一種重組菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種重組菌，是含有mTFP-ftsZ的重組節(jié)桿菌Arthrobactersp.A3，mTFP-ftsZ的基因序列如序列表中SEQIDNo.1所示。本發(fā)明還提供一種快速檢測(cè)抑制與FtsZ相關(guān)的抗生素的方法，是將待測(cè)化合物接入節(jié)桿菌，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前中期后，對(duì)新生細(xì)胞壁進(jìn)行熒光標(biāo)記，與空白對(duì)照對(duì)比，觀察新生細(xì)胞壁環(huán)的定位情況與比例，若新生細(xì)胞壁環(huán)形成或比例發(fā)生改變，則該待測(cè)化合物具有抑制FtsZ相關(guān)抗生素的能力。本發(fā)明提供的方法可以一次檢測(cè)一個(gè)發(fā)酵產(chǎn)物或者多種化學(xué)衍生物中是否有抑制ftsZ活性物質(zhì)，具有操作簡(jiǎn)單，效率高，僅需2個(gè)小時(shí)就可以得到確定的結(jié)果，具有很好的推廣使用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種重組菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自從1928年人類(lèi)首次發(fā)現(xiàn)抗生素一青霉素以來(lái)，在這幾十年中，抗生素工業(yè)飛速發(fā)展，為人類(lèi)的身體健康做出了巨大的貢獻(xiàn)。但由于人們不合理的使用抗生素，尤其是我國(guó)，抗生素耐藥性的問(wèn)題逐漸爆發(fā)出來(lái)。解決這一問(wèn)題，除了注意抗生素的合理使用外，開(kāi)發(fā)新的對(duì)耐藥性病菌有抑制活性的新抗生素也是非常重要的。
[0003]目前，研究新的抗生素主要有以下兩種方法，一是對(duì)現(xiàn)有的抗菌藥進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)改造，它們作用于細(xì)菌靶位點(diǎn)包括細(xì)菌蛋白質(zhì)合成、核酸合成、細(xì)胞壁合成以及葉酸合成等；另一種方法是尋找具有全新靶位點(diǎn)或者具有全新化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物。
[0004]大多數(shù)細(xì)菌都以二分裂方式進(jìn)行分裂繁殖。在細(xì)菌細(xì)胞正常分裂時(shí)，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁在細(xì)菌中部?jī)?nèi)陷并在兩個(gè)新復(fù)制的染色體間形成環(huán)狀復(fù)合物，膜結(jié)構(gòu)的肽聚糖隨后水解將細(xì)胞一份為二(Harry et al.，2006)。在這一過(guò)程中，細(xì)胞分裂蛋白FtsZ在GTP的參與下最早在細(xì)胞中部聚合成環(huán)狀骨架Z環(huán)，再與其他相關(guān)蛋白結(jié)合，從而引發(fā)并控制原核生物的細(xì)胞分裂過(guò)程(Beuria et al.，2009)。Z環(huán)位于細(xì)胞分裂處胞膜的內(nèi)表面，受到多種調(diào)控水平的調(diào)控，同時(shí)標(biāo)志著將來(lái)分裂的位置(Huang et al.，2007)。 [0005]FtsZ是最保守的細(xì)菌分裂蛋白，幾乎存在于所有的細(xì)菌中。它由Rossmann折疊形成的N-端GTP酶區(qū)域和分支酸變位酶折疊的C-端GTP酶激活區(qū)域通過(guò)中心的螺旋H7和環(huán)?相連接(Lowe and Amos, 1998)。FtsZ是人類(lèi)微管蛋白的結(jié)構(gòu)相似物,有證據(jù)表明這兩種蛋白在進(jìn)化上具有相關(guān)性，不過(guò)只有10%_18%蛋白質(zhì)序列相似(Ayaz et al.，2012; dePereda et al.，1996)。人類(lèi)微管蛋白已經(jīng)是用于抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)成熟祀點(diǎn)。然而，經(jīng)典的微管蛋白抑制劑如nocodazole和paclitaxel等不能顯著抑制FtsZ聚合或GTP酶的活性(Wang et al.，2003)。這表明，F(xiàn)tsZ和微管蛋白在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能等方面存在很大差異，有可能設(shè)計(jì)出選擇性抑制FtsZ而不抑制人類(lèi)微管蛋白的化合物。同時(shí)FtsZ和人類(lèi)微管蛋白的同源性也為設(shè)計(jì)選擇性抑制劑提供了有一個(gè)很好的切入點(diǎn)?；贔tsZ蛋白在細(xì)菌細(xì)胞分裂的重要作用，人們希望以它為靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)新型抗菌藥物。
[0006]隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及近期發(fā)展的細(xì)胞生物技術(shù)在細(xì)菌研究上的應(yīng)用，對(duì)于全新抗菌藥作用靶位點(diǎn)的研究取得了重要進(jìn)展。細(xì)胞分裂是細(xì)菌繁殖的基本過(guò)程，其中關(guān)鍵蛋白FtsZ作為一個(gè)具有潛力的藥物作用全新靶點(diǎn)，已有用于研發(fā)新型抗菌藥物的報(bào)道(Lock and Harry, 2008)。
[0007]現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種對(duì)FtsZ蛋白有抑制作用的化合物。見(jiàn)表l(Foss et al.,2011)。很多抑制劑的篩選都花了很多人力物力。如Zantrin Zl是Margalit等人在篩選18320個(gè)化合物鑒定出的23個(gè)化合物對(duì)FtsZ蛋白的GTP酶有活性的化合物(Margalit etal.，2004)。PC170942的篩選范圍更大，Stokes等人在篩選105000個(gè)化合物后發(fā)現(xiàn)了活性物質(zhì) PC58538，然后再經(jīng)改造得來(lái)(Kaur et al., 2010; Rai et al., 2008)。A189 是通過(guò)對(duì)95000個(gè)化合物篩選得到的4種對(duì)FtsZ蛋白GTP酶有活性的化合物之一(Ito etal., 2006; Stokes et al., 2005)。
[0008]表1 FtsZ抑制劑
【權(quán)利要求】
1.一種重組菌,是含有《TF/h/tsZ的重組節(jié)桿菌AriAroAacier sp.k?>,積訪(fǎng)jnTFP-ftsZ的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所不。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于:所述《TF/hftsZ是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入節(jié)桿菌AriAroAacier sp.A3中，得到重組節(jié)桿菌AriAroAacier sp.A30
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為PART2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于:所述導(dǎo)入的方法為電擊導(dǎo)入，電擊條件為:2500V/cm，25 μ F，700 Ω，200 μ I感受態(tài)細(xì)胞，I μ I重組質(zhì)粒，電擊后用LB培養(yǎng)基+0.5Μ山梨醇800 μ I孵育6-8h。
5.一種重組蛋白，其編碼蛋白序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。
6.一種快速檢測(cè)抑制FtsZ相關(guān)抗生素的方法，是將待測(cè)化合物接入權(quán)利要求1-4所述的重組菌，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前中期后，對(duì)新生細(xì)胞壁進(jìn)行熒光標(biāo)記，與空白對(duì)照對(duì)比，觀察新生細(xì)胞壁環(huán)的定位情況與比例，若新生細(xì)胞壁環(huán)形成或比例發(fā)生改變，則該待測(cè)化合物具有抑制FtsZ相關(guān)抗生素的能力。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:是用萬(wàn)古霉素和Van-Flu進(jìn)行熒光標(biāo)記的。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:是用萬(wàn)古霉素、Van-Flu和DAPI進(jìn)行熒光標(biāo)記的。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述的方法，其特征在于:所述待測(cè)化合物為一個(gè)或多個(gè)。
10.權(quán)利要求1-4所述的重組菌在快速檢測(cè)抑制FtsZ相關(guān)抗生素中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103540560SQ201310375563
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月26日
【發(fā)明者】陳熙明, 張昺林, 張威, 張滿(mǎn)效, 陳拓, 劉光琇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所