一種重組表達(dá)人溶菌酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人溶菌酶的方法。本發(fā)明人在綜合考慮各種影響表達(dá)的因素后，優(yōu)化人溶菌酶cDNA序列，采用菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin)的信號肽和人溶菌酶的成熟肽構(gòu)建成的溶菌酶表達(dá)盒，表達(dá)人溶菌酶，大幅度地提高了溶菌酶表達(dá)的效率。本發(fā)明的方法表達(dá)的溶菌酶接近天然，酶活性非常高。
【專利說明】一種重組表達(dá)人溶菌酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人溶菌酶的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人溶菌酶包含130個氨基酸，分子量為14. 7kD。溶菌酶（Lysozyme)又稱胞壁質(zhì) 酶（muramidase)或 N-乙醜胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是 一種能水解細(xì)菌中黏多糖的堿性酶。其水解位點是N-乙酰胞壁酸（NAM)的1位碳原子和 N-乙酰葡萄糖胺（NAG)的4位碳原子間的β-1.4糖苷鍵。使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成 可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。G+細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖 組成，而G-細(xì)菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶對于破壞革蘭氏陽性菌G+細(xì)菌的細(xì)胞 壁較革蘭氏陰性菌G-細(xì)菌強。對于革蘭氏陽性菌（G+)，如藤黃微球菌、枯草桿菌或溶壁微 球菌等，溶菌酶的作用相當(dāng)明顯，但是，如大腸桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌等一些 革蘭氏陰性菌（G-)也有一定溶菌作用。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與 DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)合物，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
[0003] 溶菌酶廣泛存在于人體多種組織中，淚、唾液、血漿、尿、乳汁等體液富含溶菌酶， 鳥類和家禽的蛋清、微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最為豐富。溶菌酶是一種堿性蛋 白質(zhì)，有較強的抗熱性。有機溶劑的處理也不能使溶菌酶失活，當(dāng)轉(zhuǎn)移到水溶液中時，溶 菌酶的活力可全部恢復(fù)；冷凍或干燥處理溶菌酶，其活性仍保持穩(wěn)定；溶菌酶最適宜pH在 5. 3-6. 4之間。溶菌酶的抗菌譜較廣，不僅局限于革蘭氏陽性菌，對部分革蘭氏陰性菌也有 抑制效果，可用于低酸性食品防腐。溶菌酶作為防腐劑，其安全性很高，幾乎沒有毒副作用。 其最有效濃度為0.05%。與植酸、聚合磷酸鹽、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果?，F(xiàn) 已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐；還可以添入乳粉中，以抑 制腸道中腐敗微生物的生存，同時直接或間接地促進腸道中雙歧桿菌的增殖。1992年FAO/ WTO的食品添加劑協(xié)會已經(jīng)認(rèn)定溶菌酶在食品中應(yīng)用是安全的。溶菌酶可作為一種具有殺 菌作用的天然抗感染物質(zhì)，有抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加快組織恢復(fù)功能等作用。臨 床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔潰瘍、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等。也可與抗菌藥物合 用治療各種細(xì)菌和病毒感染，口服和肌注均有效。氯化溶菌酶醫(yī)療效果更廣，有濃痰分散、 出血抑制、組織修復(fù)、消炎鎮(zhèn)痛、抗過濾性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制藥有消炎消 痔、治感冒、皮膚病及眼、鼻、喉等用藥。
[0004] 由于人溶菌酶只能從乳汁、胎盤等體液和組織中少量提取，而且分離純化成本較 高，無法進行大規(guī)模生產(chǎn)。因而人溶菌酶的廣泛應(yīng)用只能通過生物技術(shù)手段才得以實現(xiàn)?，F(xiàn) 有技術(shù)中已經(jīng)在酵母等菌株中成功表達(dá)過人溶菌酶，然而表達(dá)的效率以及表達(dá)的規(guī)模仍然 不夠理想（一般搖瓶表達(dá)量在40mg/L以下，發(fā)酵罐表達(dá)量低于350mg/L)，需要從分子構(gòu)建 的源頭上對人溶菌酶的重組表達(dá)進行深入研究，以達(dá)到高表達(dá)這一目的。
[0005] Pichia pastoris酵母較多被用于異源蛋白的基因重組表達(dá)，應(yīng)用該系統(tǒng)成功表 達(dá)了人血清白蛋白、人胰島素原C肽、腫瘤壞死因子、破傷風(fēng)毒素 B片段等。為了達(dá)到異源 蛋白的高表達(dá)，強啟動子發(fā)揮很大作用，如這些高表達(dá)蛋白均是用AOXl啟動子啟動的。但 是其它因素也可以影響重組蛋白的表達(dá)水平。研究人員還經(jīng)常使用一些其它方法來提高目 的蛋白的表達(dá)水平，最常用的方法是提高插入到酵母基因組的目的蛋白表達(dá)盒拷貝數(shù)，此 法可以提高表達(dá)量。但是這個策略有局限，提高拷貝數(shù)不一定必然伴隨著目的蛋白表達(dá)量 的增高。即使有所增高，也不呈現(xiàn)和表達(dá)盒的拷貝數(shù)成正相關(guān)的狀況。蛋白表達(dá)量受很多 因素的制約，有轉(zhuǎn)錄階段的調(diào)控，翻譯階段的制約，以及翻譯后的蛋白修飾等，因此特定的 蛋白，需要找到合適的策略并結(jié)合大量的研究試驗工作來優(yōu)化表達(dá)。
[0006] 綜上，本領(lǐng)域還有必要進行進一步的研究，以提高人溶菌酶的表達(dá)效率，使得人溶 菌酶真正實現(xiàn)高效地大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種重組表達(dá)人溶菌酶的方法。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組表達(dá)人溶菌酶的方法，所述方法包括：
[0009] (1)提供一種重組酵母細(xì)胞，所述酵母細(xì)胞中包含一重組表達(dá)盒，該重組表達(dá)盒含 有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列；和
[0010] (2)培養(yǎng)（1)的重組酵母細(xì)胞，從而表達(dá)人溶菌酶。
[0011] 在一個優(yōu)選例中，所述的菜豆凝集素的信號肽編碼序列的3'端與人溶菌酶成熟肽 編碼序列構(gòu)建的人溶菌酶表達(dá)盒的5'端直接相連，制備成表達(dá)溶菌酶的重組表達(dá)盒。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的菜豆凝集素信號肽編碼序列如SEQ ID N0:4所示；或
[0013] 所述的人溶菌酶成熟肽編碼序列是經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列，如SEQ ID N0:5中第 64-456位所示。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的菜豆凝集素信號肽編碼序列與所述的人溶菌酶成熟肽編 碼序列連接而成的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組表達(dá)盒中，從5'至3'依次包括：啟動子序列，SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:5中第64-456位所示的人溶菌酶成熟肽編碼序列，翻 譯終止子序列，這些序列操作性相連。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子是酵母表達(dá)啟動子；較佳地，所述的啟動子是 AOXl啟動子或GAP啟動子。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組表達(dá)盒位于表達(dá)載體中，所述的表達(dá)載體是 PPHIL-D2表達(dá)載體。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母細(xì)胞是GS115亞型。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：(3)分離（純化）所述的人溶菌酶。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，利用離子交換和/或分子篩進行人溶菌酶的分離純化。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所 示；或如SEQ ID NO:5中第64-456位所示，所述的多核苷酸表達(dá)人溶菌酶。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含一重組表 達(dá)盒，該重組表達(dá)盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組酵母細(xì)胞，所述的重組酵母細(xì)胞包含一重組 表達(dá)盒，該重組表達(dá)盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組表達(dá)載體或所述的重組酵母細(xì)胞的用途， 用于重組表達(dá)人溶菌酶。
[0026] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖I :pHIL_D2載體為骨架，PHA信號肽引導(dǎo)的溶菌酶表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。左圖的溶 菌酶序列未經(jīng)優(yōu)化，右圖的溶菌酶序列經(jīng)過優(yōu)化。
[0028] 圖2 :pPIC_9載體為骨架的溶菌酶表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖。左圖的溶菌酶序列未經(jīng)優(yōu)化， 右圖的溶菌酶序列經(jīng)過優(yōu)化。
[0029] 圖3 :含不同載體的酵母細(xì)胞株在搖瓶和發(fā)酵罐內(nèi)表達(dá)的差異。
[0030] 圖4 :含pHIL-D2-PHA-HLA(optimized)酵母細(xì)胞株在發(fā)酵罐中的表達(dá)和隨后的純 化結(jié)果。圖中"1"為含PHIL-D2-PHA-HLA (optimized)酵母細(xì)胞株在發(fā)酵罐內(nèi)用甘油培養(yǎng)基 生長3天后的發(fā)酵液上清；"2"為含pHIL-D2-PHA-HLA( 〇ptimiZed)酵母細(xì)胞株在發(fā)酵罐內(nèi) 用甘油培養(yǎng)基生長1天，甲醇誘導(dǎo)2天后的發(fā)酵液上清；"3"為純化后獲得的溶菌酶。"4" 為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下為97、66、45、30、20、14KD。

【具體實施方式】
[0031] 在生物【技術(shù)領(lǐng)域】中，異源蛋白的重組表達(dá)是一個重要研究課題。為了提高重組蛋 白的表達(dá)率，需大量時間和大量的實驗室工作，經(jīng)多次試驗、分析、總結(jié)與再試驗的努力才 能達(dá)到最后的成功。有很多因素可以影響重組蛋白表達(dá)率。重組蛋白為分泌表達(dá)時，信號 肽就是一個影響因素；同時，重組蛋白本身的DNA序列對于是否能夠?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)也起了 重要作用。本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次用菜豆凝聚素信號肽取代通常使用的酵母α因 子信號肽；同時綜合考慮各因素并經(jīng)反復(fù)試驗論證后，優(yōu)化了人溶菌酶cDNA序列來構(gòu)建的 表達(dá)人溶菌酶的Pichia pastoris表達(dá)載體，建立了一種新的重組表達(dá)系統(tǒng)，使得成熟的溶 菌酶表達(dá)的效率大幅度地提高。
[0032] 信號肽和成熟肽編碼序列的優(yōu)化
[0033] 如本文所用，所述的"信號肽"是分泌蛋白新生肽鏈N端的一段氨基酸殘基組成的 肽段，其長度一般為20?30個氨基酸殘基。信號肽將分泌蛋白引導(dǎo)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，同時這個 肽段被切除。
[0034] 信號肽對分泌性重組蛋白的表達(dá)有很大影響，一個合適的信號肽可以使目的蛋白 的表達(dá)量成倍提高。畢赤酵母本身分泌的內(nèi)源蛋白質(zhì)較少，因而通過信號肽序列來引導(dǎo)外 源蛋白質(zhì)的分泌可方便純化操作。目前常用的信號肽有釀酒酵母α交配因子（a -MF)和畢 赤酵母酸性磷酸酶（PHOl)信號肽，其中前者在應(yīng)用上更為廣泛。盡管a-MF信號肽是一個 強信號肽，重組蛋白在此信號肽的引導(dǎo)下可以獲得高表達(dá)。但是某些外源蛋白用α-MF信 號肽進行分泌表達(dá)，會使得重組蛋白質(zhì)的氨基末端有所延伸（Liu PT et al. Protein Expr Purif，2001，22:381-387)。如人α-l干擾素用a-MF信號肽來分泌表達(dá)，可見到部分重組 蛋白的N-端帶有9-11個α-MF信號肽氨基酸殘基，這給純化工藝造成很大的難題。在人 溶菌酶的表達(dá)中也碰到類似問題（Nozomi Koganesawa et al, 2001，14:605-710)。
[0035] 本發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，來源于菜豆凝集素的信號肽PHA當(dāng)應(yīng)用于Pichia pastoris分泌表達(dá)溶菌酶時，具有良好表達(dá)效率，與PHA信號肽融合的溶菌酶蛋白質(zhì)能被 正確加工，未見信號肽中的任何氨基酸殘基與目的蛋白的N-端相連。
[0036] 重組蛋白的DNA序列有時可起到關(guān)鍵作用。影響因素包括整個基因 DNA中的GC/ AT比例；堿基AT富集區(qū)的大小和分布；翻譯起始區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)；GC簇（GC cluster)或 者是G簇（G cluster)的分布；酵母偏好密碼子和稀有密碼子的分布等。DNA序列中商GC 比例或高AT比例可以使得目的基因的表達(dá)量降低；過多的AT富集區(qū)域可以明顯地影響酵 母的重組基因表達(dá)，酵母對于聚腺苷信號的專一性沒有高級真核細(xì)胞那樣特異，較長的AT 序列就可被酵母識別為聚腺苷信號，使得目的基因的mRNA提前終止轉(zhuǎn)錄，得到的mRNA比正 常的mRNA短，重組蛋白的C-端序列缺失；GC簇或者是G簇（G cluster)的富集，直接影響 DNA的轉(zhuǎn)錄；翻譯起始區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)的強度可影響核糖體翻譯的效率；酵母稀有密碼子 的存在，目的蛋白的翻譯速度被也使得目的蛋白的表達(dá)受到影響。
[0037] 因此，在研究過程中，本發(fā)明人綜合考慮畢赤酵母偏愛的密碼子、AT:GC的比例設(shè) 計、堿基AT富集區(qū)的大小和分布、GC簇（GC cluster)或者是G簇（Gcluster)的分布、mRNA 二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化、翻譯起始區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)等因素的基礎(chǔ)上，對天然人溶菌酶cDNA序列進行 了優(yōu)化。
[0038] 針對多種序列優(yōu)化策略，本發(fā)明人進行了大量且反復(fù)地試驗，最終確定了如SEQ ID N0:5中第64-456位所示的人溶菌酶編碼序列。這一序列并非僅遵循已經(jīng)報導(dǎo)的畢赤酵 母優(yōu)選密碼子設(shè)計，而是綜合考慮了多種影響因素，以及綜合了重組表達(dá)實驗結(jié)果。
[0039] 重組表達(dá)載體
[0040] 本發(fā)明構(gòu)建了用菜豆凝集素的信號肽PHA引導(dǎo)的、經(jīng)密碼子優(yōu)化的人溶菌酶cDNA 序列的表達(dá)盒，用于轉(zhuǎn)染到酵母細(xì)胞中進行表達(dá)。
[0041] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，應(yīng)用的酵母啟動子可以是AOXl啟動子，也可以是GAP啟 動子或其它酵母啟動子。用相應(yīng)的啟動子連接菜豆凝集素信號肽序列和優(yōu)化的人溶菌酶 cDNA序列，構(gòu)成重組表達(dá)盒。本發(fā)明中，所述的"重組表達(dá)盒"是指包含有表達(dá)目的蛋白（本 發(fā)明中為人溶菌酶）所需的所有必要元件的基因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括一下元件：啟動子、 編碼蛋白的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等。這些元件時操作性 相連的。
[0042] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明所述的人溶菌酶的表達(dá)盒中，從5'至3'依次包 括：啟動子序列，SEQ ID N0:4所示的菜豆凝集素信號肽核苷酸編碼序列，密碼子優(yōu)化后的 人溶菌酶成熟肽編碼序列，翻譯終止子序列，這些序列操作性相連。本發(fā)明中，所述的"操作 性相連"，"可操作地連接"或"操作性連接"是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性 的空間排列。例如：啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的 轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被"可操作地連接"到該核酸序列上。
[0043] 重組表達(dá)的細(xì)胞
[0044] 本發(fā)明用于重組表達(dá)人溶菌酶的細(xì)胞是酵母細(xì)胞。多種酵母細(xì)胞都可用于本發(fā) 明，所述的酵母例如畢赤酵母（Pichia)、漢遜酵母（Hansenula)、假絲酵母（Candida)或球 擬酵母（Torulopsis)等。
[0045] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。畢赤酵母菌體內(nèi)無天 然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體 中以實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。所述的外源基因表達(dá)框架包括啟動子、外源基因克隆位點、信號 膚、外源基因表達(dá)盒、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點以單拷貝或 多拷貝的形式穩(wěn)定整合；由于畢赤酵母可以以甲醇為唯一的碳源和能源，絕大多數(shù)微生物 并不能以甲醇為碳源，因此在發(fā)酵過程中可以減少雜菌的污染，而且大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵技術(shù) 相對比較成熟。包括培養(yǎng)基、發(fā)酵方法等已經(jīng)經(jīng)過詳盡研究，使得發(fā)酵的重現(xiàn)性和自動化程 度都極為良好。
[0046] 作為本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，提供了一種人溶菌酶（HLY)在畢赤 氏酵母（Pichia)中的重組表達(dá)方法。本發(fā)明的方法特征在于重組表達(dá)質(zhì)粒 PPHIL-D2-PHA-HLY(optimized)的構(gòu)建，本發(fā)明特征一表現(xiàn)為在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染由酵母強 啟動子驅(qū)動的密碼子優(yōu)化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列構(gòu)建的HLY。本發(fā)明特征二表現(xiàn)為 用密碼子優(yōu)化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列構(gòu)建HLY的N端前面為菜豆凝集素信號肽序 列。具體操作是宿主細(xì)胞用GS115pPHIL-D2-PHA-HLY( 〇ptimiZed)載體轉(zhuǎn)錄，以不含組氨 酸的培養(yǎng)基進行篩選，在此基礎(chǔ)上進一步用測定溶菌酶表達(dá)量的方法選擇高表達(dá)克隆。經(jīng) 50次傳代確認(rèn)穩(wěn)定高表達(dá)后選擇其中表達(dá)量最高的一株作為工程細(xì)胞株。為了比較菜豆 凝集素信號肽和酵母α因子信號肽對溶菌酶表達(dá)的影響，也為了比較天然人溶菌酶成熟 肽cDNA和密碼子優(yōu)化的人溶菌酶成熟肽cDNA序列對溶菌酶表達(dá)的影響，本發(fā)明人還構(gòu)建 了 PPHIL-D2-PHA-HLY和pPIC9-HLY (optimized)兩個溶菌酶表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)錄畢赤酵母 宿主細(xì)胞，以不含組氨酸的培養(yǎng)基進行篩選，在此基礎(chǔ)上進一步用測定溶菌酶表達(dá)量的方 法選擇高表達(dá)克隆，這些高表達(dá)克隆也需經(jīng)50次傳代，確認(rèn)穩(wěn)定高表達(dá)后選擇其中表達(dá)量 最高的一株來進行比較。
[0047] 細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白分離純化
[0048] 本發(fā)明的方法中，對于培養(yǎng)畢赤酵母的方法和培養(yǎng)基沒有特別的限制，可以采用 本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和培養(yǎng)基。在培養(yǎng)重組細(xì)胞分泌表達(dá)出人溶菌酶后，還可包括步驟： 從培養(yǎng)產(chǎn)物（培養(yǎng)基或發(fā)酵液）中分離溶菌酶。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化溶菌酶可采用本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如可采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、凝膠過濾 法純化、分子篩、或采用親和層析法純化。
[0049] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于表達(dá)量高：采用本發(fā)明構(gòu)建的重組表達(dá)系統(tǒng)進行表達(dá)，可 獲得非常高的溶菌酶表達(dá)量；表達(dá)的蛋白接近天然：采用本發(fā)明的方法表達(dá)、純化的重組 人溶菌酶在分子量測定、N-端15個氨基酸序列、C-末端2個氨基酸序列、肽圖、CD等實驗 中均與天然的人溶菌酶沒有區(qū)別；本發(fā)明另外一個優(yōu)點是操作、培養(yǎng)簡單：采用本發(fā)明的 構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)和方法，在簡單合成培養(yǎng)基中可實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，操作簡單、能有大規(guī)模發(fā) 酵設(shè)備進行表達(dá)，生產(chǎn)成本低廉。
[0050] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0051] 材料及其來源
[0052] Klenow片段多聚酶和所有使用的內(nèi)切酶均為NEB公司產(chǎn)品。pPIC9、pGAPZa、 Pichia pastoris GS115 株為 Invitrogen 公司產(chǎn)品。Trizol RNA抽提試劑盒購自 Promega 公司，YNB(W/0氨基酸）購自Sigma公司。
[0053] 實施例方法簡述
[0054] 根據(jù)酵母偏愛的密碼子和cDNA序列的GC/AT比例；堿基AT富集區(qū)的大小和分布； 翻譯起始區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)；GC簇（GC cluster)或者是G簇（G cluster)的分布等因素綜合 考慮后設(shè)計一條DNA序列，此序列的5 '端有一個EcoRI酶切位點，緊接著為菜豆凝集素信號 肽序列，然后為溶菌酶成熟肽序列，最后為終止密碼子EcoRI酶切位點。該DNA插入到PUC18 載體中，定名為 PUC18-PHA-HLY (optimized)。將 PUC18-PHA-HLY (optimized)克隆載體中插 入的PHA-HLY(Optimized)片段用EcoRI酶切下，1. 5%瓊脂糖電泳分離，回收DNA片段。將 約0. 45Kb的PHA-HLY(optimized)基因回收片段與用EcoRI酶切并經(jīng)堿性磷酸酶處理過的 PHIL-D2載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，以含有Ampicillin LB瓊脂板篩選陽性 克隆。采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。用 5'-A0Xlprimer(GACTGGT TCCAATTGAC AAGC)(SEQ ID NO:6)和優(yōu)化后溶菌酶 cDNA 內(nèi)部的一個 primer (5, -TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC-3'） (SEQ ID NO: 12)作為一對引物，與所得到的重組載體進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖電泳分離，如PCR產(chǎn)物為500bp左右大小DNA片段的，則表明PHA-HLY(Optimized) 插入的方向正確。插入正確的重組載體分別用5'AOXl primer和3'AOXl primer進行測 序，確認(rèn)插入的PHA-HLY(optimized)的序列完全正確，此載體用于轉(zhuǎn)錄Pichia pastoris GS115細(xì)胞。
[0055] PHIL-D2-PHA-HLY載體的構(gòu)建為PHA信號肽序列與天然溶菌酶成熟肽序列（SEQ ID N0:2)的5'端連接后插入到pHIL-D2的EcoRI位點。pPIC9-HLY(optimized)載體的構(gòu) 建為HLY (optimized)成熟肽序列插入到pPIC9的XhoI和EcoRI位點。
[0056] 實施例1、含有人溶菌酶編碼序列的載體構(gòu)建
[0057] 天然的人溶菌酶cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1(5'端第1-54位編碼信號肽）， 編碼SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
[0058] 為了利用人溶菌酶的表達(dá)，對序列進行設(shè)計改造，在人溶菌酶CDNA5'端去除 第1-54位信號肽編碼序列，加上帶有部分酵母α信號肽3'端的編碼序列CTC GAG AAG AGA(SEQ ID NO:8)，合成的序列如SEQ ID NO: 2,在DNA的3'端為翻譯終止信號ΤΑΑ，將該 DNA插入到 PUC18 載體（購自 New England Biolabs)中，定名為 PUC18-HLY。
[0059] 實施例2、人溶菌酶cDNA序列優(yōu)化
[0060] 在綜合考慮畢赤酵母偏愛的密碼子、AT:GC的比例設(shè)計、mRNA二級結(jié)構(gòu)優(yōu)化、堿基 AT富集區(qū)的大小和分布、GC簇（GC cluster)或者是G簇（G cluster)的分布等一系列因 素的基礎(chǔ)上，在天然的溶菌酶cDNA序列（SEQ ID NO: 1)基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，同時在3'末端加 上EcoRI酶切位點的序列GAATTC，優(yōu)化后的溶菌酶成熟肽cDNA序列為SEQ ID NO: 3。
[0061] 實施例3、菜豆凝集素信號肽-優(yōu)化溶菌酶cDNA序列的構(gòu)建
[0062] 菜豆凝集素信號肽（PHA)序列核苷酸序列如SEQ ID NO: 4,其氨基酸序列如SEQ ID NO: 15。人工合成PHA-HLY(optimized)DNA序列，在5'末端加上PHA信號肽編碼序列以 及EcoRI酶切位點，獲得PHA-HLY序列，其順序為EcoRI酶切位點序列緊接著為PHA信號肽 序列（SEQ ID N0:4)其后為序列優(yōu)化后的溶菌酶成熟肽序列，隨后為終止子序列，最后為 EcoRI酶切位點序列。人工合成的全序列為SEQ ID N0:5。該合成序列插入到PUC18載體 中，構(gòu)建成 PUC18-PHA-HLY (optimized)載體。
[0063] 實施例4、菜豆凝集素信號肽-天然溶菌酶cDNA序列的構(gòu)建
[0064] 合成引物
[0065] 引物（SEQ ID NO:9) :G TTC CTG GTA CTA CTG ACA CAC GCA MCTCG MG GTC TTT GAA AGG TGT GAG TTG
[0066] 引物（SEQ ID NO: 10) :GAA TTC ATG GCA AGT AGC AAC CTG TTGAGT CTA GCA CTG TTC CTG GTA CTA CTG ACA CAC G
[0067] 引物（SEQ ID NO:11) :TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC
[0068] 以PUC18-HLY作為模板，用引物SEQ ID NO:9和引物SEQ ID NO: I)組成的引 物進行PCR擴增；以獲得PCR產(chǎn)物提純后作為模板，與引物SEQ ID NO: 10和引物SEQ ID NO: 11組成的引物對進行PCR反應(yīng)，獲得的PCR產(chǎn)物插入到PUC18的EcoRI位點中，構(gòu)建成 PUC18-PHA-HLY載體。此載體進行插入片段PHA-HLY全長DNA測序，測序結(jié)果證明所有序列 完全正確，PCR反應(yīng)沒有引入任何突變。
[0069] 實施例5、Pichia pastoris表達(dá)載體的構(gòu)建
[0070] (I) pHIL-D2_PHA-HLY (optimized)表達(dá)載體構(gòu)建
[0071] PHIL-D2載體（購自Invitrogen)用EcoRI酶切，獲得的線性DNA片段用堿性磷 酸酶處理脫去5' -端磷酸基團；PUC18-PHA-HLY(optimized)載體用EcoRI酶切，1. 5%瓊脂 糖電泳獲得〇. 5kb片段；將0. 5kb片段與EcoRI酶切、經(jīng)堿性磷酸酶處理脫去5' -端磷酸 基團的PHIL-D2線性化DNA相連，轉(zhuǎn)染E. coli DH5a細(xì)胞，用含Ampicillin的LB板篩選， 挑取生長的克隆，直接與5'-A0Xlprimer(SEQIDN0 :6)和優(yōu)化后溶菌酶CDNA內(nèi)部的一 個 primer (5,-TTA GAC GCC GCA ACC CTG AAC-3'）（SEQ ID NO: 12)引物對進行 PCR 反應(yīng)。 如PCR反應(yīng)產(chǎn)物為700bp左右時，則證明PHA-HLY(optimized)已插入到pHIL-D2載體中， 而且PHA-HLY(Optimized)的插入方向正確。挑選正確的克隆，擴增獲得10微克以上質(zhì)粒 DNA備用。該表達(dá)載體的圖譜如圖1右圖。
[0072] (2) pHIL-D2-PHA-HLY酵母表達(dá)載體構(gòu)建
[0073] 將PUC18-PHA-HLY質(zhì)粒用E. coRI酶切，用1. 5%瓊脂糖電泳，分離0. 5kb片 段，將此片段與經(jīng)堿性磷酸酶處理脫去5' -端磷酸基團的pHIL-D2線性化DNA相連， 轉(zhuǎn)染E. coli DH5 a細(xì)胞，用含Ampicillin的LB板篩選，挑取生長的克隆，直接與 5'-A0Xlprimer(GACTGGT TCCAATTGAC AAGC)(SEQ ID N0:6)和溶菌酶 cDNA 內(nèi)部的一個 primer (5, -TTA CAC TCC ACA ACC TTG AAC-3'）（SEQ ID NO: 11)構(gòu)成的引物對進行 PCR 反應(yīng)，如PCR反應(yīng)產(chǎn)物為700bp左右時，則證明PHA-HLY已插入到pHIL-D2載體中，而且 PHA-HLY的插入方向正確。挑選正確的克隆用于酵母轉(zhuǎn)錄。該表達(dá)載體的圖譜如圖1左圖。
[0074] (3) pPIC9_HLY (optimized)載體構(gòu)建
[0075] PPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳分離，回收DNA片段；合 成引物 5' -CTC GAG AAG AGA AAG GTC TTT GAA AGA TGC-3'（SEQ ID NO: 13);將此引物和 3'A0X1 引物（SEQ ID N0:7)組成引物對，以pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)為模板，進行PCR 反應(yīng)，獲得的DNA直接和XhoI和EcoRI酶切后的線性pPIC9 DNA連接，轉(zhuǎn)染E. coli DH5 a 感受態(tài)細(xì)胞，用含有Ampicillin的LB板篩選。挑選陽性克隆，用5' AOXl引物和3' AOXl 引物為引物對，以陽性克隆為模板，進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物為2kb的克隆為插入正確的克隆，此 克隆進行插入DNA的全長序列測定，DNA序列測定證明無 PCR反應(yīng)引入的突變，含完全正確 的閱讀框。此克隆作為酵母轉(zhuǎn)錄用。該表達(dá)載體的圖譜如圖2右圖。
[0076] (4) pPIC9-HLY 載體構(gòu)建
[0077] pPIC9用XhoI和EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳分離，回收DNA片段；將 引物 5'-CTC GAG AAG AGA AAG GTC TTT GAA AGG TGT-3'（SEQ ID NO: 14)和 3'AOXl 引物 (SEQ ID N0:7)組成引物對，以pHIL-D2-PHA-HLY為模板，進行PCR反應(yīng)，獲得的DNA直接和 XhoI和EcoRI酶切后的線性DNA連接，轉(zhuǎn)染E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含有Ampicillin 的LB板篩選。挑選陽性克隆，用5' AOXl引物和3' AOXl引物為引物對，以陽性克隆為模 板，進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物為2kb的克隆為插入正確的克隆，此克隆進行插入DNA的全長序列 測定，DNA序列測定證明無 PCR反應(yīng)引入的突變，含完全正確的閱讀框。此克隆作為酵母轉(zhuǎn) 錄用。該表達(dá)載體的圖譜如圖2左圖。
[0078] 實施例6、HLY在巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)中的表達(dá)
[0079] (l)pHIL-D2-PHA-HLY (optimized)載體轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母
[0080] 取一個含 pHIL-D2-PHA_HLY(optimized)載體的大腸桿菌克隆，在含 Ampicillin 的LB培養(yǎng)基中生長過夜。第二天，離心收集菌體，采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。取抽提純化 的pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)載體DNA20微克，用Sail酶切使之線性化。線性化后的 DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室溫中干燥去除乙醇后溶于20微升純水中。
[0081] 畢赤酵母GSl 15細(xì)胞株（購自Invitrogen)在5毫升YPD中于30 °C、200rpm生 長過夜，取其中〇. 5毫升加到500毫升新鮮YH)培養(yǎng)基中生長過夜，直至培養(yǎng)液的0D_ 在1.3-1. 5之間，離心去上清。細(xì)胞重懸于500毫升無菌冰純水，混合物離心去上清。沉 淀加250毫升無菌冰純水重懸后再離心去上清，沉淀重懸于20毫升冰的IM山梨糖醇 (sorbitol)，混合物離心去上清，最后細(xì)胞重懸于1毫升冰的IM山梨糖醇置冰浴備用。取 10微升線性化DNA(K)微克）和80微升重懸GSl 15細(xì)胞置于0. 2cm電擊杯中，混勻后將電 擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉(zhuǎn)染入GSl 15細(xì)胞內(nèi)。電擊后立即加1暈升冰的 lMsorbitol，然后轉(zhuǎn)移到1.5毫升無菌管，30°C靜止培養(yǎng)1-2小時，分別取100微升、200微 升酵母細(xì)胞液均勻涂布到RDB (無組氨酸）平板，置30°C培養(yǎng)直至克隆生長。選擇200個克 隆分別接種到5毫升YH)培養(yǎng)基，30°C，200rpm生長2天，離心棄去上清，加5毫升YPM培養(yǎng) 基（甲醇濃度為〇. 5%) 30°C，200rpm誘導(dǎo)，每隔24小時補加培養(yǎng)體積為0. 5%的甲醇，補加2 次，第二次補加24小時后，離心取10微升培養(yǎng)上清用SDS-PAGE檢測溶菌酶的表達(dá)。選擇 表達(dá)量最高的克隆為PHIL-D2-PHA-HLY(optimized)陽性克隆。
[0082] (2) pHIL-D2-PHA-HLY 載體轉(zhuǎn)染巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris)
[0083] 取一個含pHIL-D2-PHA-HLY載體的大腸桿菌克隆，在含Ampicillin的LB培 養(yǎng)基中生長過夜。第二天，離心收集菌體，采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。取抽提純化的 PHIL-D2-PHA-HLY載體DNA20微克，用Sail酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚/氯仿 抽提，乙醇沉淀、沉淀DNA在室溫中干燥去除乙醇后溶于20微升純水中。
[0084] 畢赤酵母GSl 15細(xì)胞株（購自Invitrogen)在5毫升YPD中于30 °C、200rpm生 長過夜，取其中〇. 5毫升加到500毫升新鮮YH)培養(yǎng)基中生長過夜，直至培養(yǎng)液的0D600 在1. 3-1. 5之間，離心去上清。細(xì)胞重懸于500毫升無菌冰純水，混合物離心去上清。沉 淀加250毫升無菌冰純水重懸后再離心去上清，沉淀重懸于20毫升冰的IM山梨糖醇 (sorbitol)，混合物離心去上清，最后細(xì)胞重懸于1毫升冰的IM山梨糖醇置冰浴備用。取 10微升線性化DNA(K)微克）和80微升重懸GSl 15細(xì)胞置于0. 2cm電擊杯中，混勻后將電 擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉(zhuǎn)染入GSl 15細(xì)胞內(nèi)。電擊后立即加1暈升冰的 lMsorbitol，然后轉(zhuǎn)移到1. 5毫升無菌管，30°C靜止培養(yǎng)1-2小時，分別取100微升、200微 升酵母細(xì)胞液均勻涂布到RDB (無組氨酸）平板，置30°C培養(yǎng)直至克隆生長。選擇200個克 隆分別接種到5毫升YH)培養(yǎng)基，30°C，200rpm生長2天，離心棄去上清，加5毫升YPM培養(yǎng) 基（甲醇濃度為〇. 5%) 30°C，200rpm誘導(dǎo)，每隔24小時補加培養(yǎng)體積為0. 5%的甲醇，補加2 次，第二次補加24小時后，離心取10微升培養(yǎng)上清用SDS-PAGE檢測溶菌酶的表達(dá)。選擇 表達(dá)量最高的克隆為PHIL-D2-PHA-HLY(optimized)陽性克隆。
[0085] (3)pPIC9_HLY (optimized)載體轉(zhuǎn)染 GSl 15 細(xì)胞
[0086] 取一個含pPIC9_HLY(optimized)載體的大腸桿菌克隆，在含Ampicillin的LB 培養(yǎng)基中生長過夜。第二天，離心收集菌體，采用堿裂解法制備質(zhì)粒DNA。取抽提純化的 pPIC9-HLY(〇ptimiZed)載體DNA20微克，用Sail酶切使之線性化。線性化后的DNA用酚 /氯仿抽提，乙醇沉淀、沉淀在空氣中干燥除去乙醇后溶于20微升純水中，-20°C保存?zhèn)溆谩?GSl 15克隆在5毫升YPD中生長過夜，取其中0. 5毫升加到500毫升新鮮YH)培養(yǎng)基中生 長過夜，直至培養(yǎng)液的0D600在1. 3-1. 5之間，離心去上清。細(xì)胞重懸于500毫升無菌冰純 水，混合物離心去上清。沉淀加250毫升無菌冰純水重懸后再離心去上清，沉淀重懸于20 毫升冰IM sorbitol，混合物離心去上清，最后細(xì)胞重懸于1毫升冰IMsorbitol，置冰浴備 用。取10微升線性化DNA(K)微克）和80微升重懸GSl 15細(xì)胞置于0. 2cm電擊杯中，混勻 后將電擊杯在冰浴中放置5分鐘后電擊將DNA轉(zhuǎn)染入GSl 15細(xì)胞內(nèi)。電擊后立即加1暈升 冰IM sorbitol，然后轉(zhuǎn)移到15毫升無菌管，30°C靜止培養(yǎng)1-2小時，200微升酵母細(xì)胞液 均勻涂布到RDB (無組氨酸）平板，置30°C培養(yǎng)直至克隆生長。選擇200個克隆分別接種到 5毫升YH)培養(yǎng)基，30°C，200rpm生長2天，離心棄去上清，加5毫升YPM培養(yǎng)基（甲醇濃度 為0. 5%) 30°C，200rpm誘導(dǎo)，每隔24小時補加培養(yǎng)體積為0. 5%的甲醇，補加2次，第二次補 加24小時后，離心取10微升培養(yǎng)上清用SDS-PAGE檢測溶菌酶的表達(dá)。選擇表達(dá)量最高的 克隆為PPIC9-HLY(optimized)陽性克隆。
[0087] 實施例7、高表達(dá)克隆的比較
[0088] (I) DNA水平上的確認(rèn)
[0089] 為了進一步確認(rèn)重組克隆的基因組內(nèi)插入了目的蛋白表達(dá)盒，提取上述實施例6 中（1)獲得的工程細(xì)胞候選株（選擇5株）的基因組DNA，同時也提取了上述實施例6中 (2)和⑶獲得的各1株最高表達(dá)細(xì)胞株的基因組DNA，以及GSl 15的基因組DNA。這8株 細(xì)胞的基因組DNA作為模板，分別用5' AOXl primer/3' AOXl primer引物對進行PCR。
[0090] PCR結(jié)果顯示，除GS115細(xì)胞株外，其它7株用5'A0X1 primer/3'A0Xl primer引 物對均能獲得插入的目的基因信號，而且信號強度相同。
[0091] (2)蛋白表達(dá)水平上的確認(rèn)
[0092] 為 了驗證 PHA-HLY (op t imi z e d)要比 PHA-HLY、a -s i gna 1 peptide-HLY(optimized)轉(zhuǎn)染時的目的蛋白的表達(dá)量高。設(shè)計了幾組實驗。
[0093] 第一組：
[0094] 上述9個克?。ò℅S115、實施例3中（1)獲得的5株工程細(xì)胞候選株、 PPIC9-HLY陽性克隆、pPIC9-HLY(optimized)陽性克隆和pHIL-D2-PHA-HLY克隆對照株各 1株）在30°C，200rpm條件下，5毫升YH)培養(yǎng)基中生長2天，離心取沉淀，加含0· 5%(v/v) 甲醇的YP培養(yǎng)基，使各株的細(xì)胞密度相同，體積均為5毫升，仍置于30°C，200rpm條件下培 養(yǎng)，每隔24小時補加0. 5%(v/v)甲醇，共補加2次，第3天末，取上清檢測溶菌酶的含量。
[0095] 實驗結(jié)果，GS115沒有目的蛋白的表達(dá)，pPIC9-HLY陽性克隆株的表達(dá)量為43毫 克/升，pPIC9-HLY(optimized)克隆株的表達(dá)量為62毫克/升、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株 表達(dá)量為87毫克/升、5株工程細(xì)胞候選株的表達(dá)量在120-170毫克/升之間，平均表達(dá)量 150 毫克 / 升，明顯高于 pPIC9-HLY、pPIC9-HLY(optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY 等對照克隆 株，如圖3上圖。
[0096]第二組：
[0097] 從獲得的5株工程細(xì)胞候選株挑選出一株表達(dá)量高的克隆株、pPIC9-HLY、 PPIC9-HLY (optimized)、pHIL-D2-PHA-HLY克隆株分別進行5升發(fā)酵罐培養(yǎng)。發(fā)酵條件按 照 Invitrogen 的 Pichia Fermentation Process Guidelines 所述，甘油生長期 27 小時， 待甘油消耗殆盡，啟動甲醇誘導(dǎo)，共誘導(dǎo)72小時。
[0098] 誘導(dǎo)結(jié)束后檢測各克隆的表達(dá)量，pPIC9-HLY、pPIC9-HLY (optimized)、 PHIL-D2-PHA-HLY克隆株的溶菌酶表達(dá)量分別為315毫克/升、523毫克/升、 587毫克/升，pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)克隆株的表達(dá)量為892毫克/升， PHIL-D2-PHA-HLY(optimized)克隆株的表達(dá)量明顯高于對照克隆，如圖3下圖。
[0099] 實施例8、工程細(xì)胞株表達(dá)的溶菌酶確認(rèn)
[0100] 為了在蛋白分子結(jié)構(gòu)水平上確認(rèn)與天然的人溶菌酶一致。 pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)細(xì)胞株之一（克隆1)在200毫升YH)培養(yǎng)基中生長2天，然 后添加200毫升含2%甲醇的YP培養(yǎng)基繼續(xù)生長3天，培養(yǎng)條件為30°C，200rpm。培養(yǎng)結(jié)束 后離心，收集培養(yǎng)上清。上清液用醋酸調(diào)pH至6. 0,過pH6. 0, 20mM醋酸鈉緩沖液平衡過的 SP-Sepharose FF離子交換柱，目的蛋白用pH8.0,含500mM氯化鈉，20mM磷酸鈉緩沖液洗 脫。洗脫蛋白過用pH7. 0,含50mM氯化鈉，20mM磷酸鈉緩沖液平衡的Sephadex G-25凝膠 柱，進行緩沖液交換。交換了緩沖液后的SP-S印harose FF洗脫蛋白過pH7.0,含50mM氯化 鈉，20mM磷酸鈉緩沖液平衡過的DEAE-Sepharose FF層析柱，溶菌酶不結(jié)合離子交換樹脂， 直接在PH7. 0,含50mM氯化鈉，20mM磷酸鈉平衡緩沖液洗滌時隨緩沖液流穿。用菜豆凝集 素信號肽引導(dǎo)的溶菌酶純化后SDS-PAGE顯示其純度大于99%。
[0101] 純化的重組溶菌酶用TRYPSIN消化后用C18柱進行肽圖分析，結(jié)果與人溶菌酶的 TRYPSIN酶切肽圖完全一致。N-端15個氨基酸序列測定結(jié)果為LysVal Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu，與 SEQ ID NO: 16 的第 1-15 位氨基酸序列完全一 致；C-末端兩氨基酸的序列測定結(jié)果為Gly Val，與人溶菌酶的C-末端兩個氨基酸相同。 純化的重組溶菌酶還進行了園二色譜檢測，檢測的結(jié)果與人溶菌酶一致。而用α信號肽引 導(dǎo)表達(dá)的溶菌酶經(jīng)上述方法純化后有高分子量的雜條帶，WESTERN BLOT方法檢測時高分子 量條帶能被抗人溶菌酶抗體所識別。
[0102] 上述實驗確認(rèn)，本發(fā)明的用菜豆凝集素信號肽引導(dǎo)人溶菌酶成熟肽在Pichia pastoris分泌表達(dá)的方法可以高效正確地表達(dá)人溶菌酶。
[0103] 實施例9、基因工程表達(dá)的人溶菌酶活性研究
[0104] 接種溶壁微球菌于 LB 液體培養(yǎng)劑中（l%Trypton, 0· 5%Yeast extract, l%NaCl)， 28°C 200rpm培養(yǎng)過夜，第二天收集培養(yǎng)液，離心沉淀細(xì)菌，菌體用pH6. 2,0. IM磷酸鈉緩 沖液重懸洗滌后離心，獲得的菌體用上述方法重復(fù)2次，加入同一緩沖液配制成OD45tl為 0·7(±0·05)細(xì)菌懸液，置 4°C備用。pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)細(xì)胞株之一（克隆 1) 產(chǎn)生的人溶菌酶濃度為2mg/ml的樣品，用pH6. 2,0. IM磷酸鈉緩沖液稀釋成1、0. 5、0. 25、 0. 125和0. 0625mg/ml濃度，取試驗菌懸浮液1. 5毫升加0. 1毫升人溶菌酶懸液置比色皿 搖勻后與25°C 450nm波長處每隔30秒讀取OD數(shù)值。按照溶菌酶活性定義，在25°C，pH6. 2 條件下，OD45tl每分鐘下降0. 001為1個酶單位活性（IU)，酶單位活性計算公式為：
[0105] 每毫克溶菌酶活性單位=【0D45Q(0分）-OD45tl (60秒時）】X 1000/樣品毫克數(shù)。
[0106] 經(jīng)計算pHIL-D2-PHA-HLY (optimized)細(xì)胞株之一（克隆1)產(chǎn)生的人溶菌酶活性 為 15900IU/mg 蛋白。
[0107] 實施例10、工程細(xì)胞株的發(fā)酵罐發(fā)酵工藝研究
[0108] 將pHIL-D2-PHA-HLY(optimized)細(xì)胞株之一（克隆1)接種到Y(jié)PD平板生長2天， 挑取單克隆接種到裝有400毫升Yro培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C 250-300rpm條件下生長16-24 小時直到OD6c?在2-6之間。
[0109] 20L發(fā)酵罐內(nèi)加含4%(v/v)甘油的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液8升，加熱高壓滅菌。設(shè)置發(fā)酵 溫度301：4!1控制5.2、轉(zhuǎn)速200-1500印111、通氣條件為0.1-1.0心111空氣，用28%(￥八）氫氧 化銨調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)鹽培養(yǎng)液pH到5. 2,每升培養(yǎng)液加4. 35ml PTMl痕量鹽。待發(fā)酵罐內(nèi)基 礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液的溫度降至30°C后，將400毫升來自搖瓶中培養(yǎng)的OD6c?在2-6之間的種子液加 入發(fā)酵罐。啟動發(fā)酵罐溫度、pH、通氣和攪拌等裝置使酵母細(xì)胞生長，繼續(xù)細(xì)胞生長直到甘 油消耗完畢。一旦所有的甘油都消耗完畢，啟動甘油流加步驟來增加細(xì)胞的量，甘油補料中 甘油的濃度為50% (v/v)，每升甘油補料內(nèi)需含有12毫升PTMl痕量鹽溶液，設(shè)置補料速度 為18. 15ml/hr/liter (起始體積），甘油流加持續(xù)4小時。甘油流加結(jié)束后開始流加甲醇， 流加的甲醇補料含1〇〇%(ν/ν)甲醇，每升甲醇添加12毫升PTMl痕量鹽。設(shè)置流加速度為 3ml/hr每升起始發(fā)酵體積。4小時后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升發(fā)酵體積，以此速度 補加2小時后甲醇補加速度調(diào)整至9ml/hr每升起始發(fā)酵體積，此補料速度一直維持到發(fā)酵 結(jié)束，整個甲醇流加時間為48小時。
[0110] 發(fā)酵結(jié)束后,放罐收集發(fā)酵液,發(fā)酵液通過陶瓷過濾膜過濾方法分離發(fā)酵上清,含 重組溶菌酶的發(fā)酵上清用離子交換，分子篩等方法進行進一步處理。每升發(fā)酵上清經(jīng)上述 方法純化后可獲得純度大于95%溶菌酶400毫克以上。發(fā)酵各階段取樣的電泳結(jié)果如圖4。 [0111] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組表達(dá)人溶菌酶的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提供一種重組酵母細(xì)胞，所述酵母細(xì)胞中包含一重組表達(dá)盒，該重組表達(dá)盒含有： 菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列；和 (2) 培養(yǎng)（1)的重組酵母細(xì)胞，從而表達(dá)人溶菌酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜豆凝集素信號肽編碼序列如SEQ ID N0:4所示；或 所述的人溶菌酶成熟肽編碼序列是經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列，如SEQ ID NO:5中第64-456 位所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組表達(dá)盒中，從5'至3'依次包括： 啟動子序列，SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，SEQ ID N0:5中第64-456位所示的人溶菌酶 成熟肽編碼序列，翻譯終止子序列，這些序列操作性相連。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組表達(dá)盒位于表達(dá)載體中，所述的 表達(dá)載體是PPHIL-D2表達(dá)載體。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酵母細(xì)胞是畢赤酵母細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟： (3) 分離（純化）所述的人溶菌酶。
7. -種分離的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示；或如SEQ ID N0:5中第 64-456位所示，所述的多核苷酸表達(dá)人溶菌酶。
8. -種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含一重組表達(dá)盒，該重組表達(dá) 盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
9. 一種重組酵母細(xì)胞，其特征在于，所述的重組酵母細(xì)胞包含一重組表達(dá)盒，該重組表 達(dá)盒含有：菜豆凝集素的信號肽編碼序列以及人溶菌酶成熟肽編碼序列。
10. 權(quán)利要求8所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求9所述的重組酵母細(xì)胞的用途，用于重 組表達(dá)人溶菌酶。
【文檔編號】C12N1/19GK104278017SQ201310291477
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】孫九如 申請人:上海萬特醫(yī)藥科技有限公司