分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種分枝桿菌屬檢測試劑盒，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計的兩對引物：內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的分枝桿菌屬檢測試劑盒檢測效果更全面、漏檢率低。
【專利說明】分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法
[0001]本申請為申請日:2012年9月19日，申請?zhí)?201210352230.5，發(fā)明名稱:分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法。【背景技術(shù)】
[0003]分枝桿菌屬(Mycobacterium)是一類細(xì)長略帶彎曲的桿菌,有分枝生長的趨勢,因而得名。本菌屬種類較多，可分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌三類。
[0004]結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis),俗稱結(jié)核桿菌或結(jié)核菌,是引起結(jié)核病的病原菌。結(jié)核病是威脅人類及動物健康的重大傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)專門發(fā)布了全球結(jié)核控制戰(zhàn)略，并把每年的3月24號定為世界防治結(jié)核病日。
[0005]與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對應(yīng)的是各種非結(jié)核分枝桿菌，目前已發(fā)現(xiàn)上百種，廣泛存在于土壤、環(huán)境、動物中。2000年第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示，我國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者451萬，菌陽肺結(jié)核患者196萬。分枝桿菌培養(yǎng)陽性者中，結(jié)核分枝桿菌占86.4%，牛結(jié)核分枝桿菌占2.5%，非結(jié)核分枝桿菌占11.1%。而1990年第三次全國結(jié)核病流調(diào)時非結(jié)核分枝桿菌僅占4.9%，由此可見，非結(jié)核分枝桿菌的比率較前明顯增加。非結(jié)核分枝桿菌患者對大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物耐藥，采用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案治療無效。傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定和藥敏實(shí)驗方法建立在培養(yǎng)基礎(chǔ)上，煩瑣、費(fèi)時，需I-2月時間，不能滿足臨床開展早期有效化療的需要，使非結(jié)核分枝桿菌患者經(jīng)長期規(guī)則化療而療效不佳，療程延長，成為難治、復(fù)治患者，細(xì)菌可能在局部播散。因此，分枝桿菌屬的快速鑒定對結(jié)核病及非結(jié)核分枝桿菌病的早期診斷、鑒別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。
[0006]傳統(tǒng)分枝桿菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtimePCR)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫擴(kuò)增(IsothermalAmplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進(jìn)步,現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。
[0007]因此，需要一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法以解決上述問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的分枝桿菌屬檢測試劑盒。
[0009]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn):一種分枝桿菌屬檢測試劑盒，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計的兩對引物:內(nèi)引物FIP/BIP和外弓丨物F3/B3，所述的兩對引物為
[0010]外引物F3:(SEQIDN01)
[0011 ] TCATCACCGTCGAGGAGTC
[0012]外引物B3: (SEQIDN02 )
[0013]CGGCTCCGATGACCTTCTC
[0014]內(nèi)引物FIP: (SEQIDN03 )
[0015]GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC
[0016]內(nèi)引物BIP:(SEQIDN04 )
[0017]AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ；
[0018]或
[0019]外引物F3’:(SEQIDN05)
[0020]AGTCCATCGGTGACCTGATC
[0021]外引物B3’:(SEQIDN06)
[0022]AGGACCGCCTCCTGAC
[0023]內(nèi)引物FIP’:(SEQIDN07)
[0024]GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA
[0025]內(nèi)引物BIP’:(SEQIDN08)
[0026]GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT ；
[0027]或
[0028]外引物F3”:(SEQIDN01)
[0029]TCATCACCGTCGAGGAGTC
[0030]外引物B3 ”:( SEQIDN09 )
[0031]AGCGGCAGCAGRTCCT
[0032]內(nèi)引物FIP”:(SEQIDN010)
[0033]CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC
[0034]內(nèi)引物BIP”:(SEQIDN04)
[0035]AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ；
[0036]其中，V代表 A/C/G，R 代表 A/G。
[0037]本發(fā)明針對分枝桿菌屬的hsp65基因設(shè)計引物，所述hsp65基因為65kDa熱休克蛋白(heatshockprotein)基因，由于該基因高度保守并廣泛存在于各分枝桿菌屬菌種中，因此其引物能夠擴(kuò)增并檢測出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及非結(jié)核分枝桿菌所有菌種，包括:結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、田鼠分枝桿菌(M.microti)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、牛分枝桿菌(M.bovis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.1ntracellulare)、龜分枝桿菌(M.chelonae)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)、戈登分枝桿菌(Μ.gordonae)、海分枝桿菌(Μ.marinum)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、土分枝桿菌(M.terrae)、鳥分枝桿菌(M.avium)、草分枝桿菌(M.phlei)、瘰病分枝桿菌(M.scrofulaceum)、胺腫分枝桿菌(M.abscessus)、潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)、施氏分枝桿菌(M.shimoidei)、亞洲分枝桿菌(M.asiaticum)、蟾蜍分枝桿菌(M.xenopi)、胃分枝桿菌(M.gastri)。
[0038]作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括BstDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。
[0039]作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，
[0040]所述的BstDNA聚合酶:酶濃度4-10U/ μ L ；
[0041]所述的反應(yīng)液含:1.6 ~2mmol/LdNTP、20 ~25mmol/LTris-HCl、10 ~12.5mmol/LKCl、10 ~12.5mmol/L (NH4)2SO4,8 ~IOmmoI/LMgSO4、0.I ~0.125 體積％ TritonX-100,
0.8~lmol/L甜菜堿；
[0042]所述的樣品預(yù)處理液含:10~20mmol/LpH8.0 的 Tris_HCl、l ~2mmol/LEDTA 和I ~1.2 體積 %TritonX-100 ；
[0043]所述的顯色液為SYBRGreenI 或 EvaGreen ；
[0044]所述穩(wěn)定液為石蠟油；
[0045]所述的陽性對照為BCG基因組DNA ；
[0046]所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0.2~0.25 μ mol/L，外引物F3/B3的濃度各為1.2~
2.0 μ mol/L。
[0047]作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的最優(yōu)選實(shí)施方式，
[0048]所述的BstDNA聚合酶:酶濃度8U/ μ L ;
[0049]所述的反應(yīng)液含:2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L(NH4) 2S04、10mmol/LMgS04、0.125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；
[0050]所述的樣品預(yù)處理液含:20mmol/LpH8.0 的 Tris_HCl、2mmol/LEDTA 和 1.2 體積 ％TritonX-100 ；
[0051]所述的顯色液為SYBRGreenI ；
[0052]所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為0.2 μ mol/L ；
[0053]所述的外引物F3/B3的濃度為1.6 μ mol/L。
[0054]作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個空腔的縱向延伸的隔板。
[0055]作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的A、B兩個空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和BstDNA聚合酶的混合而成。
[0056]環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的核酸檢測方式，其擴(kuò)增效率超強(qiáng)，表現(xiàn)在兩個方面:(I)靈敏度比PCR高出的是數(shù)量級的差異；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA數(shù)量，也比PCR產(chǎn)物高出太多，能夠達(dá)到幾個μ g，但過于靈敏和產(chǎn)物量的巨大，使得LAMP極其容易污染，尤其是在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)后需要反應(yīng)管開蓋加入顯色劑，容易出現(xiàn)氣溶膠污染。而氣溶膠污染會使得檢測結(jié)果假陽性率高，并且污染其他樣品，污染檢測區(qū)域，同時還難以去除。本發(fā)明的反應(yīng)管通過隔板和穩(wěn)定液的設(shè)計，有效地將顯色液和工作液分隔開來，不僅能保證在儲運(yùn)過程中相對保持完整封閉性，而且無需打開管蓋，就可以實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)，大大降低氣溶膠的污染。
[0057]本發(fā)明還提供一種分枝桿菌屬檢測試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟:
[0058](I)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；
[0059]( 2)將步驟(I)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA;
[0060](3)在反應(yīng)容器中加入BstDNA聚合酶0.9-1.8體積份數(shù)、反應(yīng)液38-40體積份數(shù)、穩(wěn)定液52-54.5體積份數(shù)、樣品模板DNA4.5-9體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；
[0061](4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；
[0062]所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計的兩對引物。
[0063]作為本發(fā)明使用分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63-65°C，反應(yīng)時間45-90min。
[0064]本發(fā)明所說的基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplicationofDNA,簡稱LAMP)快速檢測分枝桿菌屬的方法，是利用BstDNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計的兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3 )，特異性識別靶序列上的六個獨(dú)立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63-65°C)條件下45-90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初步鑒定需2-3天，完成鑒定報告需10-15天；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小時。并且，本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。
[0065]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到I小時即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高；
4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗證率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的hsp65基因作為靶基因設(shè)計引物，使得本發(fā)明的檢測試劑盒檢測分枝桿菌屬的準(zhǔn)確率更高在本發(fā)明檢測試劑盒中采用特制的反應(yīng)管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時方便操作。
【具體實(shí)施方式】
[0066]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。
[0067]下列縮略語適用于本發(fā)明:
[0068]LAMP:loop-mediatedisothermalamplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增
[0069]dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脫氧核苷三憐酸
[0070]Bst 酶:BstDNApolymerase (Iargefragment), BstDNA 聚合酶(大片段)
[0071]EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸
[0072]DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸
[0073]Betaine:甜菜堿
[0074]TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚
[0075]hsp65:65kDa 熱休克蛋白`
[0076]BCG:卡介苗
[0077]實(shí)施例1試劑盒的制備
[0078](I)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物:
[0079]外引物F3:(SEQIDN01)
[0080]TCATCACCGTCGAGGAGTC[0081 ]外引物 B3: (SEQIDN02 )
[0082]CGGCTCCGATGACCTTCTC
[0083]內(nèi)引物FIP: (SEQIDN03 )
[0084]GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC
[0085]內(nèi)引物BIP:(SEQIDN04)
[0086]AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG
[0087](V 代表 A/C/G)
[0088](2)購置DNA聚合酶:BstDNA聚合酶置于容器；
[0089](3)配制反應(yīng)液和引物:反應(yīng)液含有 2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-Cl、12.5mmol/LKCl ,12.5mmol/L (NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各0.2 μ mol/L和外引物F3/B3各0.25 μ mol/L,置于容器；
[0090](4)配制樣品預(yù)處理液:樣品預(yù)處理液含有20mmol/LTris-HCl (pH80)、2mmol/LEDTA和L 2體積％TritonX-100，置于容器；
[0091](5)購置穩(wěn)定液:石蠟油，置于容器；
[0092](6)購置顯色液:SYBRGreenI，置于容器；
[0093](7)提取陽性對照:提取BCG基因組DNA，置于容器；
[0094](8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。[0095]制備工藝簡述如下:
[0096]1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；
[0097]2、將上述(2)-(4)步驟配制的液體無菌分裝，并按照實(shí)驗用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；
[0098]3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；
[0099]4、將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
[0100]5、組裝試劑盒。
[0101]實(shí)施例2試劑盒的制備
[0102](I)按以下序列經(jīng)DNA合 成儀合成寡聚脫氧核酸引物:
[0103]外引物F3:(SEQIDN01)
[0104]TCATCACCGTCGAGGAGTC
[0105]外引物B3: (SEQIDN02 )
[0106]CGGCTCCGATGACCTTCTC
[0107]內(nèi)引物FIP: (SEQIDN03 )
[0108]GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC
[0109]內(nèi)引物BIP:(SEQIDN04)
[0110]AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG
[0111](V 代表 A/C/G)
[0112](2)購置DNA聚合酶:BstDNA聚合酶置于容器；
[0113](3)配制反應(yīng)液和引物:反應(yīng)液含有 1.6mmoI/LdNTP,20mmoI/LTris-ClUOmmoI/LKCU10mmol/L (NH4) 2S04、8mmoI/LMgSO4、0.I 體積 ％ TritonX-100,0.8mol/L 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各0.2 μ mol/L和外引物F3/B3各0.25 μ mol/L,置于容器；
[0114](4)配制樣品預(yù)處理液:樣品預(yù)處理液含有10mmol/LTris-HCl (pH8.0)、lmmol/LEDTA和L O體積％TritonX-100，置于容器；
[0115](5)購置穩(wěn)定液:石蠟油，置于容器；
[0116](6)購置顯色液:EVAGreenI,置于容器；
[0117](7)提取陽性對照:提取BCG基因組DNA，置于容器；
[0118](8)將上述7個容器裝成試劑盒，封裝。
[0119]其他同實(shí)施例1。
[0120]實(shí)施例3試劑盒的制備
[0121]其他條件與實(shí)施例1相同，其不同僅在于步驟(I)中的引物為:
[0122]外引物F3’:(SEQIDN05)
[0123]AGTCCATCGGTGACCTGATC
[0124]外引物B3’:(SEQIDN06)
[0125]AGGACCGCCTCCTGAC
[0126]內(nèi)引物FIP’:(SEQIDN07)
[0127]GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA
[0128]內(nèi)引物BIP’:(SEQIDN08)[0129]GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT
[0130]實(shí)施例4試劑盒的制備
[0131]其他條件與實(shí)施例1相同，其不同僅在于步驟(I)中的引物為:
[0132]外引物F3”:(SEQIDN01)
[0133]TCATCACCGTCGAGGAGTC
[0134]外引物B3 ”:( SEQIDN09 )
[0135]AGCGGCAGCAGRTCCT
[0136]內(nèi)引物FIP”:(SEQIDN010)
[0137]CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC
[0138]內(nèi)引物BIP”:(SEQIDN04)
[0139]AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG
[0140](V 代表 A/C/G，R 代表 A/G)
[0141]實(shí)施例5分枝桿菌屬檢測試劑盒的應(yīng)用
[0142]一、方法和材料
[0143]1、菌株
[0144]本發(fā)明采用菌株有29株，主要來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心、中國藥品生物制品檢定所。詳見表I。
[0145]表I菌株名稱及來源
【權(quán)利要求】
1.一種分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計的兩對引物:內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的兩對引物為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括BstDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶:酶濃度4-10U/ μ L ； 所述的反應(yīng)液含6 ~2mmol/LdNTP、20 ~25mmol/LTris-HCl、10 ~12.5mmol/LKCl、10 ~12.5mmol/L (NH4)2SO4,8 ~IOmmoI/LMgSO4'0.1 ~0.125 體積％ TritonX-1OO,0.8 ~lmol/L甜菜堿； 所述的樣品預(yù)處理液含:10~20mmol/LpH8.0的Tris_HCl、l~2mmol/LEDTA和I~1.2 體積 %TritonX-100 ； 所述的顯色液為SYBRGreenI或EvaGreen ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油； 所述的陽性對照為BCG基因組DNA ； 所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0.2~0.25 μ mol/L,外引物F3/B3的濃度各為1.2~2.0 μ mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶:酶濃度8U/ μ L ; 所述的反應(yīng)液含:2mmol/LdNTP、25mmol/LTris-HCl、12.5mmol/LKCl、12.5mmol/L (NH4)2S04、10mmol/LMgS04、0.125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿； 所述的樣品預(yù)處理液含:20mmol/LpH8.0的Tris-HCl、2mmol/LEDTA和1.2體積 ％TritonX-100 ； 所述的顯色液為SYBRGreenI ； 所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度各為0.2 μ mol/L ； 所述的外引物F3/B3的濃度各為1.6 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個空腔的縱向延伸的隔板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和BstDNA聚合酶的混合而成。
7.一種使用如權(quán)利要求2所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀； (2)將步驟(I)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA ； (3)在反應(yīng)容器中加入BstDNA聚合酶0.9-1.8體積份數(shù)、反應(yīng)液38-40體積份數(shù)、穩(wěn)定液52-54.5體積份數(shù)、樣品模板DNA4.5-9體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)； (4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性 ； 所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以分枝桿菌屬的hsp65基因為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)設(shè)計的兩對引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63-65°C，反應(yīng)時間45-90min。
【文檔編號】C12Q1/04GK103451309SQ201310426393
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月19日
【發(fā)明者】曹以誠, 茅莉娜, 陳振柳, 杜正平, 王靜, 呂冰凌 申請人:廣州華峰生物科技有限公司