專利名稱：混糖發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
L-色氨酸是人體和動物生命活動中必需的氨基酸之一，對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起著重要的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-色氨酸是氨基酸輸液的重要組分和重要的醫(yī)藥中間體。在食品應(yīng)用領(lǐng)域，L-色氨酸可用于強(qiáng)化食品，提高風(fēng)味，也可用于面包促進(jìn)發(fā)酵。在飼料添加領(lǐng)域，當(dāng)賴氨酸和蛋氨酸得以滿足之后，L-色氨酸成為日糧重要限制性氨基酸，補(bǔ)充外源L-色氨酸可以提高畜、禽、魚類日糧內(nèi)L-色氨酸的含量，改善日糧氨基酸組成和比例，提高日糧蛋白質(zhì)的價(jià)值和利用效率。1979年Tribe和pittard首次利用DNA重組技術(shù)將trpE引入大腸桿菌中，L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到lg/L。自此之后，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，經(jīng)基因工程改造的大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌，發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的效率得到了數(shù)十倍的提升。其中Ikeda M等在產(chǎn)L-色氨酸的谷氨酸棒桿菌pIK9960中過表達(dá)tktA，增加L-色氨酸合成前體E4P的含量，從而提高L-色氨酸的合成產(chǎn)率，發(fā)酵80小時(shí)，L-色氨酸產(chǎn)量最高可達(dá)到58g/L (Ikead M 等，Hyperproduction of tryptophan by corynebacterium glutamicumwith the modified pentose phosphate pathway, Applied and environmentalmicrobiology, 1999, 51:201-206)。Berry A在大腸桿菌中高表達(dá)去除反饋抑制的aroG,TrpEDCBA基因，發(fā)酵50小時(shí)，產(chǎn)L-色氨酸45g/L，對葡萄糖的階段轉(zhuǎn)化率接近23% (BarryA, Improving production of aromatic compounds in Escherichia coli by metabolicengineering.Trends Biotechnol,14:250-256, 1996)。目前，L-色氨酸多利用基因工程改造的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌通過發(fā)酵的方法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。其所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基中通常包括充足的碳源和氮源。細(xì)菌能夠利用各種碳水化合物，有機(jī)酸和醇作為碳源。在氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域中最常用的碳源為葡萄糖和蔗糖，其來源為糖漿、谷物、糖蔗、淀粉的水解產(chǎn)物，其價(jià)格日漸升高。因此，需要找出更加廉價(jià)的替代碳源用于L-氨基酸的生產(chǎn)。生物質(zhì)是一種易得且相對便宜的L-氨基酸生產(chǎn)原料。在生物質(zhì)中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的常規(guī)量為約40-60%的纖維素、20-40%的半纖維素、10-25%的木質(zhì)素和10%的其他成分。纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖，半纖維素是由幾種不同類型的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，這些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿伯糖、甘露糖和半乳糖等。木質(zhì)素則是由聚合的芳香醇構(gòu)成的一類物質(zhì)。近二十年來已有大量的文獻(xiàn)和專利或?qū)＠暾?，通過生物催化劑(細(xì)菌和酵母)利用生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇，氨基酸，有機(jī)酸等，不少已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。通過擴(kuò)增戊糖同化基因，對應(yīng)阿拉伯糖的araFG和araBAD基因，木糖的基因xyIABFGHR (中國專利200510076242.X)可以增加戊糖利用率。但是，上述方法需要在生產(chǎn)菌的基礎(chǔ)上，額外進(jìn)行大片段的克隆及啟動子改造，操作復(fù)雜，不易實(shí)現(xiàn)。野生型大腸桿菌可以利用戊糖如L-阿拉伯糖或D-木糖作為碳源，但其相關(guān)代謝受到嚴(yán)格調(diào)控。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在葡萄糖和戊糖時(shí)，大腸桿菌會優(yōu)先利用葡萄糖，等葡萄糖耗盡后才會利用戍糖。這種情況會表現(xiàn)為細(xì)菌的二次生長(diauxic growth)。其分子機(jī)制為PTS系統(tǒng)介導(dǎo)的復(fù)雜調(diào)控系統(tǒng)，其中cAMP為信號分子，CRP (cAMP receptorprotein)為受體蛋白，CRP-cAMP復(fù)合物為激活蛋白，激活多種戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝基因。簡單而言，當(dāng)胞外存在葡萄糖時(shí)，cAMP的合成受到抑制，cAMP含量很低，不足以形成大量的CRP-cAMP復(fù)合物，從而不能有效激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)胞外不存在葡萄糖或其他PTS系統(tǒng)的糖時(shí)，cAMP的合成被激活，CRP-cAMP復(fù)合物得以形成，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄能被激活(Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief:F.CNeidhardt, ASM Press, Washingtong D.C., 1996)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法。該細(xì)菌能夠同時(shí)利用葡萄糖和木糖，增強(qiáng)L-色氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:本發(fā)明提供的混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌，其親代菌株為L-色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800，保藏編號為CGMCC N0.6863。其中，宿主菌SAOl 為 E.coli K-12(CICC10303)衍生的 E.coli K_12CICC10303tnaA serA，所包含質(zhì)粒PMG43，為pBR322來源的，包含有serA，及反饋抑制去除aroG和trpEDCBA操作子的質(zhì)粒。合成引物PW037/PW038(序列如SEQ ID NO:3、4所示)，利用NEB公司的Phusion高保真聚合酶試劑盒，以E.coli菌株MG1655的染色體為模版，PCR擴(kuò)增得到含crp基因DNA片段，經(jīng)純化后通過BamH I/Sal I酶切消耗，連接到同樣被BamHI/Sall酶切消化的pACYC184載體上，構(gòu)建新質(zhì)粒命名為PW13。以pW13為模板，PW071/PW072(序列如SEQ ID N0:5、6所示)為引物，PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用Dpn `I處理后，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得含crp*(cAMP受體蛋白突變體基因)基因片段的載體PW13D。用CaCl2轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法將pW13D質(zhì)粒和對照質(zhì)粒PACYC184 δ Tc (去除Tc抗性基因的pACYC184質(zhì)粒，即含未引入cAMP受體蛋白突變體的編碼基因的載體質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)化菌株MHZ-0800，獲得菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pffl3D)及 MHZ-0821 (pMG43/SA01/pACYC184δTc)。本發(fā)明提供的菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pffl3D)已于2012年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6864。在大腸桿菌合成L-色氨酸的過程中，每合成I摩爾L-色氨酸需要，I摩爾的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和I摩爾4-磷酸赤蘚糖(E4P)作為起始前體，另外還將消耗I摩爾的PEP,谷氨酰胺,5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP, phosphoribosyl-5-pyrophosphate)和絲氨酸。如果能夠同時(shí)利用葡萄糖和戊糖，不僅能降低成本，且將有效的提高E4P與PRPP的供應(yīng)，從而提高色氨酸的合成效率。本發(fā)明提供的菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pW13D)與對照菌株MHZ-0821 (pMG43/SA01/pACYC184 δ Tc)對比試驗(yàn)顯示，菌株ΜΗΖ-0820在葡萄糖和木糖混合培養(yǎng)基中，同步消耗葡萄糖和木糖，并提高了 L-色氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明提供的混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌，其引入cAMP受體蛋白突變體的編碼基因而具有同時(shí)利用己糖和戊糖的能力；
cAMP受體蛋白突變體由cAMP受體蛋白中一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變獲得。CRP為cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein)的縮寫，其編碼基因?yàn)閏rp,又被稱為cap, csm。其編碼基因是已知的，并且標(biāo)明為crp (GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號3484142到3484774)。CRP是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，與其配體cAMP結(jié)合后起調(diào)控作用。CRP-cAMP是大腸桿菌最重要的代謝調(diào)控蛋白之一。cAMP受體蛋白突變體，記為CRP*，表示一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變的CRP可以不依賴于cAMP行使其激活蛋白的功能，其編碼基因?yàn)閏rp*。CRP*不需要cAMP就能激活CRP-cAMP控制的基因的轉(zhuǎn)錄(例如，那些負(fù)責(zé)木糖和阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收和代謝的基因)，因此，含有CRP*突變體的大腸桿菌能夠同時(shí)利用葡萄糖和戊糖。crp基因可以通過使用基于基因核苷酸序列的引物進(jìn)行PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))獲得，crp*基因可以根據(jù)前述文獻(xiàn)記載，利用單點(diǎn)或多點(diǎn)突變的方法獲得。當(dāng)CRP*突變體表達(dá)量增加時(shí)，含CRP*突變體的細(xì)菌同時(shí)利用葡萄糖和戊糖(木糖或阿拉伯糖)的效果更顯著。

用編碼蛋白的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，例如常規(guī)方法將DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞中以增加編碼本發(fā)明所述蛋白的基因的表達(dá)并且增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞中蛋白的活性。增強(qiáng)基因表達(dá)的方法包括增加基因拷貝數(shù)。將基因?qū)肽軌蛟诎ＯＪ暇鷮偌?xì)菌中發(fā)揮功能的載體可增加基因的拷貝數(shù)。其轉(zhuǎn)化的方法包括任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。例如，同源重組，Mu整合等方法將基因的多重拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體中也可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。另一方面，將控制本發(fā)明DNA的天然啟動子更換為更有效的啟動子也可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)。例如，PR啟動子，Iac啟動子，trp啟動子，trc啟動子是公知的有效的組成型啟動子通過將更有效的Shine-Dalgarno序列(SD序列)導(dǎo)入本發(fā)明的DNA以替代天然SD序列可以實(shí)現(xiàn)翻譯的增強(qiáng)。此外，采用更有效的啟動子可以與增加基因拷貝數(shù)的方法結(jié)合使用。制備染色體DNA、雜交、PCR、制備質(zhì)粒DNA、消化和連接DNA，轉(zhuǎn)化，選擇核苷酸作為引物等的方法可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法。這些方法記載于Sambrook，J.，andRussell D.“Molecular Cloning A laboratory Manual, Third Edition”，Cold SpringHarbor Laboratory Press (2001)等。通過將前述DNA導(dǎo)入本身具有生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌可獲得本發(fā)明的細(xì)菌?；蛘?，通過將生產(chǎn)L-色氨酸的能力給予已經(jīng)含有該DNA的細(xì)菌可獲得本發(fā)明的細(xì)菌。作為優(yōu)選,本發(fā)明提供的細(xì)菌屬于埃希氏菌屬(Escherichia)。埃希氏菌屬細(xì)菌表示該細(xì)菌根據(jù)微生物技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員公知的分類法分類于埃希氏菌屬。用于本發(fā)明的埃希氏菌屬細(xì)菌的例子包括，但不限于大腸桿菌(Escherichia coli, E.coli)。作為優(yōu)選，cAMP受體蛋白突變體具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或者增加一個或幾個氨基酸后得到的氨基酸序列。作為優(yōu)選，cAMP受體蛋白突變體具有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。作為優(yōu)選，己糖為葡萄糖。作為優(yōu)選，戊糖為木糖或阿拉伯糖。但在本發(fā)明中適合發(fā)酵的戊糖不限于木糖和阿拉伯糖。本發(fā)明提供了混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌，其保藏編號為CGMCC N0.6864。本發(fā)明還提供了一種混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，取保藏編號為CGMCCN0.6864的混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁后，將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入含有戊糖和己糖的發(fā)酵培養(yǎng)基混糖發(fā)酵，收集L-色氨酸。作為優(yōu)選，戊糖和己糖為生物質(zhì)中獲得的糖的混合物。作為優(yōu)選，混糖發(fā)酵的溫度為30 40°C。作為優(yōu)選，混糖發(fā)酵的pH值為6 8。作為優(yōu)選，擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:10。作為優(yōu)選，種子培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，KH2P049.5g/L，硫酸銨 5g/L，MgSO4.7H202g/L，pH 值為 6 8。作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖30g/L，木糖30g/L，KH2P045g/L,硫酸銨5g/L，檸檬酸鈉 2g/L，酵母提取物 lg/L, MgSO4.7H202g/L, 20g/L CaCO3, FeSO4.7Η200.lg/L, MnSO4.H2O0.lg/L, ZnSO4.H2O0.lg/L, CoCl2.6Η200.lg/L, CuSO4.5Η200.03g/L, pH 值為
6 8ο戊糖，如木糖和阿拉伯糖，與己糖如葡萄糖的混合物可以從未充分利用的生物質(zhì)資源中獲得。通過氣爆，酸解，酶解，濃縮，從植物生物質(zhì)中釋放葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其他碳水化合物。半纖維比纖維素更容易水解為戊糖和己糖，分離后可進(jìn)一步水解纖維素形成葡萄糖。以上過程中的多種組分可以被分別分離，混合使用或與額外添加的己糖，如葡萄糖混合使用。本研究使用1:1的葡萄糖/木糖組成的混合物，以模擬可能從生物質(zhì)提取物中獲得的己糖和戊糖原料混合物的組成(參見實(shí)施例部分)。由于多數(shù)生物質(zhì)如玉米秸桿，玉米芯，蔗渣，棉桿等的半纖維素中阿拉伯糖含量較少，如玉米芯中半纖維素的總含量為37%，其單糖的組成成分主要為D—木糖，阿拉伯糖和葡萄糖，含量各為23%，3%，10%。本發(fā)明使用不同比例的葡萄糖/木糖組成的混合物，以模擬可能得葡萄糖和戊糖混合物的組成。在本發(fā)明中，培養(yǎng)基中L-色氨酸的培養(yǎng)、收集和純化等采用的方法類似于常規(guī)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的方法。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以為合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和礦物質(zhì)，以及其他所需的微生物生長營養(yǎng)物。碳源可包括多種可被L-色氨酸生產(chǎn)菌用作碳源的碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，木糖，阿拉伯糖和其他戊糖和己糖。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其他碳水化合物可以是從生物質(zhì)中獲得的糖的原材料混合物的全部或一部分。氮源，可以使用多種銨鹽如硫酸 銨，氯化銨，氨水，液氨、其他含氮組合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解產(chǎn)物和同化的發(fā)酵微生物。礦物質(zhì)，可以使用磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、氯化鈣等。需要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入額外的營養(yǎng)物。如維生素，及其他缺陷型氨基酸組分。優(yōu)選地，在有氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如搖瓶培養(yǎng)，和通風(fēng)條件下攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30到40°C，優(yōu)選30到38°C。培養(yǎng)基的pH值通常在6到8之間，優(yōu)選在6.5到7.2之間。培養(yǎng)基的PH值可以用氨水，碳酸鈣，多種酸、多種堿和緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。通常，培養(yǎng)I到3天可以在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生目的L-色氨酸的積累。培養(yǎng)后，通過離心或膜過濾從液體培養(yǎng)基中除去固體物質(zhì)如細(xì)胞，而后采用離子交換，濃縮和結(jié)晶方法收集和純化L-色氨酸。本發(fā)明提供了混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法。其親代菌株為L-色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800，其保藏編號為CGMCC N0.6863。其宿主菌SAOl為E.coliK-12(CICC10303)衍生的 E.coli K_12CICC10303tnaA serA，包含質(zhì)粒 pMG43，為 pBR322 來源的，包含有serA，及反饋抑制去除aroG和trpEDCBA操作子的質(zhì)粒。合成引物PW037/PW038 (序列如SEQ ID NO:3、4所示)，利用NEB公司的Phusion高保真聚合酶試劑盒，以E.coli菌株MG1655的染色體為模版，PCR擴(kuò)增得到含crp基因DNA片段，經(jīng)純化后通過BamH I/Sal I酶切消耗，連接到同樣被BamHI/Sall酶切消化的pACYC184載體上，構(gòu)建新質(zhì)粒命名為PW13。以pW13為模板，PW071/PW072(序列如SEQ ID NO:5、6所示)為引物，PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用Dpn I處理后，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得含crp*基因片段的載體PW13D。用CaCl2轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法將pW13D質(zhì)粒和對照質(zhì)粒pACYC184 δ Tc (去除Tc抗性基因的pACYC184質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)化菌株ΜΗΖ-0800，獲得菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pW13D)及MHZ-0821 (pMG43/SA01/pACYC184δ Tc)。本發(fā)明提供的菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pffl3D)已于2012年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6864。本發(fā)明提供的菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pW13D)與對照菌株 MHZ-0821 (pMG43/SA01/pACYC184 δ Tc，即未引入cAMP受體蛋白突變體的編碼基因)對比試驗(yàn)顯示，菌株MHZ-0820在葡萄糖和木糖混合培養(yǎng)基中，同步消耗葡萄糖和木糖，并提高了 L-色氨酸的產(chǎn)量。生物保藏說明MHZ-0820，分類命名:大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，于2012年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6864 ；MHZ-0800，分類命名:大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，于2012年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6863。


圖1示含cAMP受體蛋白突變體的編碼基因的載體PW13D結(jié)構(gòu)圖；圖2示菌株MHZ-0820和MHZ-0821在葡萄糖和戊糖混合培養(yǎng)基中的生長曲線(即經(jīng)種子培養(yǎng)基擴(kuò)繁、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后0D_的變化情況);其中，線I示菌株MHZ-0821生長曲線，存在二次生長情況，線2示菌株MHZ-0820 (保藏編號為CGMCC N0.6864)生長曲線，無明顯二次生長情況；

圖3示菌株MHZ-0820和MHZ-0821在葡萄糖和戊糖混合培養(yǎng)基中生長時(shí)，培養(yǎng)基中葡萄糖和木糖的消耗變化情況；其中，線1，線4分別為培養(yǎng)MHZ-0821過程中，培養(yǎng)基中木糖和葡萄糖的含量變化，MHZ-0821需要耗盡葡萄糖之后方能利用木糖；線2，線3分別為培養(yǎng)MHZ-0820過程中，培養(yǎng)基中木糖和葡萄糖的含量變化，MHZ-0820可以同時(shí)消耗葡萄糖和木糖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法中所用試劑均可由市場購得。本發(fā)明提供的混糖發(fā)酵L-色氨酸的細(xì)菌的親代菌株為L-色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800，其宿主菌 SAOl 為 E.coli K-12(CICC10303)衍生的 E.coli K_12CICC10303tnaA serA，包含質(zhì)粒pMG43，為pBR322來源的，包含有serA，及反饋抑制去除aroG和trpEDCBA操作子的質(zhì)粒。本申請人已于2012年11月22日將親代菌株MHZ-0800保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6863。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
實(shí)施例1crp*基因的獲得合成引物PW037/PW038 (如SEQ ID NO:3、4所示)，利用NEB公司的Phusion高保真聚合酶試劑盒，以E.coli菌株MG1655的染色體為模版，PCR擴(kuò)增得到含crp基因DNA片段，經(jīng)純化后通過BamH I/Sal I酶切消耗，連接到同樣被BamHI/Sall酶切消化的pACYC184載體上，構(gòu)建新質(zhì)粒命名為PW13。以pff13 為模板，PW071/PW072 (如 SEQ ID NO:5、6 所示)為引物，PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用Dpn I處理后，直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，獲得含crp*基因片段的載體pW13D，結(jié)構(gòu)見圖1。同時(shí)將BamHI/Sall酶切消化的pACYC184載體粘末端補(bǔ)齊，獲得pACYC184 δ Tc，即去除Tc抗性基因的pACYC184質(zhì)粒，為對照質(zhì)粒。實(shí)施例2L-色氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合培養(yǎng)基中的生長和耗糖能力L-色氨酸生產(chǎn)菌Ε.coli菌株MHZ-0800(pMG43/SA01)作為親代菌株用于評價(jià)葡萄糖和戊糖的混合物的發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸，其保藏編號為CGMCC N0.6863。分別通過使用CaCl2的常規(guī)方法用PW13D質(zhì)粒和載體/pACYC184 δ Tc (去除Tc抗性基因的pACYC184質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化菌株ΜΗΖ-0800，獲得菌株MHZ-0820 (pMG43/SA01/pW13D)和MHZ-0821 (pMG43/SA01//pACYC184δ Tc)。從凍存管中取Ε.coli菌株MHZ-0820和MHZ-0821在LB平板(Tc、Cm抗性)上劃線，37°C培養(yǎng)18-24hr ;將菌體從平板上刮下一環(huán)，接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基(Tc、Cm抗性)的搖瓶中，37°C，轉(zhuǎn)速240rpm，培養(yǎng)5-10小時(shí)，0D600控制在6-10 ;將2mL種子液轉(zhuǎn)接到含20mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Tc、Cm抗性)的搖瓶中，搖床37°C，240rpm發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)20-30小時(shí)，按時(shí)間間隔取樣，測定樣品0D600值，并取上清液用HPLC的方法測定殘留的葡萄糖和木糖。LB培養(yǎng)基組分及抗生素添加量為標(biāo)準(zhǔn)濃度,詳見實(shí)驗(yàn)指南(Sambrook, J.，and RussellD.“Molecular Cloning A laboratory Manual, Third Edition”，Cold Spring HarborLaboratory Press,2001)。種子培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，KH2P049.5g/L，硫酸銨5g/L, MgSO4.7H202g/L, pH6_8。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖10g/L，木糖10g/L，KH2P045g/L，硫酸銨5g/L，檸檬酸鈉 2g/L，酵母提取物 lg/L, MgSO4.7H202g/L，F(xiàn)eSO4.7Η200.lg/L, MnSO4.H2O0.lg/L,ZnSO4.H2O0.lg/L, CoCl2.6H200.lg/L, CuSO4.5H200.03g/L, pH6_8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2、圖3?？梢姾珻RP突變體基因的L-色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0820能夠同步消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖，無明顯二次生長性狀。將MHZ-0820于2012年11月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6864。實(shí)施例3使用L-色氨酸生產(chǎn)菌在葡萄糖和戊糖混合物中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸從凍存管中取E.Co I i菌株MHZ-0820和MHZ-0821在LB平板(Tc、Cm抗性)上劃線，37°C培養(yǎng)18-24hr ;將菌體從平板上刮下一環(huán)，接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基(Tc、Cm抗性)的搖瓶中，37°C，轉(zhuǎn)速240rpm，培養(yǎng)5_10小時(shí)，0D600控制在6_10 ;將2mL種子液轉(zhuǎn)接到含20mL發(fā)酵培養(yǎng)基(Tc、Cm抗性)的搖瓶中，往復(fù)搖床37°C，120rpm發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中流加稀氨水，控制發(fā)酵液PH值至6.5-7.0。直至殘?zhí)呛谋M，發(fā)酵終了測樣品0D600，并用HPLC的方法測定L-色氨酸含量，結(jié)果見表I。LB培養(yǎng)基組分及抗生素添加量為標(biāo)準(zhǔn)濃度，詳見實(shí)驗(yàn)指南(Sambrook, J.，andRussell D.“Molecular Cloning A laboratory Manual, Third Edition”，Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)。種子培養(yǎng)基的組分包括:葡萄`糖20g/L，酵母提取物10g/L，KH2P049.5g/L，硫酸銨5g/L, MgSO4.7H202g/L, ρΗ7.0。
`
發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括:葡萄糖30g/L，木糖30g/L，KH2P045g/L，硫酸銨5g/L，檸檬酸鈉 2g/L，酵母提取物 lg/L, MgSO4.7H202g/L, 20g/LCaC03, FeSO4.7Η200.lg/L,MnSO4.H2O0.lg/L, ZnSO4.H2O0.lg/L, CoCl2.6H200.lg/L, CuSO4.5H200.03g/L, pH7.0。表lcrp*對L-色氨酸生產(chǎn)菌在混糖發(fā)酵中的影響
權(quán)利要求
1.混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌,其特征在于,其包含cAMP受:體蛋白突變體的編碼基因而具有同時(shí)利用己糖和戍糖的能力； 所述cAMP受體蛋白突變體由cAMP受體蛋白中一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，所述cAMP受體蛋白突變體具有如SEQIDN0.1所示的氨基酸序列中缺失、替換、插入或者增加一個或幾個氨基酸后得到的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，所述cAMP受體蛋白突變體具有如SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，所述己糖為葡萄糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于，所述戊糖為木糖或阿拉伯糖。
6.混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌,其特征在于,保藏編號為 CGMCC N0.6864。
7.一種混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其特征在于，取保藏編號為CGMCC N0.6864的混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁后，將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入含有戊糖和己糖的發(fā)酵培養(yǎng)基混糖發(fā)酵，收集L-色氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述戊糖和己糖為生物質(zhì)中獲得的糖的混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述混糖發(fā)酵的溫度為30 40°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述 的方法，其特征在于，所述混糖發(fā)酵的pH值為6 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及混糖發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的細(xì)菌及發(fā)酵方法。在生產(chǎn)L-色氨酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌中，包含cAMP受體蛋白突變體的編碼基因而使其具有同時(shí)利用己糖和戊糖生產(chǎn)L-色氨酸的能力。cAMP受體蛋白突變體由cAMP受體蛋白中一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變獲得。本發(fā)明提供的細(xì)菌在含葡萄糖和木糖的培養(yǎng)基中，同步消耗葡萄糖和木糖，并提高了L-色氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12R1/19GK103114069SQ201310057858
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者毛賢軍, 趙津津, 吳濤 申請人:新疆梅花氨基酸有限責(zé)任公司