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雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選方法

文檔序號:514344閱讀:227來源:國知局
雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選方法,該方法包括:S101,選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官;S102,分別從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA,得到雌花總RNA和雄花總RNA;S103,根據(jù)提取出總RNA建立cDNA;S104,對建立的cDNA文庫進行測序;S105,根據(jù)測序結果及microRNA評估標準,判斷雌花和雌花cDNA文庫所對應的microRNA種類及數(shù)量;以及S106,根據(jù)microRNA種類及數(shù)量,篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達的microRNA。本發(fā)明的方法快速高效,易于自動化,具有實用價值和廣泛的應用前景。
【專利說明】雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選 方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳學研究領域,該發(fā)明公開了一種篩選雌雄異株植物中雌雄花器官 差異表達的microRNA的篩選方法。

【背景技術】
[0002] DNA測序技術是現(xiàn)在基因組學最重要的實驗技術,在整個生物學領域具有廣泛的 應用。1977年Sanger發(fā)明的末端終止測序法對于基因組測序研究具有里程碑意義。Sanger 法簡便快速,經過改良后成為DNA測序研究的主要方法。隨著基因組科學的發(fā)展,傳統(tǒng)的 Sanger測序方法已經不能滿足科學研究的需要。為滿足這些研究需求,第二代高通量測序 技術迅速發(fā)展。第二代高通量測序技術的基因原理是邊合成邊測序,即通過捕捉新合成的 末端標記來確定DNA序列。在Sanger測序方法的基礎上,利用不同顏色的突光標記四種 dNTP,當DNA聚合酶合成互補鏈時,每添加一種dNTP就會釋放出不同的熒光,根據(jù)捕捉的熒 光信號并經過特定的計算機軟件處理,從而獲得待測DNA的序列信息。
[0003] 由于第二代測序技術是對序列邊合成邊測序,利用該技術進行轉錄組分析時要求 樣品要具有相同的基因型,否則將會產生誤差。所以對于雌雄異株植物(楊樹、柳樹、菠菜、 大麻、銀杏、鐵樹、櫻桃等),由于其在生長發(fā)育、生理應答以及基因表達等多方面具有顯著 差異,因此很難將第二代測序技術應用到雌雄異株植物的篩選工作中。
[0004] 另外,人們還發(fā)現(xiàn)在雌雄異株植物中最為顯著的差異是具有生長發(fā)育迥異的雌雄 花器官,而microRNA (簡寫為miRNA)對于植物生長發(fā)育具有重要的調節(jié)作用,因此如果能 夠通過篩選雌雄花器官差異或特異表達的microRNA,就可以對楊樹性別決定機制進行深入 的研究。但是由于雌雄異株植物的基因型效應的影響,雌雄花器官差異表達microRNA的工 作迄今為止還未找到合適的開展方式。


【發(fā)明內容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術無法篩選出雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA 的問題,本發(fā)明提供了一種雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選方法, 該方法包括:
[0006] S101,選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官;
[0007] S102,分別從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA,得到雌花總RNA和雄花總 RNA ;
[0008] S103,根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA文庫,根據(jù)提取出的雄花總RNA建 立雄花cDNA文庫;
[0009] S104,分別對雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫進行測序;
[0010] S105,根據(jù)測序結果及microRNA評估標準,判斷雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對應的microRNA種類及數(shù)量;以及
[0011] S106,根據(jù)microRNA種類及數(shù)量,篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達的 microRNAo
[0012] 優(yōu)選地,在步驟SlOl中,相同基因型的雌性花器官和雄性花器官是通過從雌雄異 株植物的雄全同株個體或者雌全同株個體產生的兩性花器官中分離得到的。并且,更優(yōu)選 地,兩性花器官的分離是在超低溫條件下實施的。
[0013] 優(yōu)選地,本發(fā)明是通過CTAB法從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA的。更 優(yōu)選地,采用的CTAB法包括:S1021,取雌性花器官或雄性花器官加上等量的聚丙烯吡咯烷 酮,液氮研磨,收集到離心管中;S1022,將預熱的CTAB提取液以及β -巰基乙醇加入所述 離心管中,混勻,65°C水浴;S1023,加入氯仿和異戊醇,混勻抽提,在4°C下離心分離,取上 清液,加入1/3至1/5體積的12M Licl,在4°C下沉淀;S1024,在4°C下繼續(xù)離心分離,棄上 清液,加入緩沖液溶解沉淀,將溶解RNA后的緩沖液轉移到另一離心管中;S1025,加入氯仿 和異戊醇,混勻抽提,在4°C下離心,取上清液,重復抽提多次;S1026,取所述S1025得到的 上清液,加入1/10體積的3M NaAC與2. 5倍體積的無水乙醇,混勻后,-20°C靜置沉淀RNA, 在4°C下離心,棄上清液,收集沉淀物;S1027,將步驟S1026得到的沉淀物溶于RNase-free 水中,并利用DNA消化酶去除DNA,在37°C溫度下水浴,加入等體積的氯仿和異戊醇,混勻后 離心分離;S1028,將步驟S1027得到的上清液分裝到I. 5ml的離心管中,然后加入無水乙醇 和NaAC,混勻后,-20°C靜置并沉淀,在4°C下離心分離,棄上清液,收集沉淀物,分離得到總 RNA。
[0014] 優(yōu)選地,在步驟S1021中,雌性花器官或雄性花器官的用量為0. lg,在步驟S1023 中,12M Licl的加入量為上清液總體積的1/5。
[0015] 優(yōu)選地,在步驟S1028之后,進一步包括步驟S1029 :以RNsae - free水為空白對 照,使用分光光度計分別測定各RNA樣品的A230、A260與A280值,判定RNA樣品的純度并 計算其總量;通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
[0016] 在本發(fā)明提供的篩選方法中,優(yōu)選地,上述步驟S103,根據(jù)提取出的雌花(雄花) 總RNA建立雌花(胸花)cDNA文庫的方法包括:S1031,純化所述雌花總RNA或雄花總RNA ; S1032,收集小于30bp的small RNA片段,并經過T4RNA連接酶加上人工接口;S1033,將步 驟S1032處理后的RNA片段反轉錄成cDNA ;S1034,對所述cDNA進行PCR擴增,得到雌花 cDNA文庫或雄花cDNA文庫。
[0017] 在本發(fā)明提供的篩選方法中,優(yōu)選地,所指雌雄異株植物為楊樹。
[0018] 由上述技術方案可以看出,本發(fā)明提供的技術方案克服了雌雄異株植物基因型對 差異表達microRNA篩選的影響,可以精準的篩選在雌雄花器官之間差異表達的microRNA, 而且該方法充分利用了第二代高通量測序技術,對差異表達microRNA進行高通量的篩選。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 構成本申請的一部分的附圖用來提供對本申請的進一步理解,本申請的示意性實 施例及其說明用于解釋本發(fā)明,并不構成對本申請的不當限定。在附圖中:
[0020] 圖1示出了本發(fā)明所提供的雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA篩 選方法流程示意圖;
[0021] 圖2示出了采用改良前后的CTAB方法提取出去的RNA的電泳對比圖;其中,A為 采用現(xiàn)有CTAB方法提取出的RNA的電泳圖,B為采用改良后CTAB方法提取出的RNA的電 泳圖;
[0022] 圖3示出了毛白楊雄全同株個體和雌全同株個體產生的混合性別花器官的電鏡 掃描圖;
[0023] 圖4示出了預測的部分非保守microRNA結構示意圖。

【具體實施方式】
[0024] 下面將結合本申請的【具體實施方式】,對本申請的技術方案進行詳細的說明,但如 下實施例僅是用以理解本申請,而不能限制本申請,本申請中的實施例及實施例中的特征 可以相互組合,本申請可以由權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。
[0025] 為了解決現(xiàn)有技術存在的無法篩選出雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達 的microRNA的問題,本發(fā)明針對楊樹雌雄異株植物基因型效應對雌雄花器官差異表達 microRNA篩選的影響,提供了一種基于新的研究策略而形成的新的篩選方法,該方法包括 以下步驟:
[0026] S101,選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官;
[0027] S102,分別從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA,得到雌花總RNA和雄花總 RNA ;
[0028] S103,根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA文庫,根據(jù)提取出的雄花總RNA建 立雄花cDNA文庫;
[0029] S104,分別對雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫進行測序;
[0030] S105,根據(jù)測序結果及microRNA評估標準,判斷雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對應的microRNA種類及數(shù)量;以及
[0031] S106,根據(jù)microRNA的種類及數(shù)量,篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達的 microRNA〇
[0032] 通過以上步驟可以看出,因為選取了具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器 官,從而避免了基因型效應對于雌雄花器官差異表達microRNA篩選的影響,為后續(xù)的高通 量篩選雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA提供了重要的技術支持。
[0033] 下面我們將結合圖1根據(jù)本發(fā)明所提供的技術方案,逐步解釋每一個步驟的具體 實施過程。
[0034] 關于步驟S101,其目的在于通過選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器 官,從而避免了基因型效應對于雌雄花器官差異表達的microRNA篩選的影響。具體而言, 本發(fā)明的發(fā)明人利用雌雄異株植物的雄全同株個體或者雌全同株個體產生的兩性花器官 獲得了具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官,該類型的雌性花器官和雄性花器官因 為產生自同一個體,因此具有相同的基因型。由于通常雄全同株個體或者雌全同株個體非 常罕見,可用于RNA提取的樣本量較少。因此,為了保證RNA不被降解,在本發(fā)明提供的 具體實施例中,對兩性花器官的分離是在超低溫下進行的,例如,在液氮環(huán)境(_196°C)中, 可利用槍型鑷和解剖針將兩性花器官分離,由于在低溫下植物材料易碎,整個過程需要緩 慢仔細進行,以防止植物材料破碎。
[0035] 關于步驟S102,從雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA,得到雌花總RNA和雄花 總RNA。此步驟的目的在于得到雌花總RNA和雄花總RNA,以便分析差異化表達的mircoRNA。 在現(xiàn)有技術中,提取植物中總RNA的方法有很多種,本發(fā)明并不限制提取RNA的方法。在本 發(fā)明的【具體實施方式】中采用CTAB法對雄性花器官和雌性花器官進行總RNA的提取。這里 所指的CTAB法是指利用CTAB進行RNA提取的方法,CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀 核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>〇.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多 聚糖形成復合物,只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白、多糖、酚類等雜質后 加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。本發(fā)明可采用傳統(tǒng)的CTAB方法進行RNA提取,也可以 采用改良后的CTAB方法提取RNA。
[0036] 常規(guī)的CTAB方法可包括如下實施步驟:取雌性花器官或雄性花器官兩克,液氮 中研磨成細粉末;加入10ml65°C預熱的CTAB提取液和500 μ 1 β -巰基乙醇,劇烈渦旋勻 漿,65°C水浴溫育30min ;每管加入IOml氯仿異戊醇(24 :1),渦旋混勻,冰浴lOmin。4°C, 12000rpm離心lOmin。取上清,加入I / 3體積的8M LiCl和500μ1β-乙醇,-20°C沉 淀過夜;4 °C,12000rpm離心20min。棄上清,沉淀用4ml異硫氰酸胍變性液溶解,加入 120 μ 1 β -巰基乙醇和880 μ 12M Na Ac (pH4. 0),混勻后加入5ml的酚:氯仿:異戊醇(25 : 24:1),潤旋混勻,冰浴5min。4°C,12000rpm離心10min。取上清,加入等體積酚:氯仿:異 戊醇(25 :24:1),潤旋混勻,冰浴5111;[11。41€,12000印1]1離心1〇111;[11。取上清,加入等體積氯 仿:異戊醇(24:1),潤旋混勻,冰浴5min。4°C,12000rpm離心10min。取上清,加入1 / 10 體積的31似40(?冊.2)和2.5倍體積的無水乙醇,-201:放置過夜。41:,14000印111。加入 100以18似86-仕66-(1(1!120溶解沉淀。取1(^1稀釋200倍檢測淠入230、260、280下的(? 值,檢測RNA樣品的純度與濃度。
[0037] 本發(fā)明提供的改良后的CTAB法的具體流程為:S1021,取雌性花器官或雄性花器 官加上等量的聚丙烯吡咯烷酮,液氮研磨,收集到離心管中;S1022,將預熱的CTAB提取液 以及β -巰基乙醇加入所述離心管中,混勻,65°C水??;S1023,加入氯仿和異戊醇,混勻抽 提,在4°C下離心分離,取上清液,加入1/3至1/5體積的12M Licl,在4°C下沉淀;S1024,在 4°C下繼續(xù)離心分離,棄上清液,加入緩沖液溶解沉淀,將溶解RNA后的緩沖液轉移到另一 離心管中;S1025,加入氯仿和異戊醇,混勻抽提,在4°C下離心,取上清液,重復抽提多次; S1026,取所述S1025得到的所述上清液,加入1/10體積的3M NaAC與2. 5倍體積的無水乙 醇,混勻后,_20°C靜置沉淀RNA,在4°C下離心,棄上清液,收集沉淀物;S1027,將步驟S1026 得到的所述沉淀物溶于RNase-free水中,并利用DNA消化酶去除DNA,在37°C溫度下水浴, 加入等體積的氯仿和異戊醇,混勻后離心分離;S1028,將步驟S1027得到的所述上清液分 裝到1.5ml的離心管中,然后加入無水乙醇和NaAC,混勻后,-20°C靜置并沉淀,在4°C下離 心分離,棄上清液,收集沉淀物,分離得到總RNA。通過實施上述提取過程,就可將雌性花器 官和雄性花器官中的總RNA提取出來。這種改良的CTAB方法與傳統(tǒng)方法相比,在抽提步驟 中,減少了等體積苯酚:氯仿:異戊醇抽提這一步驟,不但精簡了試驗步驟,還取得了很好 的提取效果。另外,在步驟S1023中,優(yōu)選加入Licl的濃度為12M,加入量為上清液總體積 的1/5體積,與傳統(tǒng)方法相比,改變了 LiCL的濃度和用量。通過以上步驟的改良,使得本發(fā) 明提供的CTAB方法具有所需組織量小,適用于微量組織取樣,有利于提高轉錄分析的精準 性的優(yōu)點;將采用傳統(tǒng)CTAB方法提取出的總RAN與采用改良后CTAB法提取的總RAN的電 泳圖片(如圖2所示)可以看出,采用改良后CTAB方法提取得到的RNA片段完整,無拖尾現(xiàn) 象,說明該方法提取的精準性更好,純度更高。
[0038] 完成上述步驟后,可進一步對得到的總RNA進行測試和計算,具體可以 RNsae-free水為空白對照,使用分光光度計分別測定各RNA樣品的A230、A260與A280值, 判定RNA樣品的純度并計算其總量,然后通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
[0039] 關于S103,完成總RAN的提取后,就可以根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA 文庫,根據(jù)提取出的雄花總RNA建立雄花cDNA文庫了;根據(jù)RNA建立cDNA文庫的方法已經 為常規(guī)技術方法,在本發(fā)明的【具體實施方式】中,構建cDNA文庫的具體方法包括:S1031,純 化雌花總RNA或雄花總RNA,可采用15%PAGE電泳分離的方法進行RNA的純化工作;S1032, 收集小于30bp的small RNA片段,并經過T4RNA連接酶加上人工接頭,該步驟需要加上一致 序列的人工接頭,其目的在于為接下來邊合成邊測序過程所需要的引物提供序列信息。,因 為該人工接頭方式為第二代高通量測序技術的常規(guī)技術手段,在此就不再贅述;S1033,將 步驟S1032處理后的RNA片段反轉錄成cDNA,具體而言可采用Super-Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)方法實施逆轉錄;S1034,對 cDNA 進行 PCR 擴增,就可以得到雌花cDNA文庫和雄花cDNA文庫了。
[0040] 關于S104,對雌花CDNA文庫和雌花CDNA文庫進行測序;該測序方法為常規(guī)測序 方法,【具體實施方式】為現(xiàn)有技術,在此將不再贅述。
[0041] 關于S105,根據(jù)測序結果及microRNA評估標準,判斷雌花cDNA文庫和雌花cDNA 文庫所對應的microRNA種類及數(shù)量。具體而言,包括:
[0042] 第一,可根據(jù)測序reads數(shù)量估算microRNA表達量;
[0043] 第二,可根據(jù)miRNA評判標準(Meyers等,2008)對非保守miRNA進行鑒定。鑒定 具體標準如下:
[0044] UmiRNA前體序列的二級結構為典型的莖環(huán)發(fā)卡結構;
[0045] 2、莖環(huán)發(fā)卡結構中的堿基錯配數(shù)蘭4nt ;
[0046] 3、miRNA成熟序列中間的莖環(huán)結構不能超過2個,并且單個莖環(huán)內部堿基數(shù)不能 大于2個;
[0047] 4、miRNA*序列結構同樣遵循第2,第3條標準;
[0048] 5、miRNA的環(huán)臂長度在10至IOOnt之間;
[0049] 6、整個前體長度在幾十到300nt之間;
[0050] 7、miRNA成熟序列長度在20-23nt之間;
[0051] 8、自由能(MFE)小于 _20kcal/mol。
[0052] 上述非保守miRNA的評判標準具體出處為Meyers2008年論文:Criteria for annotation of plant MicroRNAs. Plant Cell, 200820(12) :3186-3190.非保守miRNA判斷 可使用 Mireap 軟件(http://sourceforge. net/projects/mireap/)進行篩選;
[0053] 第三,保守miRNA則是通過對上述miRNA候選序列對判別分析之后,與mirbase數(shù) 據(jù)庫19. 0進行BLAST就可以篩選得到保守miRNA序列。mirbase數(shù)據(jù)庫19. 0是公開數(shù)據(jù) 庫,可通過WWW. mirbase. org網址免費使用。
[0054] 根據(jù)上述具體判斷步驟,篩選人員就可以判斷出雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對應的microRNA種類及數(shù)量。
[0055] 因此,根據(jù)步驟S105結果,可實施步驟S106。即根據(jù)microRNA的種類及數(shù)量,篩 選出雌性花器官與雄性花器官差異表達的microRNA。進而根據(jù)所得差異表達的microRNA, 可進行雌雄異株中雌雄花器官差異表達分析,預測microRNA作用的靶基因以及性別特異 遺傳標記開發(fā)等后續(xù)研究。
[0056] 以下將以楊樹的雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選過程為例,進一步說明 本發(fā)明所提供的篩選方法。
[0057] 實施例1
[0058] 原料的獲得:毛白楊雄全同株個體(Populus tomentosa '2-14')來源于全國毛白 楊種質資源庫;
[0059] CTAB法中采用的各種試劑均為市售產品;
[0060] 采用Mireap軟件系統(tǒng)進行microRNA評估。
[0061] 具體操作步驟如下:
[0062] 步驟S101,選擇毛白楊雄全同株個體(Populus tomentosa '2-14')產生的混合 性別的花序。圖3示出了該雄全同株個體產生的混合性別的花器官的電鏡掃描圖。這兩幅 圖都是兩性花器官,左邊的是雄全同株,右邊的是雌全同株。Pi代表Pistil (雌蕊),St代 表Staman(雄蕊),為了保證RNA不被降解,對兩性花器官的分離是在液氮環(huán)境(_196°C) 中進行的,利用槍型鑷和解剖針將兩性花器官分離,由于在低溫下植物材料易碎,整個過 程需要緩慢仔細進行,以防止植物材料破碎。
[0063] 步驟S102,利用改良的CTAB法對微量的花序樣品的總RNA進行提取。具體方法 如下:
[0064] 步驟S1021,在0. Ig左右的植物組織加上等量PVPP(聚丙烯吡咯烷酮),液氮研磨, 收集50ml離心管中;
[0065] 步驟 S1022,加入 15ml (W:V=1:5)65°C預熱的 CTAB 提取液(CTAB2%,PVP4%,EDTA2 5mM, Nacl2. OmM, Tris-HCllOOmM, ρΗ8· 0),并加入 300 μ L β -巰基乙醇,渦旋混勻,65°C水浴 IOmin;
[0066] 步驟S1023,加入等體積的氯仿:異戊醇(V :V=24:1),輕輕混勻抽提 IOmin, 4°C 12000rpm 離心 10min。取上清液,加入 1/5 體積的 12MLicl, 4°C沉淀 2h;
[0067] 步驟S1024,在4°C 12000rpm離心20min。棄上清液,加入800 μ LSSTE緩沖液溶 解沉淀。將溶解RNA后的緩沖液轉移到2ml離心管中;
[0068] 步驟S1025,加入等體積氯仿:異戊醇,輕輕混勻抽提5min,4°C 12000rpm離心 10min。取上清液,重復抽提2次;
[0069] 步驟S1026,取上清液,加入1/10體積的3M NaAC(ρΗ5· 2)與2. 5倍體積的無水乙 醇,混勻后,_20°C靜置2h沉淀RNA。4°C 12000rpm離心20min,棄上清液,收集沉淀;
[0070] 步驟S1027,利用DNA消化酶去除DNA(溶于水的RNAl μ g,IOXDNase反應緩沖液 10 μ L,DNaselO μ L,RNase-free 水補至 50 μ L) 37°C水浴 30min。加入等體積的 24:1 (氯 仿:異戊醇)上下顛倒混勻后12000轉10min,離心;
[0071] 步驟S1028,將上清液分裝到I. 5ml的離心管中,然后加入3倍體積的無水乙醇和 1/3 體積的 10mol/L 的 NaAC,混勻后,-20°C靜置 2h 沉淀 RNA。4°C 12000rpm 離心 20min,棄 上清液,收集沉淀,得到總RNA提取物。
[0072] 最后可以檢測以下提取得到RNA的純度、總量和完整性,具體而言,以RNsae-free 水為空白對照,使用分光光度計分別測定各RNA樣品的A230、A260與A280值,判定RNA樣 品的純度并計算其總量。通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
[0073] 然后實施步驟S103,根據(jù)提取出的雌花總RNA建立雌花cDNA文庫,根據(jù)提取出的 雄花總RNA建立雄花cDNA文庫。將總RNA經15%PAGE電泳分離純化后,切割回收小于30bp 的small RNA片段,然后經過T4RNA連接酶加上人工接口,再經Super-Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)反轉錄成 cDNA,最后 PCR 擴增,回收 cDNA 文庫。
[0074] 實施步驟S104,將cDNA文庫送至上海伯豪生物技術有限公司進行測序。
[0075] 實施步驟S105,根據(jù)測序結果及microRNA評估標準,判斷雌花cDNA文庫和雌花 cDNA文庫所對應的microRNA種類及數(shù)量。
[0076] 根據(jù)reads數(shù)估算microRNA表達量,根據(jù)植物非保守microRNA評判標準進行保 守RNA和非保守RNA的預測。具體結果如表1至表4所示:
[0077] 表1雄全同株毛白楊雌雄花器官差異表達保守miRNA
[0078]

【權利要求】
1. 一種雌雄異株植物中雌雄花器官差異表達的microRNA的篩選方法,其特征在于,所 述方法包括: S101,選取具有相同基因型的雌性花器官和雄性花器官; S102,分別從所述雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA,得到雌花總RNA和雄花總 RNA ; S103,根據(jù)提取出的所述雌花總RNA建立雌花cDNA文庫,根據(jù)提取出的所述雄花總RNA 建立雄花cDNA文庫; 5104, 分別對所述雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫進行測序; 5105, 根據(jù)測序結果及microRNA評估標準,判斷所述雌花cDNA文庫和雌花cDNA文庫 所對應的microRNA種類及數(shù)量;以及 5106, 根據(jù)microRNA種類及數(shù)量,篩選出雌性花器官與雄性花器官差異表達的 microRNA。
2. 根據(jù)權利要求1所述的篩選方法,其特征在于,在所述步驟S101中,所述相同基因型 的雌性花器官和雄性花器官是通過從雌雄異株植物的雄全同株個體或者雌全同株個體產 生的兩性花器官中分離得到的。
3. 根據(jù)權利要求2所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟S101是在超低溫條件下實 施的。
4. 根據(jù)權利要求1所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟S102中采用CTAB法從所述 雌性花器官和雄性花器官中提取總RNA。
5. 根據(jù)權利要求4所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟S102采用的CTAB法包括: S1021,取雌性花器官或雄性花器官加上等量的聚丙烯吡咯烷酮,液氮研磨,收集到離 心管中; 51022, 將預熱的CTAB提取液以及β -巰基乙醇加入所述離心管中,混勻,65°C水??; 51023, 加入氯仿和異戊醇,混勻抽提,在4°C下離心分離,取上清液,加入1/3至1/5體 積的12M Licl,在4°C下沉淀; 51024, 在4°C下繼續(xù)離心分離,棄上清液,加入緩沖液溶解沉淀,將溶解RNA后的緩沖 液轉移到另一離心管中; 51025, 加入氯仿和異戊醇,混勻抽提,在4°C下離心,取上清液,重復抽提多次; 51026, 取所述S1025得到的所述上清液,加入1/10體積的3M NaAC與2. 5倍體積的無 水乙醇,混勻后,-20°C靜置沉淀RNA,在4°C下離心,棄上清液,收集沉淀物; 51027, 將步驟S1026得到的所述沉淀物溶于RNase-free水中,并利用DNA消化酶去除 DNA,在37°C溫度下水浴,加入等體積的氯仿和異戊醇,混勻后離心分離; 51028, 將步驟S1027得到的所述上清液分裝到1. 5ml的離心管中,然后加入無水乙醇 和NaAC,混勻后,-20°C靜置并沉淀,在4°C下離心分離,棄上清液,收集沉淀物,分離得到所 述總RNA。
6. 根據(jù)權利要求5所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟S1021中,所述雌性花器官 或雄性花器官的用量為0. lg,所述步驟S1023中,12M Licl的加入量為上清液總體積的1/5 體積。
7. 根據(jù)權利要求5所述的篩選方法,其特征在于,在所述步驟S1028之后,進一步包括 步驟S1029 : 以RNsae - free水為空白對照,使用分光光度計分別測定各RNA樣品的A230、A260與 A280值,判定RNA樣品的純度并計算其總量; 通過凝膠電泳判斷RNA樣品的完整性。
8. 根據(jù)權利要求1所述的篩選方法,其特征在于,所述步驟S103包括: S1031,純化所述雌花總RNA或雄花總RNA ; 51032, 收集小于30bp的small RNA片段,并經過T4RNA連接酶加上人工接口; 51033, 將所述步驟S1032處理后的RNA片段反轉錄成cDNA ; 51034, 對所述cDNA進行PCR擴增,得到所述雌花cDNA文庫或雄花cDNA文庫。
9. 根據(jù)權利要求1所述的篩選方法,其特征在于,所述雌雄異株植物為楊樹。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293889SQ201310298603
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強, 宋躍朋 申請人:北京林業(yè)大學
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