專利名稱：一種利用嗜熱子囊菌內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶降解殼聚糖制備殼寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)內(nèi)切￠-1,4-葡聚糖酶Cel5A降解殼聚糖制備殼寡糖的方法,屬于酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
殼寡糖，學(xué)名為3-1，4-寡聚-葡萄糖胺，指2 10個氨基葡萄糖以3-1，4-糖苷鍵連接而成的低聚糖。殼寡糖具有殼聚糖不具備的水溶性和易被生物體吸收等諸多獨特優(yōu)異的功能，在醫(yī)藥、保健、食品、日化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。另據(jù)報道，聚合度為3 8的殼寡糖具有較高的生物活性。例如，聚合度為3 7的殼寡糖能夠促進(jìn)鈣及其他礦物質(zhì)的吸收，聚合度為6 8的殼寡糖具有高活性的抗腫瘤作用等。目前，殼寡糖的制備方法主要有化學(xué)法和酶法水解?；瘜W(xué)法主要包括酸降解和H2O2氧化降解?；瘜W(xué)法反應(yīng)條件劇烈，且不好控制，降解產(chǎn)物中主要得到的是單糖，具有生理活性的殼寡糖收率低，同時產(chǎn)物中混有大量酸和氧化劑，環(huán)境污染嚴(yán)重。酶法降解殼聚糖具有條件溫和，易于控制，殼寡糖收率高，污染少等優(yōu)勢而被廣泛關(guān)注，酶解法又分為專一性酶解法和非專一性酶解法。殼聚糖酶是殼聚糖的專一性水解酶，Takiguchi等用來源于Bacillus sp.7-M的殼聚糖酶降解殼聚糖成功地得到了二至五糖，shimai等人用殼聚糖酶結(jié)合膜過濾技術(shù)水解殼聚糖，得到五糖含量> 92.3%的殼寡糖。降解殼聚糖的非專一性酶種類很多，主要有纖維素酶，溶菌酶，脂肪酶，蛋白酶等。研究較多的為纖維素酶。Muraki等研究了來源于里氏木霉的纖維素酶對殼聚糖的降解作用。在50°C條件下用濃度為0.6%的纖維素酶作用于濃度為3%的殼聚糖，最佳水解時間為6小時，產(chǎn)物中聚合度5 8的殼寡糖占18%。Zhang等應(yīng)用纖維素酶結(jié)合膜分離技術(shù)生產(chǎn)出了聚合度3 10的殼 寡糖。近年來，隨著殼寡糖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，殼寡糖的市場需求量日益增大，但是，由于來源有限，難以獲得大量而廉價的殼聚糖專一性酶，因此尋找用于降解殼聚糖的非專一性酶，并建立一種快速，環(huán)保，高效的殼寡糖制備方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效廉價降解殼聚糖制備殼寡糖的方法，SP利用嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)或者基因工程菌生產(chǎn)的內(nèi)切0_1，4_葡聚糖酶Cel5A降解殼聚糖，得到殼寡糖。本發(fā)明提供的一種高效廉價降解殼聚糖制備殼寡糖的方法步驟為:(I)以I 2%醋酸溶液溶解殼聚糖，配制成濃度為I 6%的殼聚糖溶液，然后用10 20mM醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.0。(2)將步驟(I)制得的殼聚糖溶液倒入容器中，置于40 55°C的恒溫水浴振蕩器中，按2 10IU/g底物的加酶量加入內(nèi)切P -1，4-葡聚糖酶Cel5A進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將所得的酶解液煮沸，使酶滅活，調(diào)PH至8.0后離心，將上清液冷凍干燥制得殼寡糖。本發(fā)明的優(yōu)點是:利用纖維素酶生產(chǎn)殼寡糖，生產(chǎn)過程簡單，生產(chǎn)成本大幅降低；反應(yīng)條件溫和，能耗低，污染少；酶解效率高，僅需I小時，殼2 8糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到60%，產(chǎn)物中有效組分含量高，殼3 8糖的含量在77%以上，是生產(chǎn)殼寡糖的理想方法。


圖1殼寡糖制備的工藝流程圖。
具體實施例方式實施例1:以2%的乙酸溶液溶解殼聚糖，配制成濃度為3%的殼聚糖溶液，然后用乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH至5.0。將制得的殼聚糖溶液倒入容器中，置于50°C的恒溫水浴振蕩器中，按2IU/g底物的加酶量加入內(nèi)切P -1,4-葡聚糖酶Cel5A進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)一小時后,將所得的酶解液煮沸，使酶滅活，調(diào)pH至8.0后離心，將上清液冷凍干燥得到殼寡糖成品。所述的殼寡糖產(chǎn)品經(jīng)高效液相色譜法檢測，檢測條件為:色譜柱，AsahipakNH2P-50 4E 柱(4.6mm*250mm, Shodex 公司);流動相為 70% 乙腈,流速 0.8mL/min ;檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；柱溫30 °C，殼2 8糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到60%，產(chǎn)物中有效組分殼3 8糖含量高，含量在77%以上。實施例2:以2%的乙酸溶液溶解殼聚糖，配制成濃度為6%的殼聚糖溶液，然后用乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH至5.0。將制得的殼聚糖溶液倒入容器中，置于50°C的恒溫水浴振蕩器中，按2IU/g底物的加酶量加入內(nèi)切P -1,4-葡聚糖酶Cel5A進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)一小時后,將所得的酶解液煮沸，使酶滅活，調(diào)pH至8.0后離心，將上清液冷凍干燥得到殼寡糖成品。檢測條件同實施例1，殼2 8糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%，產(chǎn)物中有效組分殼3 8糖含量高，含量在70%以上。實施例3:以I %的乙酸溶液溶解殼聚糖，配制成濃度為3%的殼聚糖溶液，然后用乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH至5.0。將制得的殼聚糖溶液倒入容器中，置于50°C的恒溫水浴振蕩器中，按2IU/g底物的加酶量加入內(nèi)切P -1,4-葡聚糖酶Cel5A進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)一小時后,將所得的酶解液煮沸，使酶滅活，調(diào)pH至8.0后離心，將上清液冷凍干燥得到殼寡糖成品。檢測條件同實施例1， 殼2 8糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到60%，產(chǎn)物中有效組分殼3 8糖含量高，含量在77%以上。
權(quán)利要求
1.一種利用嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)內(nèi)切β-1,4_葡聚糖酶Cel5A降解殼聚糖制備殼寡糖的方法。其特征在于方法步驟為: (1)以醋酸溶液溶解殼聚糖，配制成濃度為I 6%的殼聚糖溶液，然后用醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.0 6.0。
(2)將步驟(I)制得的殼聚糖溶液倒入容器中，置于40 55°C的恒溫水浴振蕩器中，按2 10IU/g底物的加酶量加入內(nèi)切β -1，4-葡聚糖酶Cel5A進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將所得的酶解液煮沸，使酶滅活，調(diào)pH至8.0后離心，將上清液冷凍干燥制得殼寡糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的殼聚糖底物為脫乙酰度為80 95%的殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法，其特征在于所述的內(nèi)切0-1，4-葡聚糖酶&15八是按下述方法得到的:以嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)或者高效表達(dá)內(nèi)切β -1,4-葡聚糖酶Cel5A的基因工程菌發(fā)酵得到的發(fā)酵上清液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醋酸溶液濃度為I 2%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醋酸鈉溶液的濃度為10 20mM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A降解殼聚糖制備殼寡糖的方法。殼聚糖底物用醋酸溶液充分溶解，加入內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Cel5A，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，100℃煮沸10分鐘滅酶。將酶解液調(diào)pH至8.0，并離心去沉淀，上清液真空干燥，得到殼寡糖產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點是反應(yīng)條件溫和，酶解效率高，產(chǎn)物中有效組分含量高，殼3～8糖的含量在77％以上。
文檔編號C12P19/26GK103146784SQ20131003025
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者吳敬, 閆鵬安, 宿玲恰, 陳堅 申請人:江南大學(xué)