專利名稱：一種仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于固定化酶領(lǐng)域，特別是一種仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的工藝方法。
背景技術(shù)：
固定化酶克服了游離酶難以分離回收的缺點(diǎn)，即酶被固定化后，容易和反應(yīng)物分開，有利于整個(gè)生產(chǎn)過程的控制，在保持酶高效專一的催化活性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了同一批固定化酶的多次重復(fù)使用；具有了較高的熱穩(wěn)定性，避免了某些生產(chǎn)步驟中熱處理造成的酶活損失等問題；長期儲存穩(wěn)定性顯著提高，在一定條件下可以保存較長的時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)酶在生物體外的長期使用；對蛋白酶的抵抗力增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解影響催化功能?？傊?，固定化酶的出現(xiàn)使生物酶在工業(yè)上的自動(dòng)化生產(chǎn)和連續(xù)控制成為可能，同時(shí)在理論方面也為酶促反應(yīng)機(jī)理及動(dòng)力學(xué)的研究提供了良好的模型。在酶的眾多固定化方法中，包埋法以其對生物活性分子失活作用小、不易泄漏及可固定高濃度的生物活性分子等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛的研究和應(yīng)用。包埋法是將含酶菌體或酶包覆在多孔材料中，而使酶得到固定化的方法。根據(jù)載體材料和方法的差異又分為凝膠包埋法和微囊包埋法。凝膠包埋 法是將酶固定在凝膠內(nèi)部的微孔中，制成具有一定形狀的固定化酶。微囊包埋法是將酶固定在各種高分子聚合物制成的空心小球中，從而獲得固定化酶。載體為酶提供天然屏障，將其與環(huán)境隔開，有助于維持酶的原有構(gòu)象，但在反應(yīng)過程中也會(huì)增加底物的傳質(zhì)阻力。材料仿生包括模仿天然生物材料結(jié)構(gòu)特征的結(jié)構(gòu)仿生、模仿生物體中材料形成過程的過程仿生、模仿天然生物材料成分的成分仿生和模擬生物材料和系統(tǒng)功能的功能仿生。隨著材料仿生學(xué)的不斷發(fā)展，固定化酶領(lǐng)域的研究人員也將仿生的思想，特別是結(jié)構(gòu)仿生和過程仿生的思想引入到固定化酶載體這種特殊材料的設(shè)計(jì)和制備中，開發(fā)出了新型的固定化酶載體。相對于傳統(tǒng)溶膠-凝膠技術(shù)中需用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等極性PH條件，仿生硅化過程模擬生物體內(nèi)硅化過程，條件溫和且結(jié)構(gòu)可控。關(guān)于仿生制備納米氧化硅及固定化酶技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道包括文獻(xiàn)1:New Journalof Chemistry, 2006, 30，562-571將脂肪酶分別固定在表面疏水特性不同的MCM-41載體材料、溶膠-凝膠法直接制備的載體材料和溶膠-凝膠過程中加入卵磷脂和胺類物質(zhì)作為承載模板和誘導(dǎo)劑的載體材料中(SMS)，對三種固定化脂肪酶催化水解的特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)由于卵磷脂和胺類的存在為酶分子提供了類似細(xì)胞膜的保護(hù)外層，避免酶分子與二氧化硅組裝表面的接觸，所以SMS固定的脂肪酶表現(xiàn)出的酶活性最高，然而，其催化活性對中長鏈的酯類失去，對短鏈酯類升高，這可能是由于固定化酶的分子構(gòu)象發(fā)生了變化。文獻(xiàn)2 :Journal ofPhysical Chemistry, 2010,114, 2140-2152 米用電子順磁共振技術(shù)(EPR),將電子順磁探頭嵌入脂質(zhì)體層，利用其參數(shù)分析乙醇、十二胺、乳糖和正硅酸乙酯(TEOS)的加入對殼層層流動(dòng)性、結(jié)構(gòu)、次序和探頭周圍電性的影響，發(fā)現(xiàn)模板結(jié)構(gòu)為雙連續(xù)的，乙醇的存在促進(jìn)模板的半融合。文獻(xiàn) 3 :Advanced Synthesis and Catalysis, 2003, 345, 717-728以溶膠-凝膠法固定脂肪酶，并對前驅(qū)體硅烷中烷鏈的長度對酶活影響作出分析，同時(shí)加入添加劑冠狀醚、環(huán)糊精衍生物、氯化鉀和表面活性劑吐溫，對固定化過程進(jìn)行優(yōu)化，選擇合適的添加劑優(yōu)化固定工藝，但未提及對氧化娃的調(diào)控。文獻(xiàn)4 :Enzyme and MicrobialTechnology，2004，34，126-131將正硅酸甲酯(TMOS)和殼聚糖充分混合，TMOS于自然條件下水解，利用溶膠-凝膠過程合成一種新型有機(jī)-無機(jī)雜化載體，結(jié)果表明，所得固定化酶具有良好的多孔微結(jié)構(gòu)，較游離酶具有較高的熱穩(wěn)定性和操作在穩(wěn)定性，但該研究制備的是氧化娃粒子且未能對氧化娃形貌加以調(diào)控。文獻(xiàn)5 :Dalton Transactions, 2010, 39,8511-8520將酶溶液加入卵磷脂、十二胺、正硅酸乙酯(TEOS)的混合液中，實(shí)現(xiàn)對葡萄糖氧化酶(GOx)辣根過氧化物酶(HRP)的共固定，構(gòu)建雙酶體系，該方法制備的氧化硅并非納米囊，也未涉及納米囊的調(diào)控。文獻(xiàn) 6 :Organic Process Research&Development, 2009,13,584-589此文獻(xiàn)介紹了一種快速高效的固定化腈水解酶的方法，將正硅酸甲酯(TMOS)水解液加入聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)與腈水解酶的混合液中，PAMAM誘導(dǎo)硅酸脫水形成二氧化硅納米顆粒，通過對游離酶與固定化酶米氏常數(shù)、活性等的測定，發(fā)現(xiàn)固定化酶性能與游離酶相近，且能夠多次重復(fù)利用；該方法采用了仿生制備的方法，但制備的固定化酶并非微囊固定化。以上相關(guān)文獻(xiàn)所述制備氧化硅固定化酶技術(shù)，溶膠-凝膠過程均發(fā)生在酶溶液中，硅烷水解所形成的醇類易對酶分子活性位點(diǎn)造成破壞，降低酶活回收率，而且多數(shù)制備的是氧化硅粒子而非納米微囊。因此探究一種方法制備氧化硅納米微囊，保護(hù)酶分子在溶膠-凝膠過程免受破壞極為重要。文獻(xiàn)中還未有在通過仿生法制備氧化硅納米微囊的報(bào)道，且未見通過調(diào)控脂質(zhì)體模板來調(diào)控氧化硅納米微囊大小的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于仿生硅化的理念，首先將酶包裹于脂質(zhì)體納米微囊中，然后以脂質(zhì)體納米微囊為模板在誘導(dǎo)劑聚二甲基二烯丙基銨(PDADMA)的作用下，正硅酸甲酯(TMOS)水解液在脂質(zhì)體表面脫水形成氧化硅殼層(此為仿生硅化過程)，完全避免了酶與硅前驅(qū)體的直接接觸，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了固定化酶保持較高活性的目的。同時(shí)，以脂質(zhì)體納米微囊為模板可實(shí)現(xiàn)形貌可控的氧化硅微粒的制備，最后利用低濃度表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚去除脂質(zhì)體模板。

在此包埋過程中，首先實(shí)現(xiàn)了酶與復(fù)雜包埋環(huán)境的分離，避免酶分子與硅烷醇間形成共價(jià)鍵，有效的保持了酶活，脂質(zhì)體模板的存在實(shí)現(xiàn)了對載體形貌控制，同時(shí)去除模板實(shí)現(xiàn)了對傳質(zhì)的優(yōu)化。本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的方法，包括以下步驟(I)脂質(zhì)體模板的制備將卵磷脂和膽固醇加入到氯仿中形成a溶液，得到的a溶液中的卵磷脂和膽固醇濃度分別為50mg/mL和12. 5mg/mL ;取上述a溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至將氯仿除盡，在反應(yīng)器上形成均勻透明的薄膜；再加入0. 2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液使薄膜溶解，經(jīng)超聲分散2h，得到終濃度為18. 75mg/mL脂質(zhì)體溶液；(2)包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體微囊的制備取上述脂質(zhì)體溶液，在劇烈震蕩的情況下緩慢滴加誘導(dǎo)劑，其中，誘導(dǎo)劑濃度為2mg/mL，滴加量為脂質(zhì)體溶液體積的15%_40% ;震蕩5min后,用蒸懼水離心洗漆，除去游離的誘導(dǎo)劑和未包埋的游離酶；最后用0. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液將包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體配成濃度為18. 75mg脂質(zhì)體/mL的乳濁液；(3)氧化硅殼層的制備在劇烈震蕩的情況下向上步得到的乳濁液緩慢滴加濃度為54. 82mmol/L的硅醇溶液，滴加完畢后繼續(xù)緩慢搖動(dòng)O. 5-1. 0h，然后用蒸餾水離心洗滌，最后離心分離，得包覆葡萄糖氧化酶的氧化硅納米微囊；其中，54. 82mmol/L的硅醇溶液為TMOS水解所得，滴加量為脂質(zhì)體溶液體積的40%-60% ；(4)去除模板將氧化硅納米微囊浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中，所取聚乙二醇辛基苯基醚溶液體積為步驟(2)所取脂質(zhì)體溶液體積的3倍；30min后用蒸餾水洗滌，直至加入蒸餾水后晃動(dòng)無白色泡沫出現(xiàn)；然后離心分離，所得固體為除去模板后包裹酶的二氧化硅納米微囊。所述步驟(1)中的脂質(zhì)體溶液和步驟(2)中乳濁液中脂質(zhì)體的濃度為不計(jì)算制備過程中損失脂質(zhì)體的理論量。所述步驟(2)中的0. lmol/L、pH7磷酸鹽緩沖溶液為O.1mol Na2HP04/L溶液和O. lmolNaH2P04/L 溶液以1:1 混合；所述步驟(2)中的誘導(dǎo)劑為PDADMA。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明制備固定化酶的方法，包埋率可達(dá)50%左右，避免了溶膠-凝膠法造成的游離酶的大量浪費(fèi)，從而降低了固定成本；2.所得固定化酶大小分布均勻，粒徑在200nm左右。3.本發(fā)明反應(yīng)主要涉及水相，安全無污染。4.本發(fā)明的制備工藝簡單，條件溫和，酶活回收率高達(dá)71.8%。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的卵磷脂、膽固醇購自于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。本發(fā)明所用的PDADMA購自sigma公司。本發(fā)明所用的TMOS購自于天津市化學(xué)試劑研究所。本發(fā)明所用的葡萄糖氧化酶購于sigma公司。本發(fā)明所述葡萄糖氧化酶溶液以0. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液配置，濃度為O. 2mg葡萄糖氧化酶/mL。本發(fā)明所述PDADMA 以0. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液配置，濃度為2mg PDADMA/mL。本發(fā)明所述硅醇溶液將一定量正硅酸甲酯TMOS加入蒸餾水中，并滴加少許O. lmol/L的鹽酸緩沖液，靜止片刻待其完全水解，得濃度為54. 82mmol/L的硅醇溶液，并將其PH矯正為7。本發(fā)明所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液取0. 3g聚乙二醇辛基苯基醚，補(bǔ)加蒸餾水直至總質(zhì)量為100g。 本發(fā)明所述0. lmol/L、pH7磷酸鹽緩沖溶液0.1mol Na2HP04/L的和0.1molNaH2P04/L溶液以1:1混合，用pH計(jì)校正。本發(fā)明中所述酶活回收率為所得固定化酶實(shí)際酶活與理論酶活之比。實(shí)例1:
取O. 4g卵磷脂和O.1g膽固醇溶于8mL氯仿中形成a液。取1. 5mL a液于IOOmL圓底燒瓶中，在37° C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑氯仿，直至瓶壁上形成均勻透明薄膜。向上述圓底燒瓶中加入5mL葡萄糖氧化酶溶液(以O(shè). lmol/L、pH7的磷酸緩沖液配置，濃度為O. 2mg葡萄糖氧化酶/mL)，超聲分散2h，此時(shí)內(nèi)壁上薄膜全部脫落，燒瓶內(nèi)得到脂質(zhì)體溶液(18. 75mg/mL，脂質(zhì)體質(zhì)量以加入的卵磷脂和膽固醇質(zhì)量計(jì)算，且不計(jì)算制備過程中的損失的理論量)。取上述脂質(zhì)體溶液ImL裝于2mL離心管中；上述樣品于漩渦振蕩器震蕩，同時(shí)緩慢滴加150 μ L PDADMA (15滴/min)，滴加完畢后繼續(xù)震蕩5min，用蒸餾水離心洗滌5次，除去游離的PDADMA和未包埋的游離酶；最后補(bǔ)加O. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液，使包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體濃度為18. 75mg脂質(zhì)體/mL (忽略離心過程中脂質(zhì)體的損失)。該樣品在劇烈震蕩的情況下繼續(xù)滴加O. 5mL濃度為54. 82mmol/L硅醇溶液，滴加完畢后繼續(xù)緩慢搖動(dòng)lh，用蒸餾水離心洗滌5次，除去未硅化的硅醇溶液，最后離心分離得包覆葡萄糖氧化酶的氧化硅納米微囊，由掃描電鏡SM分析可知粒徑分布在200nm左右。將所得到的以脂質(zhì)體為模板制得的氧化硅微囊浸泡于3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液(TritonX-100)中，30min后用蒸餾水離心洗滌5次。此時(shí)離心所得固體為除去模板后包裹酶的二氧化硅微囊1. 4mg (冷凍干燥后稱干重)。本發(fā)明中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為34. 9%ο實(shí)例2 取O. 4g卵磷脂和O.1g膽固醇溶于8mL氯仿中形成a液。取1. 5mL a液于IOOmL圓底燒瓶中，在37° C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑氯仿，直至瓶壁上形成均勻透明薄膜。向上述圓底燒瓶中加入5mL葡萄糖氧化酶溶液( 以O(shè). lmol/L、pH7的磷酸緩沖液配置，濃度為O. 2mg葡萄糖氧化酶/mL)，超聲分散2h，此時(shí)內(nèi)壁上薄膜全部脫落，燒瓶內(nèi)得到脂質(zhì)體溶液(18. 75mg/mL，脂質(zhì)體質(zhì)量以加入的卵磷脂和膽固醇質(zhì)量計(jì)算，且不計(jì)算制備過程中的損失的理論量)。取上述脂質(zhì)體溶液ImL裝于2mL離心管中；上述樣品于漩渦振蕩器震蕩，同時(shí)緩慢滴加150 μ L PDADMA (15滴/min)，滴加完畢后繼續(xù)震蕩5min，用蒸餾水離心洗滌5次，除去游離的PDADMA和未包埋的游離酶；最后補(bǔ)加O. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液，使包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體濃度為18. 75mg脂質(zhì)體/mL (忽略離心過程中脂質(zhì)體的損失)。該樣品在劇烈震蕩的情況下繼續(xù)滴加0. 6mL濃度為54. 82mmol/L硅醇溶液，滴加完畢后繼續(xù)緩慢搖動(dòng)lh，用蒸餾水離心洗滌5次，除去未硅化的硅醇溶液，最后離心分離得包覆葡萄糖氧化酶的二氧化硅納米微囊，由掃描電鏡SEM分析可知粒徑分布在200nm左右。將所得到的以脂質(zhì)體為模板制得的氧化硅微囊浸泡于3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液(TritonX-100)中，30min后用蒸餾水離心洗滌5次。此時(shí)離心所得固體為除去模板后包裹酶的氧化硅微囊1.9mg(冷凍干燥后稱干重)。本發(fā)明中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為47. 1%。實(shí)例3 取0. 4g卵磷脂和0.1g膽固醇溶于8mL氯仿中形成a液。取1. 5mL a液于IOOmL圓底燒瓶中，在37° C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑氯仿，直至瓶壁上形成均勻透明薄膜。向上述圓底燒瓶中加入5mL葡萄糖氧化酶溶液(以O(shè). lmol/L、pH7的磷酸緩沖液配置，濃度為
O.2mg葡萄糖氧化酶/mL)，超聲分散2h，此時(shí)內(nèi)壁上薄膜全部脫落，燒瓶內(nèi)得到脂質(zhì)體溶液(18. 75mg/mL，脂質(zhì)體質(zhì)量以加入的卵磷脂和膽固醇質(zhì)量計(jì)算，且不計(jì)算制備過程中的損失的理論量)。取上述脂質(zhì)體溶液ImL裝于2mL離心管中；上述樣品于漩渦振蕩器震蕩，同時(shí)緩慢滴加180 μ L PDADMA (15d/min)，滴加完畢后繼續(xù)震蕩5min，用蒸餾水離心洗滌5次，除去游離的PDADMA和未包埋的游離酶；最后補(bǔ)加O. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液，使包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體濃度為18. 75mg脂質(zhì)體/mL (忽略離心過程中脂質(zhì)體的損失)。該樣品在劇烈震蕩的情況下繼續(xù)滴加O. 6mL濃度為54. 82mmol/L硅醇溶液，滴加完畢后繼續(xù)緩慢搖動(dòng)lh，用蒸餾水離心洗滌5次，除去未硅化的硅醇溶液，最后離心分離得包覆葡萄糖氧化酶的氧化硅納米微囊，由掃描電鏡SM分析可知粒徑分布在200nm左右。將所得到的以脂質(zhì)體為模板制得的氧化硅微囊浸泡于3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)O. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液(TritonX-100)中，30min后用蒸餾水離心洗滌5次。此時(shí)離心所得固體為除去模板后包裹酶的二氧化硅微囊2.1mg(冷凍干燥后稱干重)。本發(fā)明中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為52. 6%。實(shí)例4 取O. 4g卵磷脂和O.1g膽固醇溶于8mL氯仿中形成a液。取1. 5mL a液于IOOmL圓底燒瓶中，在37° C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑氯仿，直至瓶壁上形成均勻透明薄膜。向上述圓底燒瓶中加入5mL葡萄糖氧化酶溶液(以O(shè). lmol/L、pH7的磷酸緩沖液配置，濃度為
O.2mg葡萄糖氧化酶/mL)，超聲分散2h，此時(shí)內(nèi)壁上薄膜全部脫落，燒瓶內(nèi)得到脂質(zhì)體溶液(18. 75mg/mL，脂質(zhì)體質(zhì)量以加入的卵磷脂和膽固醇質(zhì)量計(jì)算，且不計(jì)算制備過程中的損失的理論量)。取上述脂質(zhì)體溶液ImL裝于2mL離心管中；上述樣品于漩渦振蕩器震蕩，同時(shí)緩慢滴加200 μ L PDADMA (15d/min)，滴加完畢后繼續(xù)震蕩5min，用蒸餾水離心洗滌5次，除去游離的PDADMA和未包埋 的游離酶；最后補(bǔ)加O. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液，使包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體濃度為18. 75mg脂質(zhì)體/mL (忽略離心過程中脂質(zhì)體的損失)。該樣品在劇烈震蕩的情況下繼續(xù)滴加0. 6mL濃度為54. 82mmol/L硅醇溶液，滴加完畢后繼續(xù)緩慢搖動(dòng)lh，用蒸餾水離心洗滌5次，除去未硅化的硅醇溶液，最后離心分離得包覆葡萄糖氧化酶的氧化硅納米微囊，由掃描電鏡SM分析可知粒徑分布在200nm左右。將所得到的以脂質(zhì)體為模板制得的氧化硅微囊浸泡于3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液(TritonX-100)中，30min后用蒸餾水離心洗滌5次。此時(shí)離心所得固體為除去模板后包裹酶的氧化硅微囊2. 2mg(冷凍干燥后稱干重)。本發(fā)明中采用過氧化氫的釋放速率來表示酶活，而過氧化氫的含量通過辣根過氧化物酶/4-氨基安替吡啉/苯酚催化體系，由分光光度法，在波長500nm處測得，得到酶活回收率為71. 8%。
權(quán)利要求
1.一種仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的方法，其特征為包括以下步驟(1)脂質(zhì)體模板的制備將卵磷脂和膽固醇加入到氯仿中形成a溶液，得到的a溶液中的卵磷脂和膽固醇濃度分別為50mg/mL和12. 5mg/mL ;取上述a溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至將氯仿除盡，在反應(yīng)器上形成均勻透明的薄膜；再加入O. 2mg/mL葡萄糖氧化酶溶液使薄膜溶解，經(jīng)超聲分散2h，得到終濃度為18. 75mg/mL脂質(zhì)體溶液；(2)包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體微囊的制備取上述脂質(zhì)體溶液，在劇烈震蕩的情況下緩慢滴加誘導(dǎo)劑，其中，誘導(dǎo)劑濃度為2mg/mL，滴加量為脂質(zhì)體溶液體積的15%_40% ;震蕩5min后，用蒸餾水離心洗滌，除去游離的誘導(dǎo)劑和未包埋的游離酶；最后用O. lmol/L、pH7的磷酸緩沖液將包覆誘導(dǎo)劑的脂質(zhì)體配成濃度為18. 75mg脂質(zhì)體/mL的乳濁液；(3)氧化硅殼層的制備在劇烈震蕩的下向上步得到的乳濁液緩慢滴加硅醇溶液，滴加完畢后繼續(xù)緩慢搖動(dòng)O. 5-1. 0h，然后用蒸餾水離心洗滌，最后離心分離，得包覆葡萄糖氧化酶的氧化娃納米微囊；其中，硅醇溶液濃度為54. 82mmol/L，滴加量為脂質(zhì)體溶液體積的40%_60% ；(4)去除模板將氧化硅納米微囊浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)O.3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液中，所取聚乙二醇辛基苯基醚溶液體積為步驟(2)所取脂質(zhì)體溶液體積的3倍；30min后用蒸餾水洗滌，直至加入蒸餾水后晃動(dòng)無白色泡沫出現(xiàn)；然后離心分離，所得固體為除去模板后包裹酶的氧化硅納米微囊。
2.如權(quán)利要求1所述的仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的方法，其特征為所述步驟(2)中的 O. lmol/L、pH7 磷酸鹽緩沖溶液為 O.1mol Na2HP04/L 溶液和 O.1mol NaH2PO4/!溶液以1:1混合。
3.如權(quán)利要求1所述的仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的方法，其特征為所述步驟(2)中的誘導(dǎo)劑為PDADMA。
全文摘要
本發(fā)明是一種仿生制備氧化硅納米微囊固定化酶的工藝方法。該方法首先將酶包裹于脂質(zhì)體納米微囊中，然后以脂質(zhì)體納米微囊為模板在誘導(dǎo)劑聚二甲基二烯丙基銨的作用下，正硅酸甲酯水解液在脂質(zhì)體表面脫水形成氧化硅殼層，完全避免了酶與硅前驅(qū)體的直接接觸，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了固定化酶保持較高活性的目的。同時(shí)，以脂質(zhì)體納米微囊為模板可實(shí)現(xiàn)形貌可控的氧化硅納米微囊的制備，最后利用低濃度表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚去除脂質(zhì)體模板。本發(fā)明制備固定化酶的方法，包埋率可達(dá)50%左右，避免了溶膠-凝膠法造成游離酶的大量浪費(fèi)，從而降低了固定成本；反應(yīng)主要涉及水相，安全無污染；制備工藝簡單，條件溫和，酶活回收率高達(dá)71.8%。
文檔編號C12N11/14GK103060306SQ20131000450
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者姜艷軍, 朱亞男, 高靜, 戴舒, 張煒 申請人:河北工業(yè)大學(xué)