一種用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，所述方法包括如下步驟：（1）用細齒麒麟菜飼喂藍子魚；（2）從藍子魚內(nèi)臟獲得粗酶提取液；（3）用所述粗酶提取液酶解細齒麒麟菜以獲得原生質(zhì)體。本發(fā)明方法的原料易于獲得，結(jié)果完整、穩(wěn)定，通過本發(fā)明方法能夠獲得具有完整結(jié)構(gòu)的沒有細胞壁的原生質(zhì)體，為接下來的通過原生質(zhì)體愈合和組織培養(yǎng)途徑進行種質(zhì)種苗培育奠定良好基礎(chǔ)。
【專利說明】一種用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種原生質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細齒麒麟菜是重要的產(chǎn)^ -卡拉膠紅藻，具有廣闊的市場開發(fā)和應(yīng)用前景。在我國，細齒麒麟菜除生產(chǎn)I卡拉膠用于食品和藥品加工制造外，還可直接用來加工成涼拌速食產(chǎn)品，僅涼拌速食產(chǎn)品一項我國每年消耗約2000噸干品。
[0003]國際上細齒麒麟菜栽培多在熱帶和亞熱帶地區(qū)進行，細齒麒麟菜主產(chǎn)于印度尼西亞和菲律賓等東南亞國家和地區(qū)。以往該藻規(guī)模栽培主要依賴于營養(yǎng)繁殖，而該藻的孢子繁殖和有性生殖方式已經(jīng)嚴重退化，造成種質(zhì)退化、生長緩慢、產(chǎn)膠性能降低和抗病能力下降。
[0004]至今為止，細齒麒麟菜的育苗育種工作，在國內(nèi)外尚沒有重大突破。如果能夠通過制備原生質(zhì)體，進而結(jié)合細胞融合和愈傷組織等生物技術(shù)培育優(yōu)良品種，將會對細齒麒麟菜的育種有巨大 作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種能夠制備優(yōu)良的原生質(zhì)體的方法，從而為進一步的育種提供良好的基礎(chǔ)。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，一種用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，所述方法包括如下步驟:
(1)用細齒麒麟菜飼喂藍子魚；
(2)從藍子魚內(nèi)臟獲得粗酶提取液；
(3)用所述粗酶提取液酶解細齒麒麟菜以獲得原生質(zhì)體。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟(1)中用細齒麒麟菜飼喂藍子魚的時間為7天或更長時間。
[0008]優(yōu)選的，步驟(2)中所述藍子魚內(nèi)臟是藍子魚的胃和/或肝臟。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟(2)中獲得粗酶提取液是由新鮮藍子魚內(nèi)臟在pH值6.0的50HiM磷酸緩鈉鹽緩沖液中冰凍研磨、勻漿和過濾獲得。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟(3)中用粗酶提取液酶解細齒麒麟菜過程中要添加滲透劑和膜穩(wěn)定劑。
[0011]優(yōu)選的，所述滲透劑為甘露醇，所述膜穩(wěn)定劑為氯化鈣。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟(3)用粗酶提取液酶解細齒麒麟菜過程中要添加0.5%的纖維素酶和0.5%的果膠酶，并在酶解過程中保持震蕩。
[0013]優(yōu)選的，所述在酶解過程中保持震蕩為在25°C條件下保持震蕩速度100轉(zhuǎn)/分鐘。震蕩強度過大會造成原生質(zhì)體發(fā)生破裂，制備的效果不好，因此應(yīng)保持輕微震蕩。
[0014]本發(fā)明具體步驟如下:O 利用細齒麒麟菜飼喂雜食性熱帶藍子魚，飼喂時間7天或更長時間，充分誘導(dǎo)藍子魚產(chǎn)生能分解細齒麒麟菜的酶類，備用；
2)取用細齒麒麟菜飼喂后的藍子魚，分離其胃、肝臟等內(nèi)臟，冰凍；然后將冰凍后的藍子魚胃和肝臟切成小塊，置于4攝氏度預(yù)冷的容器和50 mM的磷酸緩鈉鹽緩沖液(pH值
6.0)中，組織勻漿器研磨成勻漿，用不同孔徑的濾紙過濾去除雜質(zhì)，過濾液為可以消化細齒麒麟菜的藍子魚內(nèi)臟酶粗提液；
3)將細齒麒麟菜切成小段，置于組織粉碎器中粉碎至藻泥；然后向其中放入一定比例的藍子魚內(nèi)臟酶粗提液、滲透劑甘露醇和穩(wěn)定劑氯化鈣；同時，上述酶解液中，可添加
0.5%的纖維素酶和0.5%果膠酶，強化分解細齒麒麟菜細胞壁的功能；在25°C條件下，輕微震蕩并充分酶解10-12小時。
[0015]向酶解后的藻泥中，加入3ml洗脫液后放回搖床，繼續(xù)在25°C條件下，震蕩酶解I小時；然后，以細孔徑的篩絹過濾酶解液，將濾液再轉(zhuǎn)入到離心管中，在相對離心力為218g(湘儀TGL-16M)的條件下離心5 min ;棄去離心管中最上層的清液5ml，并向離心管中加入5ml洗脫液混勻，在相對離心力為218g的條件下重復(fù)離心5 min，棄掉上清，向離心管中加入Iml洗脫液， 懸浮后轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管中，即為細齒麒麟菜原生質(zhì)體。
[0016]本發(fā)明方法的優(yōu)點在于:
1、原料易得。藍子魚終生喜食細齒麒麟菜，而且該魚種分布廣、易于獲得，該魚的攝食速度快量大，因此其消化系統(tǒng)內(nèi)有分解該藻的酶類，而且酶活性較強；
2、結(jié)果完整、穩(wěn)定，通過本發(fā)明方法能夠獲得具有完整結(jié)構(gòu)的沒有細胞壁的原生質(zhì)體，為接下來的通過原生質(zhì)體愈合和組織培養(yǎng)途徑，進行種質(zhì)種苗培育奠定良好基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為用藍子魚內(nèi)臟提取液制備的細齒麒麟菜原生質(zhì)體；
圖2為細齒麒麟菜原生質(zhì)體樣品經(jīng)伊文思藍染色后的照片。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附后權(quán)利要求書限定的范圍。
[0019]實施例1，
所需溶液配制:配制50mM pH為6.0的磷酸鈉鹽緩沖液,取lmol/L磷酸二氫鈉4.4ml和lmol/L磷酸氫二鈉0.6ml混勻,用蒸懼水將其定容至100ml,作為忙存液備用。
[0020]消毒培養(yǎng)基配制:取50mg的氯霉素，加入到100mL無菌海水中。
[0021]配制洗脫液:取109.3g甘露醇(0.6M)和554.9mg氯化鈣(5mM)，分別溶入含I升F/2培養(yǎng)基的錐形瓶(2L)中，放入滅菌鍋中，高溫高壓滅菌25min，待冷卻后轉(zhuǎn)入儲液瓶待用。
[0022]實驗材料準(zhǔn)備:取IOg細齒麒麟菜藻體在無菌海水中沖洗干凈，然后用紙巾吸干，并轉(zhuǎn)入含有抗生素的培養(yǎng)基中處理30 min h，再用無菌海水沖洗，利用組織勻漿器將藻體打碎成藻泥，備用。
[0023]藍子魚內(nèi)臟提取液制備:取20只熱帶藍子魚，每天用人工投喂細齒麒麟菜。飼喂一周后，分別選取其胃和肝臟內(nèi)臟，并存放在低溫冰凍條件下備用。將藍子魚的胃和肝臟放入4攝氏度預(yù)冷的小燒杯中，按每克內(nèi)臟加50 mM pH值為6.0的磷酸緩鈉鹽沖液20ml，利用組織勻漿器研磨藍子魚內(nèi)臟，提取液分別用20微米、8微米和I微米的濾紙先后分級過濾。向過濾后的粗提液中添加0.5%的纖維素酶(solarbio)、0.5%的果膠酶(solarbio)、
0.6M的甘露醇和5mM的氯化鈣，備用。
[0024]將藍子魚內(nèi)臟粗提取液酶解:均漿后的藻泥和粗提酶解液按照1:3比例混勻，然后置于搖床上震蕩酶解。酶解過程中采用搖床連續(xù)震蕩，震蕩速度100轉(zhuǎn)/分鐘，酶解溫度25°C。酶解11-12小時后，向其中加入3ml洗脫液，再放回搖床，繼續(xù)按100轉(zhuǎn)/分鐘速度震蕩酶解。I小時后，用500微米的篩絹過濾酶解液，將濾液轉(zhuǎn)入離心管中，在相對離心力為218g (湘儀TGL-16M)的條件下離心5min。棄去離心管中最上層的清液5ml，向沉淀中并加入5ml洗脫液并混勻，在相對離心力為218g條件下離心5min，棄上清，向離心管中加入1ml洗脫液，重新懸浮即為細齒麒麟菜原生質(zhì)體。
[0025]附注1:F/2培養(yǎng)基配制方法:
【權(quán)利要求】
1.一種用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)用細齒麒麟菜飼喂藍子魚； (2)從藍子魚內(nèi)臟獲得粗酶提取液； (3)用所述粗酶提取液酶解細齒麒麟菜以獲得原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述步驟(1)中用細齒麒麟菜飼喂藍子魚的時間為7天或更長時間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，步驟(2)中所述藍子魚內(nèi)臟是藍子魚的胃和/或肝臟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述步驟(2 )中獲得粗酶提取液是由新鮮藍子魚內(nèi)臟在pH值6.0的50 mM磷酸緩鈉鹽緩沖液中冰凍研磨、勻漿和過濾獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述步驟(3)中用粗酶提取液酶解細齒麒麟菜過程中要添加滲透劑和膜穩(wěn)定劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述滲透劑為甘露醇，所述膜穩(wěn)定劑為氯化鈣。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述步驟(3)用粗酶提取液酶解細齒麒麟菜過程中要添加0.5%的纖維素酶和0.5%的果膠酶，并在酶解過程中保持震蕩。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用藍子魚內(nèi)臟提取液制備細齒麒麟菜的原生質(zhì)體的方法，其特征在于，所述在酶解過程中保持震蕩為在25°C條件下保持震蕩速度100轉(zhuǎn)/分鐘。
【文檔編號】C12N5/04GK103966153SQ201310026468
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月24日
【發(fā)明者】劉建國, 李俊鵬, 龐通, 李虎, 林偉 申請人:南通中國科學(xué)院海洋研究所海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心, 中國科學(xué)院海洋研究所