一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體。該高抗TuMV的RNA，是具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ?ID№.2所示的核苷酸序列；2）與1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。本發(fā)明的RNA和編碼該RNA的RNAi載體，可用來增強(qiáng)植物對(duì)TuMV或草銨膦除草劑的抗性，同時(shí)也為高抗TuMV轉(zhuǎn)基因植物的培育奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物抗病毒基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高抗TuMV的RNA和編碼該RNA的RNAi載體。
【背景技術(shù)】
[0002]完菁花葉病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)屬馬鈴薯 Y 病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。TuMV寄主范圍十分廣泛，能夠侵染43科156屬超過318種植物。TuMV是十字花科作物中危害最大的病毒病。感染病毒后的作物還容易感染霜霉病和軟腐病，造成復(fù)合侵染，直接影響到產(chǎn)量和商品價(jià)值。
[0003]油菜是我國(guó)最主要的油料作物。蕪菁花葉病毒病是油菜的重要病害之一。近年來，在我國(guó)油菜主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生有日益流行加重趨勢(shì)。據(jù)調(diào)查發(fā)病田塊發(fā)病率一般為20%-30%，重的發(fā)病率在50%以上，造成油菜籽產(chǎn)量的重大損失。感病油菜不僅產(chǎn)量降低，而且產(chǎn)油率和種子萌芽率也明顯降低，品質(zhì)下降。此外，我國(guó)白菜因該病毒危害平均每年造成5%的產(chǎn)量損失，有些年份減產(chǎn)10%以上，病害嚴(yán)重的地塊幾乎絕收。
[0004]TuMV主要是靠蚜蟲以非持久性的方式傳播，據(jù)報(bào)道目前至少有89種蚜蟲可傳播，而采用殺蟲劑不可能很快殺死全部的蚜蟲以阻止病毒的傳播，僅靠殺蟲劑殺蚜防治病毒病的效果不明顯，還易造成環(huán)境污染。因此尋求新的抗病方法成為了一項(xiàng)迫切的任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是 提供一種高抗蕪菁花葉病毒(Turnip Mosaic Virus, TuMV)的RNA和編碼該RNA的RNAi載體。
[0006]本發(fā)明提供的一種RNA,具有下述核苷酸序列之一:
[0007]I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的核苷酸序列；
[0008]2)與I)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0009]所述具有相同功能具體指具有下述任一功能:
[0010]I)增強(qiáng)植物對(duì)TuMV的抗性；
[0011]2)增強(qiáng)植物對(duì)草銨膦除草劑的抗性。
[0012]所述植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
[0013]所述TuMV 具體為 TUMV-C4 和 / 或 BJ-ROI。
[0014]所述RNA的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]含有所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]所述重組載體具體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
[0017]所述重組表達(dá)載體為將DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)中得到的；所述DNA片段為X正向一連接區(qū)一X反向；X正向?yàn)镾EQ ID N0.1中第15-467位核苷酸所示，X反向?yàn)閄正向的反向互補(bǔ)片段。
[0018]具體的，所述出發(fā)載體為pBBBast。
[0019]所述的重組表達(dá)載體中，所述X正向一連接區(qū)一X反向片段具有序列表中SEQ IDN2.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
[0020]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述RNA、所述RNA的編碼基因、所述含有所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌的如下至少一種應(yīng)用:
[0021 ] I)制備抗TuMV的產(chǎn)品；
[0022]2)增強(qiáng)植物對(duì)TuMV的抗性；
[0023]3)增強(qiáng)植物對(duì)草銨膦除草劑的抗性。
[0024]所述應(yīng)用中，所述植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
[0025]所述應(yīng)用中，所述TuMV具體為TuMV_C4和/或BJ-ROI。
[0026]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀:1)對(duì)TuMV的抗性增強(qiáng)；2)對(duì)草銨膦除草劑的抗性增強(qiáng)。
[0027]所述方法中，所 述TuMV具體為TuMV-C4和/或BJ-ROl。
[0028]所述方法中，所述目的植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為中間載體的酶切驗(yàn)證結(jié)果，其中M為分子量標(biāo)記；泳道I為pHannibal+HC-Pro-RNAi載體的酶切結(jié)果；泳道2為連入反向片段pHannibal+HC-Pro (-)載體的酶切結(jié)果；泳道3為空pHannibal載體的酶切結(jié)果。
[0030]圖2為載體pBBBTu-HC-Pro的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031]圖3為植物表達(dá)載體pBBBTu-HC-Pro的MluI酶切檢測(cè)結(jié)果圖，其中M為分子量標(biāo)記；泳道I為pBBBTu-HC-Pro載體的酶切結(jié)果。
[0032]圖4為T1代苗噴灑草銨膦除草劑后結(jié)果，存活的為除草劑抗性株。
[0033]圖5為轉(zhuǎn)基因T1代苗PCR鑒定結(jié)果圖，其中M為分子量標(biāo)記；泳道I為陰性對(duì)照col-0的結(jié)果；泳道2-8為除草劑篩選出的轉(zhuǎn)基因T1代苗的結(jié)果。
[0034]圖6為不同轉(zhuǎn)基因高抗株系接種TUMV-C4后的圖片，其中col代表野生型col-0的結(jié)果。
[0035]圖7為不同轉(zhuǎn)基因高抗株系接種TUMV-C4后種子收獲時(shí)的圖片，其中col代表野生型col-0的結(jié)果。
[0036]圖8為轉(zhuǎn)基因高抗株系59接種BJ-R01后的圖片，其中col代表野生型col-0的結(jié)果。
[0037]圖9為高抗株系接種TuMV_C4后的病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中col代表野生型col_0的結(jié)果。
[0038]圖10為TuMV-C4接種擬南芥后，RT-PCR半定量檢測(cè)TuMV基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)，其中M為分子量標(biāo)記；泳道I為H2O對(duì)照組結(jié)果；泳道2-5為轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)果；泳道6為對(duì)照Col-O的結(jié)果。
[0039]圖11為TUMV-C4接種擬南芥后，熒光定量PCR分析結(jié)果，其中col代表野生型col-0的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042]1、材料
[0043]本實(shí)驗(yàn)所用野生型擬南芥Col-O 購(gòu)自 Arabidopsis Biological ResourceCenter0
[0044]北京地區(qū)蕪菁花葉病毒TuMV主要的流行強(qiáng)致病株系TUMV-C4獲自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所；參考文獻(xiàn):馮蘭香、徐玲、劉佳、鈕心格、李秀生，北京地區(qū)大白菜蕪菁花葉病毒株系的鑒定，中國(guó)蔬菜，1988，4:11-13 ;公眾可從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得該株系O
[0045]TuMV蘿卜強(qiáng)致病株系BJ-ROl為發(fā)明人從田間采集并保存。參考文獻(xiàn)“葉艷英、曾鋼、聞曉紅、馬榮才、吳才君、姚磊，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,34(2):264 — 269”。公眾可從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得。
[0046]大腸桿菌(E scherichia coli) DH5 α菌株購(gòu)自Tiangen公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CBlOl ；
[0047]農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacieus) GV3101 (pMP90)，參考文獻(xiàn):Koncz, C.and Schell, J.(1986)The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specificexpression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binaryvector.Mol.Gen.Genet.204, 383 - 396。公眾可從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得。
[0048]RNAi 載體 pHannibal 公眾可從 CSIRO (http:1Iwm.csir0.au/pi)獲得；參考文獻(xiàn):Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A.Construct design forefficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The PlantJournal, 2001，27(6):581-590。
[0049]高保真酶Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分子量標(biāo)記購(gòu)自全式金公司。質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR試劑、限制性內(nèi)切酶和Klenow Fragment購(gòu)自TaKaRa公司。T4連接酶購(gòu)自Promega公司。TRIzol提取液購(gòu)自Invitrogen公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。
[0050]實(shí)施例1、RNAi載體的制備
[0051](一)HC-Pro基因保守片段的制備
[0052]提取TuMV-C4菌株的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板，以下述HC-ProF和HC-Pro R (下劃線部分為酶切位點(diǎn)EcoR1、XbaI和Kpnl、ClaI)為引物，用高保真酶Fastpfu DNA Polymerase 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增:
[0053]HC-Pro F 5， -cggaattctctagaGTTAGCAAGTTACAGGGTGAC_3’ ；[0054]HC-Pro R 5’ -ggggtaccatcgatGACGTGATATCCAGTTGACAGT-3'。
[0055]PCR 擴(kuò)增程序:94 °C 5min ；94°C 45s, 52 °C 30s, 72 °C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸7min。
[0056]PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳純化后回收。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序證明核酸序列正確，其核酸序列具有序列表中SEQ ID N0.1所示的核酸序列，其編碼的RNA的具有序列表中SEQID N0.2所示的核酸序列。
[0057](二)RNAi載體的構(gòu)建
[0058]1、中間載體 pHannibal+HC-Pro-RNAi 的制備
[0059]I)制備過程
[0060]用ClaI和XbaI分別酶切pHannibal載體和上述制備的PCR產(chǎn)物。酶切后經(jīng)純化回收約5800bp的載體骨架片段和約450bp的PCR產(chǎn)物片段，4°C連接過夜。連接產(chǎn)物經(jīng)熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。挑取克隆，提取質(zhì)粒并用XbaI和EcoRI酶切驗(yàn)證，獲得含反向片段的中間載體 pHannibal+HC-Pro (-)。
[0061]用KpnI和EcoRI分別酶切上述制備的PCR產(chǎn)物和連入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)中間載體。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后回收約6200bp載體骨架片段和約470bp的PCR產(chǎn)物片段，4°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取克隆，提取質(zhì)粒并用XbaI和EcoRI雙酶切驗(yàn)證，獲得同時(shí)含反向和正向片段的中間載體pHannibal+HC-Pro-RNAi。
[0062]2)所構(gòu)建載體的酶切驗(yàn)證過程
[0063]用XbaI和EcoRI分別雙酶切pHannibal+HC-Pro-RNA1、連入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)和pHannibal空載體進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。圖1結(jié)果顯示:pHannibal+HC-Pro-RNAi載體被酶切成5001bp、1723bp和6bp的片段；連入反向片段的pHannibal+HC-Pro (-)載體被酶切成5001bp和1264bp的片段；pHannibal空載體被酶切成5001bp和823bp的片段。酶切結(jié)果表明，中間載體pHannibal+HC-Pro-RNAi構(gòu)建正確。
[0064]2、植物表達(dá)載體pBBBTu-HC-Pro的制備
[0065]I)制備過程
[0066]pHannibal的發(fā)卡結(jié)構(gòu)兩端各含有I個(gè)NotI酶切位點(diǎn)。把含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的中間載體pHannibal+HC-Pro-RNAi用NotI酶切，再用Klenow和dGTP在酶切片段的兩個(gè)粘性末端各補(bǔ)兩個(gè)堿基G，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳純化，膠回收含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的3870bp的片段備用。經(jīng)測(cè)序，所述含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的片段具有序列表中SEQ ID N2.3所述的核酸序列。所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)具有序列表中SEQ ID Na.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
[0067]植物表達(dá)雙元載體pBBBast可為將具有序列表中SEQ ID Na.4所示核酸序列的雙鏈DNA分子插入載體pBBRlMCS-2的SspI酶切位點(diǎn)，取代質(zhì)粒pBBRlMCS_2的SspI酶切位點(diǎn)之間的小片段得到的重組質(zhì)粒。
[0068]質(zhì)粒pBBRlMCS-2公眾可以從北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心獲得；參考文獻(xiàn)=KovachME, Elzer PHj Hill DS，Robertson GTj Farris MAj Roop RM 2nd，Peterson KM.Four newderivatives of the broad—host—range cloning vector pBBRlMCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995 Dec I;166(I):175-6。
[0069]用XmaI酶切植物表達(dá)雙元載體pBBBast，再用Klenow在兩個(gè)粘性末端各補(bǔ)兩個(gè)堿基C，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收載體片段6559bp，再與上述制備的含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的3870bp片段連接，即得植物表達(dá)RNAi質(zhì)粒pBBBTu-HC-Pro，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。
[0070]2)所構(gòu)建載體的酶切驗(yàn)證過程
[0071 ] 將上述制備的植物表達(dá)載體pBBBTu-HC-Pro進(jìn)行MluI酶切檢測(cè)。pBBBast載體本身有一個(gè)MluI酶切位點(diǎn)，連接上述含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的片段的CaMV啟動(dòng)子上另有一個(gè)MluI酶切位點(diǎn)，酶切后顯示2條帶的為陽性克隆。因是單酶切位點(diǎn)插入，根據(jù)酶切條帶大小可判斷插入是順時(shí)針正向連接或逆時(shí)針反向連接。正向連接酶切條帶為3935bp和6494bp，反向連接條帶為542bp和9889bp條帶。MluI酶切檢測(cè)結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明針對(duì)HC-Pro基因保守片段的RNAi結(jié)構(gòu)已經(jīng)連入植物表達(dá)雙元載體pBBBast的XmaI酶切位點(diǎn)中，并且為正向連接。
[0072]實(shí)施例2、高抗TuMV的RNA及編碼該RNA的RNAi載體的功能驗(yàn)證
[0073](—)擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性苗的篩選
[0074]利用電擊法將pBBBTu-HC-Pro載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 (pMP90)中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸潰法侵染擬南芥。將收獲的擬南芥Ttl代種子播種于盛有營(yíng)養(yǎng)土的培養(yǎng)托盤中，置于22°C (晝)/18V (夜)，光照周期為16h (光)/8h (暗)的人工氣候室。待幼苗長(zhǎng)出兩片子葉后噴灑用水按體積數(shù)稀釋500倍的草銨膦除草劑(所述草銨膦除草劑為市場(chǎng)購(gòu)買的商品化的除草劑，其中草銨膦濃度為200mg/L)，篩選陽性苗。
[0075]經(jīng)噴灑2-3次草銨膦除草劑篩選后，共獲得60株除草劑抗性植株，篩選的部分抗性株見圖4。將能夠繼續(xù)生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)良好的植株用小量快速法提取植物基因組DNA。用引物 HC-Pro F 和 HC-Pro R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。反應(yīng)條件為:94°C 5min ；94°C 45s, 52°C 30s,72°C 30s，35個(gè)循環(huán)；7 2°C 7min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出目的基因片段481bp的為轉(zhuǎn)基因陽性苗，共有26株為陽性苗。部分幼苗的PCR鑒定結(jié)果見圖5。
[0076]選取鑒定為陽性苗的轉(zhuǎn)基因T1代苗自交留種，T2幼苗噴灑用水按體積數(shù)稀釋500倍草銨膦除草劑(所述草銨膦除草劑為市場(chǎng)購(gòu)買的商品化的除草劑，其中草銨膦濃度為200mg/L)后統(tǒng)計(jì)存活率。有13個(gè)株系符合3:1分離比，初步確定為單拷貝植株，并單株自交留種。后代繼續(xù)篩選至不分離株系即為純合株系。
[0077](二)轉(zhuǎn)基因植株的抗病鑒定
[0078]將13個(gè)單拷貝的純合株系的T3代幼苗、野生型Col-O和轉(zhuǎn)空載體擬南芥同時(shí)進(jìn)行抗病接種鑒定。將T3代幼苗與野生型Col-O播種，待幼苗長(zhǎng)至8-10片蓮座葉時(shí)期摩擦接種TuMV的TuMV-C4或BJ-ROl株系。接種液按病葉重/磷酸緩沖液體積(pH=7.0)約lg/10mL比例配制。每個(gè)株系接種12-16株，每株接種兩片較大葉片。以非轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥Col-O和轉(zhuǎn)空載體擬南芥作為對(duì)照接種。接種幾分鐘后立即用清水沖洗葉片。在人工氣候室中網(wǎng)罩隔離觀察，約20天后進(jìn)行抗病鑒定及病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。病情等級(jí)劃分:0級(jí)完全無癥狀；1級(jí)1-2片未接種葉花葉或發(fā)黃，能抽薹；3級(jí)3-4片未接種葉花葉或發(fā)黃能抽薹；5級(jí)5-6片未接種葉花葉或發(fā)黃,影響抽薹；7級(jí)多數(shù)葉片花葉或發(fā)黃,不能抽薹；9級(jí)大部分葉片枯死，植株瀕臨死亡。
[0079]病情指數(shù)=100 X Σ (各級(jí)病株數(shù)X各級(jí)代表值)/ (調(diào)查總株數(shù)X最高級(jí)代表值)
[0080]抗病接種結(jié)果見圖6、7、8，鑒定結(jié)果見圖9。圖6結(jié)果顯示，接種TuMV-C4后20天左右，對(duì)照野生型Col-O已基本枯萎死亡,轉(zhuǎn)空載體對(duì)照結(jié)果與Col-O基本一致,而轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出不同的抗性，其中4個(gè)株系(12#，14#, 50#, 59#,)表現(xiàn)出較好的長(zhǎng)勢(shì)。高抗株系除部分葉片發(fā)黃外，整株生長(zhǎng)健壯，且能正常抽苔結(jié)實(shí)，表現(xiàn)出對(duì)TuMV-C4的高度抗性。圖7結(jié)果顯示，到種子收獲時(shí)期接種TUMV-C4的高抗轉(zhuǎn)基因株系可以正常結(jié)籽；而對(duì)照Col-O的植株已經(jīng)全部死亡，無種子可收獲。圖9結(jié)果顯示，接種TUMV-C4后，病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示高抗株系的抗病性比對(duì)照提高約80%，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照結(jié)果與Col-O基本一致。
[0081]高抗轉(zhuǎn)基因株系59#接種BJ-ROl后，圖8結(jié)果顯示，對(duì)照野生型Col-O發(fā)病顯癥，而高抗轉(zhuǎn)基因株系59#表現(xiàn)出較好的長(zhǎng)勢(shì)，其對(duì)BJ-ROl同樣具有高度的抗性。說明本發(fā)明對(duì)TuMV不同株系的抗性具有一定的廣譜性。
[0082]高抗轉(zhuǎn)基因株系留種，后代繼續(xù)進(jìn)行抗病鑒定。結(jié)果顯示這些轉(zhuǎn)基因株系對(duì)TuMV的高抗性可以穩(wěn)定遺傳。
[0083](三)半定量和相對(duì)定量檢測(cè)病毒的累積
[0084]4個(gè)高抗株系12# ，14#, 50#, 59#接種TuMV_C4后約15天，選取各株系未接種葉片分別提取總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)成cDNA。分別以TuMV-CP的196bp片段為檢測(cè)對(duì)象，以擬南芥SAND基因(AT2G28390)的298bp片段為內(nèi)參進(jìn)行半定量和熒光定量分析。
[0085]擴(kuò)增TuMV-CP基因的196bp保守區(qū)段的引物序列如下所示:
[0086]CP F 5，-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3，；
[0087]CPR 5， -TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3’ 。
[0088]擴(kuò)增內(nèi)參基因SAND基因298bp片段的引物序列如下所示，上游引物跨過內(nèi)含子(一條下劃線是外顯子a，兩條下劃線是外顯子b)，以避免因基因組DNA污染所造成的影響:
[0089]SAND F 5，- MGGCAGGAMTCACCAGGTTGTC -3:
[0090]SANDR 5’-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3’ 。
[0091]RT-PCR 反應(yīng)程序:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0092]熒光定量PCR的反應(yīng)以稀釋40倍的cDNA為模板，SYBR-green I做熒光指示劑，反應(yīng)程序采用兩步法擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95°C 30s ；95°C 5s, 57°C 30s, 72°C 30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)株系樣品進(jìn)行3次重復(fù)，取平均值。
[0093]半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見圖10。圖10結(jié)果顯示，在內(nèi)參基因表達(dá)量差不多一致的情況下，對(duì)照Col-O植株體內(nèi)能檢測(cè)到大量的病毒累積，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照結(jié)果與Col-O基本一致，而在高抗轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)只能檢測(cè)到微量的病毒。
[0094]熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果見圖11。圖11結(jié)果顯示，與半定量的結(jié)果一致，在對(duì)照Col-O體內(nèi)檢測(cè)到大量的病毒，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照結(jié)果與Col-O基本一致，而4個(gè)高抗株系植物體內(nèi)幾乎檢測(cè)不到病毒的復(fù)制。說明構(gòu)建的RNAi載體在抗病毒中發(fā)揮了作用，轉(zhuǎn)基因植株的抗病性顯著提高。
【權(quán)利要求】
1.一種RNA,具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的核苷酸序列； 2)與I)限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
2.權(quán)利要求1所述的RNA的編碼基因。
3.含有權(quán)利要求2所述的編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌；所述重組載體具體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為將DNA片段插入出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)中得到的；所述DNA片段為X正向一連接區(qū)一X反向；X正向?yàn)镾EQ ID N0.1中第15-467位核苷酸所示，X反向?yàn)閄正向的反向互補(bǔ)片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述X正向一連接區(qū)一X反向片段具有序列表中SEQ ID Na.3中第1371-3087位核苷酸所示的序列。
6.權(quán)利要求1所述的RNA、權(quán)利要求2所述的編碼基因、權(quán)利要求3-5任一所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌的如下至少一種應(yīng)用: O制備抗TuMV的產(chǎn)品； 2)增強(qiáng)植物對(duì)TuMV的抗性； 3)增強(qiáng)植物對(duì)草銨膦除草劑的抗性`。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，具有如下至少一種性狀:1)對(duì)TuMV的抗性增強(qiáng)；2)對(duì)草銨膦除草劑的抗性增強(qiáng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述目的植物具體為擬南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具體為油菜或白菜。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103451197SQ201310397713
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】姚磊, 葉艷英, 曾鋼, 曹鳴慶, 馬榮才 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心