專利名稱：一種可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的豬胚胎培養(yǎng)液及其制備方法
一種可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的豬胚胎培養(yǎng)液及其制備方法[技術(shù)領(lǐng)域]
本發(fā)明涉及動物胚胎體外培養(yǎng)液，尤其涉及一種可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的豬胚胎培養(yǎng)液及其制備方法。[背景技術(shù)]
豬的內(nèi)臟器官大小，生理構(gòu)造和人的最為接近，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因打革E技術(shù)的成熟，能夠有效的消除物種間的免疫排斥反應(yīng)(Lai, L.，Kolber-Simondsb Production of a_l, 3-galactosyItransferase knockout pigs by nuclear transfercloning.Science 295，1089 - 1092)，該動物是人工器官移植的最佳供體因此豬已經(jīng)成為各實驗室的王要動物1旲型，豬體外胚胎的生廣和培養(yǎng)體系也日M完善。體外培養(yǎng)主要包括豬的卵母細胞成熟和胚胎的培養(yǎng)體系。為了確保實驗的效果，實驗中所使用的培養(yǎng)液的成分和培養(yǎng)的環(huán)境(包括溫度，氣體濃度和濕度)，都是盡量模擬母畜生殖道的內(nèi)環(huán)境。但是由于畢竟是模擬的，所以豬的體外培養(yǎng)體系仍不能完全模仿母畜生殖道的內(nèi)環(huán)境，因此體外胚的培養(yǎng)效果與體內(nèi)胚的發(fā)育效果仍然有一定的差距。母畜生殖道內(nèi)的液體成分較為復(fù)雜，含有大量的激素和生長因子，且這些成分并非恒定，或多或少對豬的胚胎的后期發(fā)育有積極地調(diào)控作用，而實驗室常用的培養(yǎng)液成分相對單一，固定，無法完全模擬母畜生殖道內(nèi)的液體成分，這也解釋了為什么動物的克隆效率比較低。因此實驗室內(nèi)常用的培養(yǎng)液還需通過添加或者調(diào)節(jié)生長因子，激素等，使其能最佳模擬自然母畜的生殖道內(nèi)液體，從而使豬胚胎的體外培養(yǎng)體系進一步完善，在實驗室內(nèi)能夠得到足夠多的優(yōu)質(zhì)胚胎，為該動物的后期實驗研究提供好的素材。據(jù)研究，肌醇是一種低分子有機物，最初在肌肉中發(fā)現(xiàn)，后來已在微生物、動物中廣泛發(fā)現(xiàn)。幾乎所有生物都含有游離態(tài)或結(jié)合態(tài)的肌醇。具有類似微生物BI和生物素的作用，是人和動物正常生理功能的調(diào)節(jié)中不能缺少的。有研究表明，在兔自然胚胎的發(fā)育過程中，發(fā)現(xiàn)隨著胚胎的發(fā)育，對肌醇的攝取量呈線性上升，胚胎卵裂時對肌醇的運輸是通過肌醇鈉運輸?shù)鞍讈韺崿F(xiàn)的(Warner，S.Μ.，F(xiàn).V.Conlon, Inositol transport in preimplantation rabbit embryos: effectsof embryo stage, sodium, osmolality and metabolic inhibitors.Reproduction125: 479-493)。肌醇可促進 兔子孤雌胚的卵裂率和囊胚發(fā)育率顯著提高(Mitalipov，S.Μ., K.L.White, Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbitembryos activated with inositol 1,4, 5-trisphosphate.Biol Reprod 60: 821-82)。電激活(激活液里含有肌醇和鈣離子)后，用6-DMAP處理三小時的激活步驟處理兔子的核移植胚胎時，也得到了較高的囊胚率，且胚胎的總細胞計數(shù)多，胚胎凋亡少(Liu，S.Z., Μ.X.Jiang, Parthenogenetic and nuclear transfer rabbit embryo development andapoptosis after activation treatments.Mol Reprod Dev 72: 48-53)。肌醇能夠促進胚胎的后續(xù)發(fā)育，原因可能是激活時候肌醇能夠使重構(gòu)胚的內(nèi)源性鈣離子反復(fù)震蕩，這與其自然受精胚胎的激活原理相似，而添加高濃度的鈣離子只能使重構(gòu)胚的內(nèi)源性鈣離子濃度升高，激活效果下降，繼而影響胚胎的著床和后期發(fā)育(Inoue, K, N.0gonuki, Improvedpostimplantation development of rabbit nuclear transfer embryos by activationwith inositol 1,4,5-trisphosphate.Cloning Stem Cells 4: 311-317)。在牛上，肌醇也表現(xiàn)出可以改善牛胚胎體外發(fā)育能力(Lim, K.T., G.Jang Improved in vitrobovine embryo development and increased efficiency in producing viable calvesusing defined media Theriogenology 67: 293-302)。由于肌醇成分簡單明確，無生物學(xué)危害，說明肌醇也許可以作為豬胚胎培養(yǎng)液的一種添加物。[發(fā)明內(nèi)容]
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于豬胚胎體外培養(yǎng)且可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的培養(yǎng)液。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的豬胚胎培養(yǎng)液，豬胚胎培養(yǎng)液以PZM-3培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在PZM-3培養(yǎng)液中添加有肌醇。作為優(yōu)選，豬胚胎培養(yǎng)液中肌醇的濃度為0.005g/L 0.020g/L。作為優(yōu)選，豬胚胎培養(yǎng)液中肌醇的濃度為0.010g/L。本發(fā)明要解決的另外一個技術(shù)問題是提供一種豬胚胎培養(yǎng)液制備方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，分別取胚胎培養(yǎng)水50mL溶解
0.0096g硫酸鎂和0.1232g乳酸鈣，待完全融合后將二者混合，并按順序加入1.2624g氯化納、0.4212g碳酸氫鈉、0.1492g氯化鉀、0.0096g磷酸二氫鉀、0.0044g丙酮酸鈉、0.0292gL-谷氨酸鈉、0.1092g亞牛磺酸、0.0020g肌醇、0.0132g青霉素G、0.0lOOg鏈霉素、4.0mL氨基酸液、2.0mL非必需氨基酸液、1%。(V/V)酚紅，充分混合均勻后用容量瓶添加超純水定容至200mL,最后添加3mg/mL的BSA,調(diào)pH為7.2 7.4，4°C保存。本發(fā)明的有益效果是:
在PZM-3中添加肌醇，然后用于培養(yǎng)體外生產(chǎn)的豬孤雌胚胎和核移植胚胎，進而建立了與對照組相比，胚胎發(fā)育能力得到提高的培養(yǎng)系統(tǒng)。實驗結(jié)果表明，與對照組培養(yǎng)液(不含肌醇的PZM-3)培養(yǎng)效果對比，當胚胎培養(yǎng)液中添加lOPg/mL肌醇時，能夠顯著提高豬孤雌胚胎的囊胚率(76.1% vs 42.7%，P〈0.05)，且孤雌囊胚總細胞數(shù)目略有提高；添加了肌醇的培養(yǎng)液也能明顯提高豬核移植囊胚所擁有的總細胞數(shù)目(45±21 vs 37± 19，P〈0.05)，說明添加肌醇能夠顯著改善核移植囊胚的質(zhì)量。綜上所述，在胚胎培養(yǎng)液中添加肌醇優(yōu)化了豬體外胚胎的培養(yǎng)條件，這種含有添加劑的培養(yǎng)體系是成功的。本發(fā)明的關(guān)鍵是在普通胚胎培養(yǎng)液(即PZM - 3培養(yǎng)液)中添加了適宜濃度的肌醇(lOPg/mL)，能夠使孤雌胚胎或者核移植胚胎在激活的過程中，幫助內(nèi)源性鈣離子反復(fù)振蕩，模擬了自然受精胚胎時的激活狀態(tài)。胚胎培養(yǎng)液中添加了肌醇后的胚胎發(fā)育狀況優(yōu)于沒有添加前的胚胎，這對于豬胚胎的體外生產(chǎn)和培養(yǎng)，建立良好的動物模型等有重要的意義。[


] 下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
圖1是本發(fā)明一種豬胚胎培養(yǎng)液實施例的流程方框圖。[具體實施方式
]
如圖1所示，本實施例通過以下步驟得以實現(xiàn):體外成熟獲得的發(fā)育到M II期的卵母細胞孤雌得到孤雌胚胎或者通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎，將這些胚胎激活后，移入加有l(wèi)OPg/mL肌醇的胚胎培養(yǎng)液中，置于38.5°C,5% C02，100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第二天觀察卵裂率，第七天取出胚胎，記錄囊胚率，同時用Hoechst 33258染色,記錄囊胚總細胞數(shù)目。最后通過對數(shù)據(jù)進行分析，在PZM-3培養(yǎng)液中添加肌醇是否能夠促進豬的孤雌胚和核移植胚胎的后期發(fā)育，以及是否提高胚胎的質(zhì)量。以下是豬體外胚胎培養(yǎng)過程的具體步驟:
(I )豬卵母細胞成熟液的配制:在基礎(chǔ)液TCM-199(Earle’s salts)中加入10% PFF(豬卵泡液)、5% FBSUOIU/mL PMSGUOIU/mL hCG、10 ng/mL EGF、lOOIU/mL 青霉素和 lOOPg/mL鏈霉素配制而成。( 2 )豬卵母細胞的獲取:將從屠宰場剛摘取的豬卵巢，放入37°C含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，2h內(nèi)運回實驗室；取回的卵巢用酒精噴灑消毒一次，無菌生理鹽水洗漆3遍,然后用配有18號針頭的10 mL 一次性塑料注射器抽取卵巢上2 6 mm直徑的卵泡，將抽取液注入置于38.5°C恒溫水浴鍋中的15mL離心管內(nèi)，抽卵結(jié)束后，將離心管放置在38.5°C恒溫熱臺上靜置15min,讓卵丘卵母細胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte Complexes,COCs)自然沉降；棄除離心管中的上清液，并加入洗卵液(DPBS-0.01% PVA)稀釋沉淀并混勻，在帶有熱臺的體視鏡下?lián)煅杆贀烊∪“|(zhì)均勻，有2層以上且包裹完整的卵丘細胞COCs ；
(3)豬卵母細胞的體外成熟:將獲得的COCs用成熟液洗3遍后轉(zhuǎn)入在38.5°C，5%C02，100%濕度培養(yǎng)箱中平衡4h以上的石蠟油覆蓋的成熟培養(yǎng)滴中培養(yǎng)42 ±2 h，每50 μ L成熟液滴培養(yǎng) 15枚COCs ；
(4 )豬M II期的卵母細胞的獲得:將成熟培養(yǎng)42h后的COCs移入已用37°C預(yù)熱的含I mg/ml Hya透明質(zhì)酸酶的DPBS中，再用移液器輕輕并反復(fù)吹打200次(或3min)左右，之后在鏡下檢查COCs周圍卵丘細胞是否已脫除干凈，將脫完卵丘的卵母細胞移入T2 (含2%FBS的TCM199)液滴洗滌3次，移進礦物油覆蓋的T2滴中；挑選卵周隙明顯，卵細胞膜完整，且排出第一極體的卵母細胞，即為M II期卵母細胞；
(5 )核移植供體細胞的準備:供核細胞采用培養(yǎng)第3 9代胎兒成纖維細胞或耳成纖維細胞體細胞，選擇匯合度在60% 90%的細胞，于顯微操作前I h前，按正常細胞傳代后，并保在4 C冰箱中待用；
(6 )核移植胚胎的制備:用T2洗滌冰箱中準備的體細胞，將挑出的M II卵母細胞和體細胞一起放入顯微操作皿的核移植操作液中，該核移植操作液為HEPES緩沖的含7.5 μ g/mL細胞松馳素B (CB)及2%FBS的TCM199，并將操作皿置于38.5°C恒溫熱臺的顯微操作臺；吸取第一極體及其周圍約1/5 1/4可能含有卵母細胞核的胞質(zhì)，之后用去核針吸取體細胞(直徑約15 20 μ m，折光性強，圓形，光滑的)，從去核切口進入卵母細胞透明帶下注核，輕輕點壓透明帶，使體細胞與胞質(zhì)膜緊密接觸；操作完后將重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到石蠟油覆蓋好的T2液滴中，在38.50C的恒溫箱中中恢復(fù)30min ;將T2中已恢復(fù)好的重構(gòu)卵移入融合/激活液中洗滌3遍，每批10枚放入已經(jīng)鋪滿融合液的融合槽內(nèi)，使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與與電場方向垂直，用CF-150B融合儀(BLS，匈牙利)施加單個156V/mm，100 μ s的直流電脈沖(DC)誘導(dǎo)融合同時電激活，隨后用PZM-3培養(yǎng)液洗滌3遍，立即轉(zhuǎn)入蓋礦物油的PZM-3培養(yǎng)液中，38.5°C, 5% CO2,100%濕度培養(yǎng)I h后取出，在體視顯微鏡下判定融合；將判定融合的胚胎，移入化學(xué)輔助激活液(PZM-3+lOyg /mL CHX+10 μ g/mL CB)激活4h ;
(7 )孤雌胚胎的制備:選取M II期的卵母細胞，用38.5°C預(yù)熱的激活液洗滌3遍，并在其中平衡I 2min ;再將平衡好的卵母細胞移入已經(jīng)鋪滿激活液，電極寬度為1.0mm的融合槽中，用I個156V/mm，100 μ s的DC進行孤雌激活；電激活后，將卵母細胞用PZM-3+10 μ g/mL CHX+10 μ g/mL CB洗滌3 5遍，然后將卵母細胞轉(zhuǎn)移入礦物油覆蓋并預(yù)先在 CO2 培養(yǎng)箱中平 4h 的的 PZM-3+10 μ g/mL CHX+10 μ g/mL CB 液滴內(nèi) 38.5 °C，5% CO2,100% 激活 4h ；
(8 )豬胚胎培養(yǎng)液(以下稱為mPZM-3胚胎培養(yǎng)液)的配制:分別取胚胎培養(yǎng)水50mL溶解0.0096g硫酸鎂和0.1232g乳酸鈣，待完全融合后將二者混合，并按順序加入1.2624g氯化納、0.4212g碳酸氫鈉、0.1492g氯化鉀、0.0096g磷酸二氫鉀、0.0044g丙酮酸鈉、0.0292gL-谷氨酸鈉、0.1092g亞?；撬?、0.0020g肌醇(Myo-1nositol,實驗組添加，對照組不添加)、0.0132g青霉素G、0.0lOOg鏈霉素、4.0mL氨基酸液、2.0mL非必需氨基酸液、l%o(V/V)酚紅，充分混合均勻后用容量瓶添加超純水定容至200mL ;最后，添加3mg/mL的BSA，調(diào)pH為7.2 7.4，4°C保存；
(9 )豬體外胚的胚胎培養(yǎng):將已進行孤雌并激活4h的胚胎或激活后的克隆胚胎，用mPZM-3胚胎培養(yǎng)液洗滌3遍后轉(zhuǎn)入預(yù)平衡4h以上的mPZM_3胚胎培養(yǎng)液內(nèi)，每個培養(yǎng)液50 μ L，移入10 15個胚胎；在38.5 °C，5% CO2,100%濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
(10)胚胎在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h和168 h時后分別記錄卵裂和囊胚情況。通過將本實施例的對照組與實驗組的實驗結(jié)果進行對比，其數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果分別見表I和表2。
表1:在豬的胚胎培養(yǎng)液中添加肌醇(Myo-1nositol)
對豬孤雌胚發(fā)育能力的影響
權(quán)利要求
1.一種可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的豬胚胎培養(yǎng)液，其特征在于，所述豬胚胎培養(yǎng)液以PZM-3培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在PZM-3培養(yǎng)液中添加有肌醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胚胎培養(yǎng)液，其特征在于，所述豬胚胎培養(yǎng)液中肌醇的濃度為 0.005g/L 0.020g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬胚胎培養(yǎng)液，其特征在于，所述豬胚胎培養(yǎng)液中肌醇的濃度為 0.010g/L。
4.一種如權(quán)利要求1所述的豬胚胎培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，分別取胚胎培養(yǎng)水50mL溶解0.0096g硫酸鎂和0.1232g乳酸鈣，待完全融合后將二者混合，并按順序加入1.2624g氯化納、0.4212g碳酸氫鈉、0.1492g氯化鉀、0.00 96g磷酸二氫鉀、0.0044g丙酮酸鈉、0.0292g L-谷氨酸鈉、0.1092g亞?；撬?、0.0020g肌醇、0.0132g青霉素G、0.0lOOg鏈霉素、4.0mL氨基酸液、2.0mL非必需氨基酸液、1%。(V/V)酚紅，充分混合均勻后用容量瓶添加超純水定容至200mL，最后添加3mg/mL的BSAdf pH為7.2 7.4，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可提高豬胚胎體外發(fā)育效率的豬胚胎培養(yǎng)液，其以PZM-3培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并在PZM-3培養(yǎng)液中添加有肌醇。其中，豬胚胎培養(yǎng)液中肌醇的濃度為0.005g/L～0.020g/L；豬胚胎培養(yǎng)液中肌醇的優(yōu)選濃度為0.010g/L。本發(fā)明通過在PZM-3培養(yǎng)液中添加合適濃度的肌醇，能夠使孤雌胚或者核移植胚胎激活的過程中，幫助內(nèi)源性鈣離子反復(fù)振蕩，模擬了自然受精胚胎時的激活狀態(tài)。PZM-3培養(yǎng)液中添加了肌醇后的胚胎發(fā)育狀況優(yōu)于沒有添加前的胚胎，這對于豬胚胎的體外生產(chǎn)和培養(yǎng)，建立良好的動物模型等有重要的意義。
文檔編號C12N5/073GK103074294SQ20131002268
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者張運海, 李運生, 隨劉才, 章孝榮, 方富貴, 楊陽, 劉亞, 曹祖兵 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)