID NO:4所示；所述3C蛋白表達序列如SEQIDNO: 5所示；所述3⑶蛋白表達序列如SEQ ID NO: 6所示。進一步的，所述Pl蛋白表達序列表達的Pl蛋白的氨基酸組成如SEQ ID NO:1所示；所述3C蛋白表達序列表達的3C蛋白的氨基酸組成如SEQ ID NO:2所示；所述3CD蛋白表達序列表達的3CD蛋白的氨基酸組成如 SEQ ID NO:3 所示。
[0013]較優(yōu)的，所述多順反子真核表達載體有5’至3’方向排列的DAS啟動子，蛋白酶表達序列，AOXl (TT)轉錄終止序列，MOX啟動子，Pl蛋白表達序列，以及AOXl (TT)轉錄終止序列。
[0014]其中，所述DAS啟動子為漢遜酵母二羥基丙酮合成酶(DAS)基因啟動子，該啟動子的序列如SEQ ID NO:7所示；所述MOX啟動子為漢遜酵母甲醇氧化酶(MOX)基因啟動子，該啟動子的序列如SEQ ID NO:8所示；所述AOXl (TT)轉錄終止序列如SEQ IDNO:9所示。
[0015]較優(yōu)的，本發(fā)明的多順反子真核表達載體還可以含有5’至3’方向排列的MOX啟動子，Pl蛋白表達序列，AOXl (TT)轉錄終止序列，DAS啟動子，蛋白酶表達序列，以及AOXl(TT)轉錄終止序列。
[0016]本發(fā)明采用兩種轉錄效率不同的啟動子，分別控制Pl蛋白和蛋白酶的表達。本發(fā)明中，兩種啟動子的配合不僅獲得了較高的外源蛋白表達量，也利于生產時Pi蛋白和蛋白水解酶的表達調控。
[0017]更優(yōu)的，所述Pl蛋白表達序列左右兩側分別含有BstBI酶和SbfI酶的限制性酶切位點序列；所述蛋白酶表達序列左右兩側分別含有NheI酶和NotI酶的限制性酶切位點序列。[0018]較優(yōu)的，所述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體是由pPICZB質粒改造獲得。
[0019]本發(fā)明第二方面公開了前述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體的制備方法，步驟如下:
[0020]I)采用DAS啟動子替換pPICZB質粒中的AOXl啟動子，構建獲得pDASZ質粒；
[0021]2)采用MOX啟動子替換pPICZB質粒中的AOXl啟動子，構建獲得pMOXZ質粒；
[0022]3)將pDASZ質粒通過BglII與BamHI酶切后連接的方式插入BglII酶處理后的PMOXZ質粒，得到帶有不同啟動子的表達載體pMDZ ；
[0023]4)將蛋白酶表達序列以及Pl蛋白表達序列通過酶切連接的方式插入真核表達質粒pMDZ，獲得Pl蛋白的表達受MOX啟動子調控，且蛋白酶的表達受DAS啟動子調控的表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核質粒。
[0024]為實現(xiàn)上述制備方法，本發(fā)明實施例中給出了一種具體可行的EV71多順反子真核表達載體的構建方法，所述制備方法如下:
[0025]1、pDASZ質粒的構建:構建左右兩端分別為BglII限制性酶切位點和HindIII限制性酶切位點，中間含有DAS啟動子的DAS啟動子插入片段；構建左右兩端分別為HindIII限制性酶切位點和BamHI限制性酶切位點，中間含有AOXl(TT)轉錄終止序列的第一終止子插入片段；然后將BglII與HindIII聯(lián)合酶切處理的DAS啟動子插入片段，HindIII與BamHI聯(lián)合酶切處理第一終止子插入片段，以及BglII與BamHI聯(lián)合酶切處理的質粒pPICZB三者連接，獲得質粒PDASZ ；
[0026]2、pM0XZ質粒的構建:構建左右兩端分別為BglII限制性酶切位點和NdeI限制性酶切位點，中間含有MOX啟動子的MOX啟動子插入片段；構建左右兩端分別為NdeI限制性酶切位點和BamHI限制性酶切位點，中間含有AOXl (TT)轉錄終止序列的第二終止子插入片段；然后將BglII與NdeI聯(lián)合酶切處理的MOX啟動子插入片段，NdeI與BamHI聯(lián)合酶切處理第二終止子插入片段，以及BglII與BamHI聯(lián)合酶切處理的質粒pPICZB三者連接，獲得質粒pMOXZ ；
[0027]3、pMDZ質粒的構建:將步驟I中構建的pDASZ質粒通過BglII與BamHI酶切后連接的方式插入BglII酶處理后的pMOXZ質粒，得到帶有不同啟動子的真核質粒pMDZ ；
[0028]4、表達柯薩奇病毒EV71病毒樣顆粒真核表達載體的構建:首先將BstBI酶和SbfI酶聯(lián)合處理的Pl蛋白表達序列連接入pMDZ質粒，然后與NheI酶和NotI酶聯(lián)合處理的蛋白酶表達序列連接，獲得目的質粒。
[0029]本發(fā)明第三方面公開了一種腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的表達系統(tǒng)，包括酵母細胞以及位于酵母細胞內的前述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體。
[0030]較優(yōu)的，所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克魯維氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維氏酵母(Kluyveromyces Iactis),以及栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的任一種。
[0031]本發(fā)明第四方面公開了一種制備腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的方法，為構建Pl蛋白受MOX啟動子調控表達，并且蛋白酶受DAS啟動子調控表達的真核表達載體，通過酵母表達系統(tǒng)進行表達。
[0032]較優(yōu)的，所述腸道病毒EV71的Pl蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或3所示。
[0033]編碼SEQ ID NO:1所示Pl蛋白的開放閱讀框含有SEQ ID NO:4所示基因片段；編碼SEQ ID NO:2所示蛋白酶的開放閱讀框含有SEQ ID NO:5所示基因片段；編碼SEQ IDNO:3所示蛋白酶的開放閱讀框含有SEQ ID NO:6所示基因片段。
[0034]優(yōu)選的，所述含有受DAS啟動子調控的蛋白酶表達序列以及受MOX啟動子調控的Pl蛋白表達序列的多順反子真核表達載體為前述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體。
[0035]優(yōu)選的，所述真核表達載體中表達PI蛋白的啟動子為漢遜酵母甲醇氧化酶(MOX)基因啟動子；表達蛋白酶的啟動子為漢遜酵母二羥基丙酮脫氫酶(DAS)基因啟動子。所述PI蛋白和蛋白酶的終止子為AOXl (TT)終止序列。
[0036]本發(fā)明最后公開了前述腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的真核表達載體、表達系統(tǒng)，以及制備腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的方法在制備手足口病疫苗中的應用。
[0037]根據漢遜酵母密碼子偏愛性合成編碼EV71-P1、EV71-3C、EV71-3CD蛋白的DNA序列，合成所得的基因連接到漢遜酵母表達載體上，得到同時表達Pl前體蛋白和3C蛋白酶的雙表達質粒及同時表達Pl前體蛋白和3⑶蛋白酶的雙表達質粒。重組質粒通過基因工程方法整合到漢遜酵母基因組中，經大規(guī)模篩選得到高表達菌株。以此重組表達菌株為種子，發(fā)酵表達得到Pl和3C蛋白或Pl和3CD蛋白酶。3C/3CD酶在酵母細胞內部將Pl前體蛋白裂解為VP1、VP3和VP0，`三種衣殼蛋白亞基自組裝成為病毒樣顆粒(VLPs)。二種表達(3C/3⑶)均可通過柱層析等純化方法獲得高純度、形態(tài)均一、性狀穩(wěn)定的VLPs，純化后的VLPs吸附適當?shù)淖魟?如鋁佐劑)成為重組疫苗制劑。由動物實驗驗證重組疫苗制劑的免疫原型。
[0038]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明開發(fā)了一種結構上類似于天然腸道病毒71型的病毒樣顆粒作為疫苗抗原，該抗原由多個單體構成，分子量巨大，在電鏡下觀察到顆粒狀重復性結構，顆粒狀的抗原一般都具有較強的免疫原性。本發(fā)明制備的疫苗抗原不含有病毒的遺傳物質，不會有潛在的感染可能性，是更合適的疫苗候選抗原。本發(fā)明通過使用不同的啟動子，調節(jié)病毒衣殼蛋白Pl與蛋白酶3C/3CD的表達量，調控病毒樣顆粒前體蛋白Pl的剪切，從而獲得形態(tài)均一的病毒樣顆粒。本發(fā)明使用Pl蛋白前體與3C蛋白酶或Pl蛋白前體與3CD蛋白酶組合，均可制備出形態(tài)均一、具有高免疫原性的抗原病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒作為疫苗抗原，應用于EV71、CV16 二價手足口病疫苗，也展現(xiàn)出良好的免疫原性，是合適的疫苗候選抗原。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖l:pMDZ質粒圖譜
[0040]圖2:EV71-Pl-pMDZ 質粒圖譜
[0041]圖3:EV71-P13C-pMDZ 質粒圖譜
[0042]圖4:EV71-P13CD_pMDZ 質粒圖譜[0043]圖5:EV71-P13C-pMDZ 酶切鑒定圖
[0044]泳道1:EV71-P13C_pMDZ 質粒
[0045]泳道2:EV71-P13C-pMDZ 質粒(BstBI+SbfI 雙酶切)
[0046]泳道3:EV71-P13C-pMDZ 質粒(Nhel+Notl 雙酶切)
[0047]泳道4:250bp DNA ladder (TAKARA)
[0048]圖6:EV71-P13CD_pMDZ 酶切鑒定圖
[0049]泳道1:EV71-P13CD_pMDZ 質粒
[0050]泳道2:EV71-P13CD-pMDZ 質粒(BstBI+SbfI 雙酶切)
[0051]泳道3:EV71-P13CD-pMDZ 質粒(Nhel+Notl 雙酶切)
[0052]泳道4:250bp DNA ladder (TAKARA)
[0053]圖7:重組EV71病毒樣顆粒Western-Blot檢測結果
[0054]泳道1:HS-EV71-P13C-pMDZ菌株純化的EV71病毒樣顆粒(P1/3C來源)
[0055]泳道2:蛋白質預染Marker [0056]泳道3:HS-EV71-P13CD-pMDZ菌株純化的EV71病毒樣顆粒(P1/3CD來源)
[0057]圖8:重組EV71病毒樣顆粒動態(tài)光散射檢測結果
[0058]A:HS-EV71-P13C-pMDZ菌株純化的EV71病毒樣顆粒(P1/3C來源)
[0059]B:HS-EV71-P13CD-pMDZ 菌株純化的 EV71 病毒樣顆粒(P1/3CD 來源)
[0060]圖9:重組EV71病毒樣顆粒電鏡觀察(25000倍)
[0061]A:HS-EV71-P13C-pMDZ菌株純化的EV71病毒樣顆粒(P1/3C來源)
[0062]B:HS-EV71-P13CD-pMDZ 菌株純化的 EV71 病毒樣顆粒(P1/3CD 來源)
【具體實施方式】
[0063]以下為本發(fā)明的具體實施例，用于進一步理解本發(fā)明的技術方法，但不以任何形式限制本發(fā)明的保護范圍。
[0064]實施例1病毒顆粒的制備
[0065]1.表達基因的選擇與密碼子的優(yōu)化設計
[0066]編碼EV71-P1蛋白與EV71-3C或3CD蛋白的DNA序列參照中國株Fuyang.Anhu1.P.R.C/17.08/1 (GenBank:EU703812.1)，F(xiàn)uyang.Anhu1.P.R.C/17.08/1 株 EV71-P1 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，EV71-3C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2K*，EV71_3CD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0067]對Fuyang.Anhu1.P.R.C/17.08/1 株中編碼 SEQ ID NO:1 所示 EV71-P1 蛋白、SEQIDN0:2所示EV71-3C蛋白和SEQ ID NO:3所示EV71-3CD蛋白的野生型DNA序列進行改造，密碼子盡可能采用漢遜酵母中使用頻率較高的密碼子，同時避免了可能影響表達的轉錄因子結合區(qū)、重復序列和RNA高級結構。密碼子優(yōu)化后得到編碼EV71-P1蛋白的重組基因序列如SEQ ID N0:4所示，編碼EV71-3C蛋白的重組基因序列如SEQ ID N0:5所示，編碼EV71-3CD蛋白的重組基因序列如SEQ ID N0:6所示。
[0068]2.重組表達載體的構建
[0069]2.1pMDZ質粒的構建:pMDZ質粒改造自pPICZB質粒，具體方法如下:
[0070]I)通過PCR方式，采用SEQ ID NO:10_11所示序列的引物從漢遜酵母基因組DNA中擴增得到MOX啟動子插入片段；采用SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16所示序列的引物從pPICZB質粒中擴增得到含AOXTT終止序列的片段。Bglll+Ndel聯(lián)合酶切處理MOX啟動子插入片段，Ndel+BamHI處理AOXTT終止序列片段，Bglll+BamHI處理pPICZB，再用小牛腸堿性磷酸酶處理pPICZB-Bglll+BamHI片段，三片段連接后得到質粒
[0071]ρΜΟΧΖ ο
[0072]2)采用SEQ ID NO: 12-13所示序列的引物從漢遜酵母基因組DNA中擴增得到DAS啟動子插入片段；采用SEQ ID NO:15-16所示序列的引物從pPICZB質粒中擴增得到含AOXTT終止序列的片段。Bglll+Hindlll聯(lián)合酶切處理DAS啟動子插入片段，Hindlll+BamHI處理AOXTT終止序列片段，Bglll+BamHI處理pPICZB，再用小牛腸堿性磷酸酶處理pPICZB-Bglll+BamHI片段，三片段連接后得到質粒pDASZ。
[0073]3)將pDASZ質粒表達盒通過BglII和BamHI酶切后連接的方式(參見InvitrogenpPICZB操作手冊提到的體外多拷貝質粒構建方案)插入BglII處理的pMOXZ質粒，得到帶有不同啟動子控制的漢遜酵母雙表達質粒pMDZ。MOX啟動子擴增引物
[0074]h游引物:5’ -ACCAAAAGATCTGTCGACGCGGAG-3’ (SEQIDN0:10)
[0075]下游引物:5，-CTTGGCTACATATGATCGATCGTGTACACGTTTCGAATTTGTTTTTGTACTTT-3，(SEQ ID NO:11)
[0076]DAS啟動子擴增引物
[0077]h游引物:5’ -ACCAGGAGATCTAGCTTGAATCGTGAAAC-3’ (SEQ ID NO: 12)
[0078]下游引物:5’-TCAAGTCAAGCTTCACGTGGCTAGCGGGAAGAAAAGACAGAG-3’ (SEQ IDNO:13)`
[0079]AOXTT擴增引物
[0080]引物1:5’ -GCCCGATCATATGCCTGCAGGCAGCTTTCTAGAACAA-3’ (SEQ ID NO:14)
[0081]引物2:5’ -AAACGTGAAGCTTGAATTCGCGGCCGCCAGCTTTCT-3’ (SEQ ID NO:15)
[0082]引物3:5’ -TGGGGGATCCGCACAAACGAA-3，(SEQ ID NO:16)
[0083]構建的pMDZ質粒如圖1所示，該質粒帶有兩個開放閱讀框，一個開放閱讀框由漢遜酵母甲醇氧化酶(MOX)啟動子控制，另一個表達盒由漢遜酵母二羥基丙酮合成酶(DAS)啟動子控制，兩者都是漢遜酵母甲醇代謝途徑中所必須的酶，在葡萄糖、甘油等碳源條件下強烈抑制。
[0084]2.2EV71-P13C-pMDZ 和 EV71_P13CD_pMDZ 重組表達載體的構建:
[0085]設計5’端和3’端分別含有BstBI酶切位點和SbfI酶切位點的Pl蛋白表達序列并進行全基因合成，獲得SEQ ID N0:4所示序列的核苷酸片段；設計5’端和3’端別含有NheI酶切位點和NotI酶切位點的3C蛋白表達序列并進行全基因合成，獲得SEQ ID NO:5所示序列的核苷酸片段；計5’端和3’端別含有NheI酶切位點和NotI酶切位點的3CD蛋白表達序列并進行全基因合成，獲得SEQ ID N0:6所示序列的核苷酸片段。
[0086]采用BstBI酶和SbfI酶的混合酶酶切處理Pl蛋白表達序列與pMDZ質粒，酶切后的片段由T4DNA連接酶連接，獲得的重組質粒轉化大腸桿菌DH5a菌株，37°C過夜倒置培養(yǎng)。挑取部分克隆抽提質粒，以BstBI和SbfI酶切鑒定，構建成功的重組質粒命名為EV71-Pl-pMDZ (圖2)。采用NheI酶和NotI酶的混合酶酶切3C蛋白表達序列或3CD蛋白表達序列，同樣的酶酶切前一步驟構建的EV71-Pl-pMDZ重組質粒，酶切后的片段由T4DNA連接酶連接，獲得的重組質粒轉化大腸桿菌DH5菌株，37°C過夜倒置培養(yǎng)。挑取部分克隆抽提質粒，以NheI和NotI酶切鑒定，酶切鑒定結果見圖5和圖6，構建成功的重組質粒分別命名為 EV71-P13C-pMDZ (圖 3)和 EV71_P13CD_pMDZ (圖 4)。
[0087]3.EV71-P13C-pMDZ/EV71-P13CD-pMDZ 重組表達菌株構建
[0088]漢遜酵母菌株來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC編號2.2497。將構建的重組質粒EV71-P13C-pMDZ或重組質粒EV71_P13CD-pMDZ由ScaI酶線性化，分別電轉漢遜酵母，電轉條件為1500V，120Q，50F。電轉后菌液涂布YPD平板(200ug/mlZeocin)，37°C過夜倒置培養(yǎng)。挑取部分克隆劃線YPD平板(1500ug/ml Zeocin), 37置培養(yǎng)2天，挑取生長情況較好的菌株作為發(fā)酵菌種，分別命名為HS-EV71-P13C-pMDZ和HS-EV71-P13CD-pMDZ。
[0089]4.重組蛋白的發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0090]取出發(fā)酵菌種(HS-EV71-P13C-pMDZ或 HS-EV71_P13CD-pMDZ)，在超凈臺內接入5ml活化培養(yǎng)基(YPD)，在恒溫振蕩培養(yǎng)器內以200rpm，30~37 °C培養(yǎng)過夜。20小時左右測得活化液的0D_在I~2的范圍，停止培養(yǎng)。鏡檢無雜菌后將Iml活化液轉接入500ml種子培養(yǎng)基(YPD)，在恒溫振蕩培養(yǎng)器內以200rpm，30~37°C培養(yǎng)過夜。鏡檢無雜菌后按按1:15接種。使用BIOENGINEERING RALF Basic發(fā)酵罐，發(fā)酵用基礎鹽培養(yǎng)基BSM。發(fā)酵初始溫度設定為30~37°C，初始pH5~6，轉速300rpm，通氣量0.5vvm, D0100%,添加PTMl痕量鹽類。初始增殖階段大約20~24小時，通過調節(jié)攪拌轉速、空氣流量、罐壓和補加純氧維持溶氧值20~40%。當菌體濕重達到60~90g/L。補加50%甘油或葡萄糖溶液。維持溶氧值20~40%，補加4~8小時。檢測菌體濕重增加到100~200g/L時，停止補料。將溫度設定在30~37°C，pH值控制調為6~7，開始加入甲醇誘導，甲醇的補加速度為50~100mL/min。維持溶氧值高于20~40%，溫度設定在30~37°C，pH值控制為6~7。誘導40小時發(fā)酵結束。用冷凍離心機8000rpm，10分鐘離心發(fā)酵液。離心結束后棄上清收集菌泥。收獲的菌泥放在_20°C冰箱內凍存。
[0091]5.病毒樣顆粒純化
[0092]取200g發(fā)酵菌體，加入4 °C預冷的破菌用緩沖溶液(50mM PB, 0.2M NaCl，0.5%Tween-80, pH7.0) 800ml,于磁力攪拌器上攪拌至完全混勻。采用高壓均質機(ATSAH-100B)高壓破碎以上菌體混懸液，調節(jié)均質閥，控制破菌壓力為1200bar。重復以上高壓破碎過程3-4遍。高速冷凍離心機(ThermoFisher lynx4000)離心澄清破菌液,設定條件10000rpm，30min，8°C，離心分離，收集離心后的上清液。上清液中加入固體硫酸銨至終濃度為30~40%，4°C放置過夜。按10000rpm、30min、8°C條件離心分離，棄去上清保留沉淀物，加入緩沖溶液(50mM PB ρΗ7.0) 1000ml，攪拌 2 ~4hr。按 10000rpm、30min、8°C條件離心分離，保留上清用于層析分離。將上清液上樣至陰離子層析柱Capto Q (GE公司)吸附，利用0.2-1M NaCl梯度洗脫，根據紫外吸收峰分部收集樣品。SDS-PAGE電泳分析各部分組份，合并含有目的蛋白部分，100KD超濾(Millipore公司)濃縮20倍，并用0.45um膜過濾。過濾后的上清液上樣至分子篩層析柱S印har0Se4FF (GE公司)，收集純化后的目的蛋白峰。經過上述步驟純化后，按照最終純化蛋白的產量和純化步驟的得率計算，本發(fā)明方法中EV71病毒樣顆粒在漢遜酵母中的表達量約為200mg/升發(fā)酵液。HS-EV71_P13C-pMDZ與HS-EV71-P13CD-pMDZ兩個菌株(分別對應P1/3C來源與P1/3CD來源)在表達量上無顯著區(qū)別。
[0093]6.病毒樣顆粒性質鑒定
[0094]純化的病毒樣顆粒蛋白樣品經過Western-blot檢測,可與EV71的多抗(abeam公司，貨號ab26858)呈特異性的顯色反應(圖7)。動態(tài)光散射(Malvern Instruments Nano
S)檢測純化樣品顆粒直徑范圍在20~30nm左右(圖8);純化的病毒樣顆粒蛋白樣品經磷酸鎢染色后，電鏡(Philips)觀察呈現(xiàn)病毒樣顆粒(圖9)。
[0095]實施例2病毒顆粒的抗原性能檢測
[0096]1.病毒樣顆粒疫苗制備
[0097]I)單價EV71疫苗:將純化獲得的EV71病毒樣顆粒蛋白(P1/3C來源與P1/3CD來源)分別吸附鋁佐劑，制備獲得具有免疫原性的EV71疫苗。
[0098]2) 二價疫苗:將CV16病毒樣顆粒蛋白(該蛋白的制備可參考申請?zhí)枮?01210008528.4的發(fā)明專利:重組柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒的制備方法及其應用)吸附鋁佐劑，與上述EV71疫苗按1:1混合，制備獲得具有免疫原性的EV71、CV16 二價疫苗。
[0099]2.EV71單價疫苗，以及EV71、CV16 二價疫苗免疫原性的測定
[0100]選取6~8周齡的SPF級BALB/c小鼠，分為7組，每組6只小鼠。其中I組小鼠用含有鋁佐劑的緩沖液(50mM PB pH7.0)進行免疫(作為陰性對照組)，EV71單價疫苗3組每次免疫劑量為I μ g/只、0.1 μ g/只、0.01 μ g/只，二價疫苗3組每次免疫劑量為I μ gEV71+1 μ g CV16/ 只、0.1 μ g EV71+0.1 μ g CV16/ 只、0.01 μ g EV71+0.01 μ g CV16/ 只，分別于第O、14天皮下注射免疫，共免疫兩次，第二次免疫后兩周采血。將采集得到的血液于4°C放置過夜后，5000g離心lOmin，吸取上清，即得到鼠多抗血清，于-20°C存放，并檢測鼠血清的陽轉率。具體方法如下:
[0101]用包被液稀釋純化的EV71蛋白或CV16蛋白至I μ g/ml,向酶標板每個孔中各加
0.lml，4°C包被過夜。除去包被液，洗板。每孔加入0.3ml封閉液(5%脫脂奶粉+PBST)于37°C保溫2小時。除去包被液，每孔加入用稀釋緩沖液(2%脫脂奶粉+PBST)以1:1000稀釋的被檢血清各0.1ml，于37°C保溫I小時，除去血清液，洗板。然后向每孔加入用稀釋緩沖液以1:5000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG各0.1ml，37°C保溫0.5小時后除去酶標液，洗板；然后向每孔中加入0.1ml DAB顯色液，室溫避光作用10分鐘后加2M H2SO40.05ml終止液終止反應，并用酶標比色儀測定OD45tl值，OD450值如表1所示。三個檢測組的陽轉率結果如表2所示。Cutoff值為陰性對照被檢血清抗體的OD45tl值的平均值加上3倍標準差，OD450值大于Cutoff值的小鼠判定為陽性，OD450值小于Cutoff值的小鼠判定為陰性。
[0102]表1疫苗的抗原性檢測結果
【權利要求】
1.一種表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體,含有分別受MOX啟動子調控的Pl蛋白表達序列和受DAS啟動子調控的蛋白酶表達序列。
2.如權利要求1所述的多順反子真核表達載體，其特征在于，所述蛋白酶表達序列為3C蛋白表達序列；或者，所述蛋白酶表達序列為3⑶蛋白表達序列。
3.如權利要求2所述的多順反子真核表達載體，其特征在于，所述Pl蛋白表達序列如SEQID NO:4所不；所述3C蛋白表達序列如SEQ ID NO:5所不；所述30)蛋白表達序列如SEQ ID NO:6 所示。
4.如權利要求1所述的多順反子真核表達載體，其特征在于，所述多順反子真核表達載體有5’至3’方向排列的DAS啟動子，蛋白酶表達序列，AOXl (TT)轉錄終止序列，MOX啟動子，Pl蛋白表達序列，以及AOXl (TT)轉錄終止序列。
5.如權利要求4所述的多順反子真核表達載體，其特征在于，所述DAS啟動子為漢遜酵母二羥基丙酮合成酶基因啟動子，該啟動子的序列如SEQ ID NO:7所示；所述MOX啟動子為漢遜酵母甲醇氧化酶基因啟動子，該啟動子的序列如SEQ ID NO:8所示；所述AOXl (TT)轉錄終止序列如 SEQ ID NO:9所示。
6.如權利要求1所述的多順反子真核表達載體，其特征在于，所述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體是由PPICZB質粒改造獲得。
7.權利要求1-6任一權利要求所述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體的制備方法，步驟如下: 1)采用DAS啟動子替換pPICZB質粒中的AOXl啟動子，構建獲得pDASZ質粒； 2)采用MOX啟動子替換pPICZB質粒中的AOXl啟動子，構建獲得pMOXZ質粒； 3)將pDASZ質粒通過BglII與BamHI酶切后連接的方式插入BglII酶處理后的pMOXZ質粒，得到帶有不同啟動子的表達載體PMDZ ； 4)將蛋白酶表達序列以及Pl蛋白表達序列通過酶切連接的方式插入真核表達質粒pMDZ，獲得Pl蛋白的表達受MOX啟動子調控，且蛋白酶的表達受DAS啟動子調控的表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核質粒。
8.一種腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的表達系統(tǒng)，包括酵母細胞以及位于酵母細胞內的權利要求1-6任一權利要求所述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體。
9.如權利要求8所述的腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述酵母選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、脆壁克魯維氏酵母、乳酸克魯維氏酵母，以及栗酒裂殖酵母中的任一種。
10.權利要求1-6任一權利要求所述表達腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的多順反子真核表達載體、權利要求8-9任一權利要求所述表達系統(tǒng)，以及權利要求7所述制備方法在制備手足口病疫苗中的應用。
【文檔編號】C12N15/81GK103525855SQ201310476097
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權日:2013年10月12日
【發(fā)明者】張高峽 申請人:上海博唯生物科技有限公司