專利名稱：L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。
背景技術(shù)：
L-酪氨酸是一種芳香族氨基酸，是動物體內(nèi)合成蛋白質(zhì)所需要的重要氨基酸之一，其所帶的氨基和羧基具有重要的生理功能。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-酪氨酸是合成甲狀腺素、多巴、腎上腺的前體；在食品領(lǐng)域，L-酪氨酸是一種重要的添加劑；臨床上，L-酪氨酸還用于生殖避孕療效研究。根據(jù)目前文獻報道，L-酪氨酸的制備方法主要有提取法、化學合成法、發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。1、提取法
提取法生產(chǎn)L-酪氨酸是利用天然蛋白資源如人發(fā)、豬毛、羽毛、豬血粉等為原料，經(jīng)過水解、提取、精制等步驟分離制得L-酪氨酸。陳士安(CN 101823975 A)公開了一種以禽類羽毛為原料工業(yè)化生產(chǎn)L-酪氨酸的方法。該方法以廢棄禽類羽毛為主要原料，用鹽酸水解禽類羽毛中蛋白質(zhì)，再經(jīng)分離提取得到L-酪氨酸產(chǎn)品，使禽類加工增值提高。由于蛋白原料水解液中含有多種氨基酸，其中L-胱氨酸和L-酪氨酸的等電點和溶解度極其相近，從L-酪氨酸和L-胱氨酸的混合物中分離出高純度的L-酪氨酸非常困難。王先兵(CN 101182297 B)公開了從生產(chǎn)L-胱氨酸的排放液中進一步回收L-酪氨酸的方法。該方法將蛋白質(zhì)水解法生產(chǎn)L-胱氨酸的精制排放液調(diào)酸，活性炭吸附L-酪氨酸，再經(jīng)堿水洗脫、濃酸中和分離出L-酪氨酸粗品，精制后得到L-酪氨酸精品，產(chǎn)品收率95%以上。該方法分離效率高、產(chǎn)品純度高、工藝簡單。由于天然蛋白資源中L-酪氨酸含量較少，因此提取法效率較低。近年來隨著人們環(huán)保意識的增強或宗教信仰等原因，一些西方國 家禁用從動物毛發(fā)水解提取的L-酪氨酸，因此發(fā)展新的制備L-酪氨酸的方法具有重要意義。2、化學合成法
化學合成法是通過L-苯丙氨酸羥基化或由對羥基苯甲醛與海因縮合、堿解、轉(zhuǎn)氨等步驟合成?；瘜W合成法不僅步驟較多，而且得到的產(chǎn)物通常為外消旋體，需經(jīng)拆分才能得到具有生理活性的L-酪氨酸。3、發(fā)酵法
發(fā)酵法生產(chǎn)L-酪氨酸是利用經(jīng)常規(guī)誘變處理的短桿菌或棒桿菌，通過發(fā)酵過程生產(chǎn)L-酪氨酸。該工藝控制過程復雜，既要適合微生物自身生長繁殖，又要利于微生物代謝積累，因此產(chǎn)酸率較低。專利(ZL 96197716.7，CN 101627110A)報道了將具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的微生物或基因修飾過的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)生L-氨基酸。其中包括L-酪氨酸產(chǎn)生菌，但沒提及具體產(chǎn)酸效率。4、酶轉(zhuǎn)化法
酶法轉(zhuǎn)化因具有專一性強、反應條件溫和、反應周期短、分離提純?nèi)菀椎葍?yōu)點而日益受到重視，是廉價生產(chǎn)L-酪氨酸的有效方法。吳敏，等(化學世界，2002，43(9): 476-478)以對羥基苯甲醛、海因、氫氧化鈉為原料化學合成了對羥基苯丙酮酸，再利用大腸桿菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶將天冬氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至對羥基苯丙酮酸上制得L-酪氨酸，轉(zhuǎn)化率75%。ENEIHitoshi，等(Agr.Biol.Chem., 37(3): 493-499，1973)以 DL-絲氨酸和苯酚為底物，利用herbicola ATCC 21434中酪氨酸酹裂解酶酶法合成了 L-酪氨酸，100 ml反應體系中得到了 5.35 g L-酪氨酸。N.G.Faleev,等(Enzyme Microb Tech, 1980, 2(4):305-308)利用部分純化的酪氨酸酚裂解酶以甘氨酸、甲醛和苯酚為底物酶法合成了 L-酪氨酸。Matoishi Kaori,等(JP 2006320238)對野生菌herbicola 取 Citrobacterfreundii中酪氨酸酚裂解酶點突變，再以L-絲氨酸和苯酚為底物酶法合成了 L-酪氨酸，酶活較野生型菌株提高了 1.1-1.5 倍。Kim Do Young,等(J Microbiol Biotechn, 2007,17(1): 116-122)在分批補料反應器中流加苯酹、丙酮酸和氨，利用toebii來源酪氨酸酚裂解酶催化反應，轉(zhuǎn)化30 h生成130 g/L L-酪氨酸，L-酪氨酸對苯酚的最大轉(zhuǎn)化率94%。酶法轉(zhuǎn)化主要以苯酚、氨、丙酮酸或L-絲氨酸純品為底物，以不同來源的酪氨酸酚裂解酶催化合成L-酪氨酸，且丙酮酸比L-絲氨酸更適合做該酶底物。由于生產(chǎn)成本問題，目前以L-絲氨酸或丙酮酸純品酶法合成L-酪氨酸無明顯附加值，故以L-絲氨酸或丙酮酸純品酶法合成L-酪氨酸無現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中富含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為底物，添加適量的苯酚，以絲氨酸脫氨基酶和酪氨酸酚裂解酶雙酶催化合成L-酪氨酸的L-酪氨酸法酶法轉(zhuǎn)化制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
一種L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，所述方法按以下步驟進行:
1、將具有絲氨酸脫 氨酶活性和酪氨酸酚裂解酶活性的菌株分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高酶活絲氨酸脫氨酶和酪氨酸酚裂解酶備用；
2、采用游離細胞法，將絲氨酸脫氨酶細胞和酪氨酸酚裂解酶細胞與含L-絲氨酸的氨基酸料液混合，再加入17-616ml濃度為500g/L的苯酚水溶液，維持溶液中苯酚含量為IOg/L,以及濃度為0.2g/L磷酸吡哆醛和濃度為0.01-1.0g/L的表面活性劑，在溫度為25 55°C，用體積百分比為25%的氨水調(diào)節(jié)pH值為6 11的條件下進行酶促反應，反應時間為
6-35小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中的L-酪氨酸的濃度為16.3-589.6g/L ；
3、將步驟2獲取的轉(zhuǎn)化液放入離心機，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物，用200-7000ml純水溶解固體混合物，然后滴加濃度為10mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至12-13，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用濃度為6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用純水洗滌產(chǎn)品，烘干后獲得所需的L-酪氨酸。步驟I所述的絲氨酸脫氨酶菌株為coli K_12，酪氨酸酚裂解酶菌 Citrobacter freundii ATCC 8090> Citrobacter koseri ATCC BAA-895 或
herbicola ATCC 21434 中的任意一種。步驟2所述的含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于角蛋白水解液或蠶絲水解液，氨基酸料液中總氨基酸含量的重量比W / W為10% 40%，其中L-絲氨酸在總氨基酸含量中的重量比W/W為10% 90%.步驟2所述的表面活性劑為吐溫80、十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚中的任意一種。本發(fā)明的積極效果為:
1、本發(fā)明利用絲氨酸脫氨酶先將L-絲氨酸分解成丙酮酸和氨，再以酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、苯酚和氨合成L-酪氨酸，丙酮酸比L-絲氨酸更適合做酪氨酸酚裂解酶的底物，因此雙酶催化比酪氨酸酚裂解酶單酶催化效率更高，實施效果更突出，其中L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率達到95%以上；
2、本發(fā)明采用含L-絲氨酸的混合氨基酸料液為原料，充分利用了工業(yè)副產(chǎn)物，解決了混合氨基酸料液中L-絲氨酸高效分離的難題，同時也為綠色環(huán)保生產(chǎn)L-酪氨酸提供了新途徑，具有良好的經(jīng)濟和社會效益；
3、使用該方法酶促反應生成的L-酪氨酸和混合氨基酸料液中其它氨基酸理化性質(zhì)有較大差異，用等電點結(jié)晶法即可實現(xiàn)分離；
4、該酶法合成的L-酪氨酸具有反應條件溫和，酶立體選擇性強，催化效率高，成本低，工藝流程簡單等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的具體實施方式
。實施例一
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于角蛋白水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 10 g 取 Citrobacter freundii ATCC 8090濕菌體15 g加入到1000 ml含90g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為10%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.0lg吐溫80，流加154 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液pH值為9，在45°C的溫度下，酶促反應15小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為147.3g/L,對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物226 g，用2000 ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至13，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸138 g，收率94%，比旋光=-11.5° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例二
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于角蛋白水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 11 g 取 Citrobacter freundii ATCC 8090濕菌體15 g加入到1000 ml含80g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為20%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.1 g吐溫80，流加137 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%氨水控制轉(zhuǎn)化液pH 8，在40°C的溫度下,酶促反應14 h，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為131 g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。
2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物202 g，用1600 ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸123 g，收率94%，比旋光=-11.3° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例三
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于角蛋白水解液。\、^Escherichia coli K-12濕菌體 10 筆取Citrobacter koseri ATCC BAA-895濕菌體14 g加入到1000 ml含60g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為30%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.1 g聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，流加103 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%氨水控制轉(zhuǎn)化液pH 10，在30°C的溫度下,酶促反應18h，反應結(jié)束后,轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為98.3 g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物158 g，用1200 ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸92.5 g，收率94%，比旋光=-11.5° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例四
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于角蛋白水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 11 g 取 Citrobacter freundii ATCC 8090濕菌體14 g加入到1000 ml 含40g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為40%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.01 g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，流加69 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%氨水控制轉(zhuǎn)化液pH 9，在42°C的溫度下,酶促反應10 h，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為65.5 g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物116g，用800 ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸62.2 g，收率95%，比旋光=-11.6° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例五
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于蠶絲水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 IOg 和freundii ATCC 8090濕菌體15g加入到1000 ml含30g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為30%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.1g吐溫80，流加52 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液pH值至6，在55°C的溫度下，酶促反應10小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為49g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。
2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物96g，用600ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸46g，收率94%，比旋光=-11.8° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例六
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于蠶絲水解液。\、^Escherichia coli K-12 濕菌體 10 g 和herbi cola ATCC 21434 濕菌體15 g加入到1000 ml含40g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為40%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.5g吐溫80，流加68 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液pH值至11，在25°C的溫度下，酶促反應24小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為65.5g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物113g，用800ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸62g，收率95%，比旋光=-11.4° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例七
含L-絲氨酸的氨基酸 料液來源于蠶絲水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 IOg 和freundii ATCC 8090濕菌體14g加入到1000 ml含10g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為10%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.0lg聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，流加17 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液pH值至9，在42°C的溫度下,酶促反應6小時，反應結(jié)束后,轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為16.3g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物52g，用200ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸15.3g，收率94%，比旋光=-11.7° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例八
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于蠶絲水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 IOg 和freundii ATCC 8090濕菌體15g加入到1000 ml含200g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為40%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和1.0g聚乙二醇辛基苯基醚(0P)，流加342 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液PH值至8，在45°C的溫度下，酶促反應28小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為327.5g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。
2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物460g，用4000ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸308g,收率94%，比旋光=-11.3° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例九
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于蠶絲水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 IOg 和 CYiroAacier freundii ATCC 8090濕菌體15g加入到1000 ml含360g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為40%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和1.0g吐溫80，流加616 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液pH值至9，在40°C的溫度下，酶促反應35小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為589.6g/L,對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物800g，用7000ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至13，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸554g，收率94%，比旋光=-11.4° (c=5,1 mol/L鹽酸)。實施例十
含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于蠶絲水解液。Escherichia coli K-12 濕菌體 IOg 和 CYiroAacier freundii ATCC 8090濕菌體15g加入到1000 ml含140g/L的L-絲氨酸的混合氨基酸料液中(料液中總氨基酸的含量為20%)，添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.3g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，流加240 ml濃度為500 g/L苯酚水溶液，維持轉(zhuǎn)化液中苯酚含量10 g/L，用體積百分比濃度為25%的氨水控制轉(zhuǎn)化液pH值至9，在42°C的溫度下，酶促反應20小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中L-酪氨酸濃度為229.3g/L，對L-絲氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95%。2、將轉(zhuǎn)化液放入離心機中，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物330g，用3000ml純水溶解固體混合物，滴加濃度為10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至12，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用少量純水洗滌產(chǎn)品，烘干得L-酪氨酸215g，收率94%，比旋光=-11.3° (c=5,1 mol/L鹽酸)。以上所述僅是本發(fā)明的非限定實施方式，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思和不作出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于:所述方法按以下步驟進行: (1)將具有絲氨酸脫氨酶活性和酪氨酸酚裂解酶活性的菌株分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高酶活絲氨酸脫氨酶和酪氨酸酚裂解酶備用； (2)采用游離細胞法，將絲氨酸脫氨酶細胞和酪氨酸酚裂解酶細胞與含L-絲氨酸的氨基酸料液混合，再加入17-616ml濃度為500g/L的苯酚水溶液，維持溶液中苯酚含量為IOg/L,以及濃度為0.2g/L磷酸吡哆醛和濃度為0.01-1.0g/L的表面活性劑，在溫度為25 55°C，用體積百分比為25%的氨水調(diào)節(jié)pH值為6 11的條件下進行酶促反應，反應時間為6-35小時，反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液中的L-酪氨酸的濃度為16.3-589.6g/L ； (3)將步驟(2)獲取的轉(zhuǎn)化液放入離心機，在轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離15分鐘，收集濕細胞和固體L-酪氨酸混合物，用200-7000ml純水溶解固體混合物，然后滴加濃度為10mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至12-13，攪拌升溫至80°C，將固體混合物完全溶解，加入活性炭脫色除去菌體細胞，將溶液過濾，濾液用濃度為6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，冷卻結(jié)晶，真空抽濾，用純水洗滌產(chǎn)品，烘干后獲得所需的L-酪氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于:步驟(I)所述的絲氨酸脫氨酶菌株S&cAericAia coli K-12,酪氨酸酹裂解酶菌株為CYiroAacierfreundii ATCC 8090、Citrobacter koseri ATCC BAA-895 或herbicola ATCC21434中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于:步驟(2)所述的含L-絲氨酸的氨基酸料液來源于角蛋白水解液或蠶絲水解液，氨基酸料液中總氨基酸含量的重量比W / W為10% 40%，其中L-絲氨酸在總氨基酸含量中的重量比W/W為10% 90%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法，其特征在于:步驟(2)所述的表面活性劑為吐溫80、 十六烷基三甲基溴化銨或聚乙二醇辛基苯基醚中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種L-酪氨酸酶法轉(zhuǎn)化制備方法。所述方法的步驟為1、將有絲氨酸脫氨酶活性和酪氨酸酚裂解酶活性的菌株分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用；2、將所述兩種細胞與含L-絲氨酸的氨基酸料液混合，加入500g/L的苯酚水溶液，以及濃度為0.2g/L磷酸吡哆醛和濃度為0.01-1.0g/L的表面活性劑，在25～55℃，用體積百分比為25%的氨水調(diào)節(jié)pH值為6～11的條件下酶促反應6-35小時；3、將轉(zhuǎn)化液在4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，收集混合物，用200-7000ml純水溶解混合物，滴加10mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至12-13，攪拌升溫至80℃，濾液用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6，烘干后獲得所需的L-酪氨酸。
文檔編號C12P39/00GK103224972SQ201310168119
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者肖國安, 王先兵, 焦慶才, 劉均忠, 章平 申請人:湖北新生源生物工程股份有限公司