檢測沙門氏菌屬微生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的沙門氏菌屬微生物的組合物。所述組合物包含抑制革蘭氏陽性微生物的生長的至少一種第一選擇劑、包含被沙門氏菌屬微生物轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物的至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和包含被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物的第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)。任選地，所述組合物可包括第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)包含被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測產(chǎn)物的第三區(qū)別性指示劑化合物。還提供了使用所述化合物來檢測沙門氏菌屬微生物的方法。
【專利說明】檢測沙門氏菌屬微生物的方法
[0001] 相關申請的奪叉引用
[0002] 本專利申請要求提交于2011年12月28日的美國臨時專利申請No. 61/580,849 的權(quán)益，該專利申請以引用的方式全文并入本文。

【背景技術(shù)】
[0003] 腸桿菌科（Enterobacteriaceae)包括能夠?qū)⑻穷悾ɡ?，葡萄糖）發(fā)酵為乳酸 和/或其他酸性終產(chǎn)物的很多種代謝上不同的、兼性厭氧的細菌。該科包括多種熟知的 人類致病菌，諸如大腸桿菌（Escherichia coli)、沙門氏菌屬的若干亞種、鼠疫耶爾森菌 (Yersinia pestis)、克雷伯氏菌屬（Klebsiella)的若干菌種和志賀氏菌屬（Shigella)的 若干菌種。
[0004] 沙門氏菌屬包括兩個物種，腸道沙門氏菌（S. enterica)和邦戈爾沙門氏菌 (S. bongori)，其包括能夠?qū)е氯祟惣膊〉膩喎N。一些病原性沙門氏菌能夠通過受污染的食 物或飲料的攝取而傳染至人類。由于樣品中相對低數(shù)量的沙門氏菌屬微生物的存在、樣品 中相對高數(shù)量的近緣的非沙門氏菌屬腸道微生物的存在和/或樣品中能夠干擾沙門氏菌 屬微生物的生長或檢測的非微生物的物質(zhì)（例如，食物顆?；蚩扇苄曰瘜W物質(zhì)）的存在，食 品樣品中沙門氏菌屬微生物的檢測能夠是困難的。
[0005] 已開發(fā)了多種選擇性的和/或區(qū)別性的微生物培養(yǎng)基，以檢測樣品中的沙門氏菌 屬微生物并且將它們與一種或多種非沙門氏菌屬微生物加以區(qū)分。通常，這些培養(yǎng)基包含 抑制非腸道微生物的生長的選擇劑。此外，許多這些培養(yǎng)基依靠一種或多種區(qū)別性指示劑 系統(tǒng)來區(qū)分沙門氏菌屬和非沙門氏菌屬的微生物。
[0006] 盡管有多種用于檢測樣品中沙門氏菌屬微生物的微生物培養(yǎng)基，仍然存在對檢測 樣品中沙門氏菌屬微生物的改進的方法的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] -般來講，本公開涉及用于檢測沙門氏菌屬微生物在試驗樣品中的存在或不存在 的組合物和方法。具體地，所述組合物有利于沙門氏菌屬微生物的生長并且包含至少一種 抑制革蘭氏陽性微生物的生長的選擇劑。此外，所述組合物包括至少兩種區(qū)別性指示劑系 統(tǒng)。區(qū)別性指示劑系統(tǒng)中的至少一種陽性地區(qū)分沙門氏菌屬微生物與非沙門氏菌屬微生 物，并且區(qū)別性指示劑系統(tǒng)中的至少一種陰性地區(qū)分沙門氏菌屬微生物與非沙門氏菌屬微 生物。
[0008] 在一個方面，本公開提供了組合物。所述組合物能夠包含半固體培養(yǎng)基，所述半固 體培養(yǎng)基包含膠凝劑、抑制革蘭氏陽性微生物的生長的至少一種第一選擇劑、包含至少一 種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和包含被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢 測產(chǎn)物的第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)。第一區(qū)別性指示劑化合物能 夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在 所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生 物的多個屬轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。
[0009] 在所述組合物的任何實施例中，第一區(qū)別性指示劑化合物能夠包含選自蜜二糖、 2_脫氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麥芽糖、L-鼠李糖、海藻糖、D-木糖、 山梨糖醇以及上述化合物中的任何兩種或更多種的組合的化合物。在任何上述實施例中， 所述組合物還能夠包含緩沖劑。所述緩沖劑能夠選自MOPS、磷酸鹽、TES、HEPES以及它們的 組合。
[0010] 在任何上述實施例中，所述組合物還能夠包括第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第三 區(qū)別性指示劑系統(tǒng)包含被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測產(chǎn)物的第三區(qū)別性指示 劑化合物。在任何實施例中，第三區(qū)別性指示劑化合物能夠包含顯色酶底物。在任何實 施例中，第三區(qū)別性指示劑化合物能夠選自5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、 5-溴_6_氯_3_ Π 引哚基-β -D-半乳糖苷、鄰-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、對-硝基苯 基-β -D-半乳糖苷、3, 4-環(huán)己酮七葉苷-β -D-半乳糖苷和6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳 糖苷。
[0011] 在任何上述實施例中，所述至少一種第一選擇劑能夠選自膽汁鹽、膽酸、脫氧膽 酸、結(jié)晶紫或上述化合物中任何兩種或更多種的組合。在任何上述實施例中，所述pH指示 劑能夠選自酚紅、氯酚紅、中性紅、溴百里酚藍和溴百里酚紫。
[0012] 在任何上述實施例中，所述組合物還能夠包含至少一種第二選擇劑，所述第二選 擇劑抑制至少一種不是沙門氏菌屬成員的革蘭氏陰性腸道微生物的生長。所述至少一種第 二選擇劑能夠選自內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖甙類抗生素、喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生 素、多粘菌素抗生素以及上述抗生素中的任何兩種或更多種的組合；其中所述至少一種第 二選擇劑的濃度被選擇為允許沙門氏菌屬微生物的生長。在任何上述實施例中，所述膠凝 劑選自瓊脂、瓊脂糖、果膠、明膠、瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、 聚乙烯醇、褐藻膠以及上述膠凝劑中的任何兩種或更多種的組合。
[0013] 在另一個方面，本公開提供了檢測沙門氏菌屬微生物的方法。所述方法能夠包括 提供試驗樣品、培養(yǎng)裝置和上述實施例中任何一個的組合物；在所述培養(yǎng)裝置中使所述組 合物與試驗樣品接觸，以形成經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置；孵育經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第一時間長度； 以及觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測第一可檢測產(chǎn)物，其中所述第一可檢測產(chǎn)物是沙門氏菌屬微 生物的存在的第一指示。
[0014] 在所述方法的任何實施例中，檢測第一可檢測產(chǎn)物能夠包括觀察pH指示劑與由 細菌產(chǎn)生的酸性化合物的反應。在任何實施例中，所述方法還能夠包括觀察所述營養(yǎng)物質(zhì) 培養(yǎng)基以檢測第二可檢測產(chǎn)物，其中所述第二可檢測產(chǎn)物指示非沙門氏菌屬的微生物的存 在。檢測第二可檢測產(chǎn)物能夠包括觀察pH指示劑與由細菌產(chǎn)生的堿性化合物的反應。在 任何實施例中，所述方法還能夠包括觀察所述營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基以檢測第三可檢測產(chǎn)物，其 中所述第三可檢測產(chǎn)物指示非沙門氏菌屬的微生物的存在。檢測第三可檢測產(chǎn)物能夠包括 檢測由β-半乳糖苷酶活性產(chǎn)生的有色產(chǎn)物。
[0015] 在任何上述實施例中，所述方法還能夠包括提供具有能夠被沙門氏菌屬微生物代 謝為第四可檢測產(chǎn)物的驗證性指示劑化合物的制品，其中所述第四可檢測產(chǎn)物能夠與第一 可檢測產(chǎn)物、第二可檢測產(chǎn)物和第三可檢測產(chǎn)物（當存在時）相區(qū)分；使所述制品與所述培 養(yǎng)基接觸；孵育所述裝置第二時間長度；以及觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測第四可檢測產(chǎn)物； 其中檢測到所述第四可檢測產(chǎn)物與所述第一可檢測產(chǎn)物一起存在是沙門氏菌屬微生物在 樣品中存在的第二指示。
[0016] 在任何上述實施例中，所述方法還能夠包括對第一類型的微生物的多個菌落進行 計數(shù)。在任何實施例中，所述方法還能夠包括對第二類型的微生物的多個菌落進行計數(shù)。 在本發(fā)明的方法的任何實施例中，觀察培養(yǎng)裝置能夠包括視覺上觀察所述培養(yǎng)裝置。在本 發(fā)明的方法的任何實施例中，觀察培養(yǎng)裝置能夠包括使用成像裝置生成所述培養(yǎng)裝置的圖 像。在任何實施例中，所述方法還能夠包括使用處理器分析所述圖像。
[0017] 詞語"優(yōu)選的"和"優(yōu)選地"是指在某些情況下可以提供某些有益效果的本發(fā)明實 施例。然而，在相同的情況或其它情況下，其它實施例也可以是優(yōu)選的。此外，對一個或多 個優(yōu)選實施例的表述并不暗示其它實施例不是可用的，并且并非意圖從本發(fā)明的范圍中排 除其它實施例。
[0018] 如本文所用，"沙門氏菌屬微生物"是指屬于沙門氏菌屬的任何微生物。
[0019] 如本文所用，"區(qū)別性指示劑系統(tǒng)"是指基于微生物各自將至少一種化合物（本 文稱為"區(qū)別性指示劑化合物"）轉(zhuǎn)化為可檢測產(chǎn)物的能力，被用于區(qū)分兩種類型的微生 物的一種或多種化合物。在一些情況下，例如，區(qū)別性指示劑化合物（例如，2-硝基苯 基-β -D-半乳糖苷）可被一種類型的微生物直接轉(zhuǎn)化為可檢測產(chǎn)物（例如，2-硝基苯酚）。 在一些情況下，例如，區(qū)別性指示劑化合物（例如，5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-a -D-半乳糖 苷）可以被一種類型的微生物轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物在空氣的存在下能夠反應生成可 檢測產(chǎn)物（一種類型的靛藍染料）。在一些情況下，例如，區(qū)別性指示劑化合物（例如，可發(fā) 酵的碳水化合物諸如蜜二糖）能夠被一種類型的微生物轉(zhuǎn)化為可檢測產(chǎn)物（例如，乳酸）， 其能夠與區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的另一組分（例如，pH指示劑如氯酚紅）反應，導致另一組分 中可檢測的顏色變化。
[0020] 當術(shù)語"包括"及其變型形式出現(xiàn)在說明書和權(quán)利要求書中時，這些術(shù)語并不具有 限制性含義。
[0021] 本文所用的"一種（個）"、"所述（該）"、"至少一種（個）"以及"一種或多種（一 個或多個）"可互換使用。因此，例如，微生物可以解釋為意指"一種或多種"微生物。
[0022] 術(shù)語"和/或"意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或多個的組 合。
[0023] 另外，本文通過端點表述的數(shù)值范圍包括范圍內(nèi)包含的所有數(shù)值（如，1至5包括 1、1·5、2、2·75、3、3· 80、4、5 等）。
[0024] 本發(fā)明的上述
【發(fā)明內(nèi)容】
并不意在描述本發(fā)明的每個公開的實施例或每種實施方 式。以下描述更具體地例示了示例性實施例。在本專利申請全文的若干地方，通過例子列表 提供指導，例子可用于多種組合中。在每一種情形下，所列舉的列表僅僅作為代表性群組， 而不應被理解為排他性列表。
[0025] 下面將結(jié)合附圖和【具體實施方式】介紹上述及其他實施例的更多細節(jié)。通過具體實 施方式、附圖和權(quán)利要求書，其他特征、目標和優(yōu)點將變得明顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1示出根據(jù)本公開的檢測沙門氏菌屬微生物的方法的一個實施例的框圖。
[0027] 圖2示出用于解釋通過使用圖1中顯示的方法獲得的結(jié)果的流程圖的一個實施例 的框圖。

【具體實施方式】
[0028] 沙門氏菌屬包括兩個物種，腸道沙門氏菌（Salmonella enterica)和邦戈爾沙門 氏菌（Salmonella bongori) QFookes等人已研究了這兩個物種的遺傳相關性（"Salmonella bongori Provides Insights into the Evolution of the Salmonellae，'（邦戈爾沙門氏 菌提供了對沙門氏菌的進化的深入了解），PL0s Pathogens, www. plospathogens. org，2011 年，第7卷，文章編號el002191，第1-16頁，該文獻全文以引用方式并入本文）。盡管腸道 沙門氏菌的亞種由于它們感染和導致人類疾病的能力而比邦戈爾沙門氏菌更加有名，邦戈 爾沙門氏菌（S. bongori)也已被顯示導致人類的感染。因此，被設計為檢測潛在的病原性 沙門氏菌屬微生物的測試應當能夠同時檢測兩種物種。
[0029] 本公開一般涉及用于檢測樣品中沙門氏菌屬微生物的方法。具體地，本公開涉及 能夠區(qū)分沙門氏菌屬微生物與非沙門氏菌屬微生物（例如，大腸桿菌以及腸桿菌科的其他 成員）的組合物和基于生長的檢測方法。本發(fā)明的方法結(jié)合了包含多種區(qū)別性指示劑的選 擇性生長培養(yǎng)基。任選地，所述方法能夠使用升高的孵育溫度來區(qū)分邦戈爾沙門氏菌微生 物與非沙門氏菌屬的產(chǎn)β -D-半乳糖苷酶的微生物。
[0030] 沙門氏菌屬的基于生長的檢測和鑒定一般要求使用在非沙門氏菌屬微生物的存 在下特異性地檢測沙門氏菌屬菌株的生物化學反應。遺憾的是，大多數(shù)常規(guī)的檢測系統(tǒng)不 能提供足夠區(qū)分沙門氏菌屬微生物與可能存在于樣品中的非沙門氏菌屬的腸桿菌科微生 物的特異性。這些測試經(jīng)常需要附加的試劑和流程（例如免疫學或基因檢測）來區(qū)分樣品 中存在的非沙門氏菌屬微生物與沙門氏菌屬微生物。
[0031] 遺憾的是，一些常用于檢測非沙門氏菌屬的腸道微生物（例如，大腸桿菌）的組的 反應并不陰性地區(qū)分全部的沙門氏菌屬菌株。例如，有一些沙門氏菌屬微生物具有利用某 些化合物（例如，蜜二糖、2-脫氧-D-核糖、半乳糖醇、海藻糖）作為碳和/或能量源的代 謝能力。在利用這些化合物的過程中，沙門氏菌屬微生物可產(chǎn)生可檢測的終產(chǎn)物（即，有機 酸）。因此，用于檢測這些化合物的利用的指示劑系統(tǒng)能夠被用于檢測沙門氏菌屬微生物在 試驗樣品中的存在。大多數(shù)其他微生物不具有相同的代謝能力。然而，一些非沙門氏菌屬 的革蘭氏陰性腸道微生物可能具有利用這些化合物的能力。因此，希望包括至少一種其他 指示劑系統(tǒng)來區(qū)分非沙門氏菌微生物與沙門氏菌屬微生物。其他一種或多種指示劑系統(tǒng)可 用于陽性地區(qū)分沙門氏菌屬微生物與非沙門氏菌屬微生物（即，沙門氏菌屬微生物一般與 所述指示劑系統(tǒng)反應而非沙門氏菌屬微生物一般不與所述指示劑系統(tǒng)反應），或者可用于 陰性地區(qū)分沙門氏菌屬微生物與非沙門氏菌屬微生物（即，沙門氏菌屬微生物一般不與所 述指示劑系統(tǒng)反應而非沙門氏菌屬微生物一般與所述指示劑系統(tǒng)反應）。
[0032] 本公開的發(fā)明性組合物包括至少兩種區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，其允許操作者執(zhí)行辨別 (即，區(qū)分）沙門氏菌屬微生物與至少兩種類型的非沙門氏菌屬的革蘭氏陰性腸道微生物 的方法。即，本公開的組合物陽性地辨別沙門氏菌屬微生物與不代謝第一指示劑化合物的 非沙門氏菌屬微生物，并且同時，所述組合物陰性地辨別不能代謝第二區(qū)別性指示劑化合 物的沙門氏菌屬微生物與能夠代謝第二區(qū)別性指示劑化合物的非沙門氏菌屬微生物。本發(fā) 明的方法和組合物提供了沙門氏菌屬微生物在試驗樣品中的存在或不存在的推定性證據(jù)。 此外，所述組合物任選地能夠包括第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和/或能夠被用于具有第四區(qū)別 性指示劑系統(tǒng)的方法中，以提供沙門氏菌屬微生物在試驗樣品中的存在的驗證性證據(jù)。
[0033] 本公開提供了檢測沙門氏菌屬微生物的組合物。所述組合物包含半固體培養(yǎng)基， 所述半固體培養(yǎng)基包含膠凝劑、抑制革蘭氏陽性微生物的生長的至少一種第一選擇劑、包 含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和包含被脲酶活性轉(zhuǎn)化為 第二可檢測產(chǎn)物的第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)。所述至少一種第一 區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。此外，所述至 少一種第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成可檢測的菌 落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
[0034] 本公開的培養(yǎng)基包含膠凝劑。膠凝劑可包括適合在用于培養(yǎng)革蘭氏陰性腸道微生 物的半固體微生物培養(yǎng)基中使用的任何膠凝劑。適合的膠凝劑的非限制性例子包括瓊脂、 瓊脂糖、果膠、明膠、瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、褐 藻膠以及上述中的任何兩種或更多種的組合。
[0035] 本公開的培養(yǎng)基還可包含營養(yǎng)物質(zhì)，以有利于革蘭氏陰性腸道微生物的生長。此 類營養(yǎng)物質(zhì)是本領域中為人們所熟知的，并且可包括，例如，一種或多種蛋白胨（例如，酪 蛋白胰酶消化物、動物組織胃蛋白酶消化物、蛋白胨、明膠胰酶消化物、示蛋白胨等等）和/ 或一種或多種生長補充劑（例如，酵母提取物；肉膏（牛肉/豬肉等）；鎂、錳和/或鈣鹽； 糖）。培養(yǎng)基可包含其他營養(yǎng)物質(zhì)（例如，礦物質(zhì)或其他組分），只要它們基本上不妨礙第 一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)、第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和/或第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)（當存在時） 的功能。
[0036] 本公開的培養(yǎng)基包括第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含至少一種第一區(qū)別性指 示劑化合物。第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)是陽性地區(qū)分沙門氏菌屬微生物與多種非沙門氏菌屬 的革蘭氏陰性腸道微生物的區(qū)別性指示劑系統(tǒng)。因此，第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙 門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。此外，第一區(qū)別性指示劑化合物不被非沙門 氏菌屬的革蘭氏陰性腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。
[0037] 優(yōu)選地，第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被屬于邦戈爾沙門氏菌種的微生物轉(zhuǎn)化為 第一可檢測產(chǎn)物。更優(yōu)選地，第一區(qū)別性指示劑化合物還被屬于邦戈爾沙門氏菌之外的菌 種（例如，腸道沙門氏菌）的沙門氏菌屬微生物轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。在一些實施例中， 所述第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)可包含能夠被至少一種非沙門氏菌屬腸道微生物轉(zhuǎn)化為第一 可檢測產(chǎn)物的第一區(qū)別性指示劑化合物。有利地，第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和/或第三區(qū)別 性指示劑系統(tǒng)（當存在時）能夠被用于陰性地區(qū)分在所述組合物中或在其上生長的非沙門 氏菌屬微生物與沙門氏菌屬的成員。
[0038] 在一些實施例中，第一區(qū)別性指示劑化合物是能夠被微生物（例如，屬于沙門氏 菌屬的微生物）轉(zhuǎn)化（例如，通過發(fā)酵）為第一可檢測產(chǎn)物（例如，一種或多種酸性化合物 諸如乳酸，和/或例如氣體諸如二氧化碳和/或氫氣）的營養(yǎng)物質(zhì)（例如，碳水化合物）。 本領域的普通技術(shù)人員將認識到，當?shù)谝豢蓹z測產(chǎn)物是通過第一區(qū)別性指示劑化合物的發(fā) 酵產(chǎn)生的酸性化合物時，由兩種不同的微生物產(chǎn)生的酸性化合物可以是相同的酸性化合物 或者它們可以是不同的酸性化合物。
[0039] 在一個實施例中，其中酸性化合物是第一可檢測產(chǎn)物，所述第一區(qū)別性指示劑系 統(tǒng)還能夠包含pH指示劑。用于檢測由細菌產(chǎn)生的酸性化合物的多種pH指示劑是本領域 已知的。適合的pH指示劑的非限制性例子包括酚紅、氯酚紅、中性紅、溴百里酚藍和溴百 里酚紫。在一些實施例中，其中所述第一可檢測產(chǎn)物包括氣體，所述氣體可通過，例如，捕 集所述氣體而被檢測（例如，通過在薄膜培養(yǎng)裝置中在水凝膠中捕集氣體，如PETRIFILM Enterobacteriaceae Count Plate (PETRIFILM腸桿菌計數(shù)平板）的解釋指南中所述，該文 獻全文以引用方式并入本文）。
[0040] 優(yōu)選地，在一個實施例中，其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物包含營養(yǎng)物質(zhì)，第一 區(qū)別性指示劑化合物被多種沙門氏菌屬物種和/或亞種轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。更優(yōu)選 地，第一區(qū)別性指示劑包含不被許多不屬于沙門氏菌屬的革蘭氏陰性腸道微生物物種轉(zhuǎn)化 為第一可檢測產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)。甚至更優(yōu)選地，營養(yǎng)物質(zhì)第一區(qū)別性指示劑包括不被非沙 門氏菌屬的微生物轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)。適合的第一區(qū)別性指示劑化合物的 非限制性例子包括選自蜜二糖、2-脫氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麥芽 糖、L-鼠李糖、海藻糖、D-木糖、山梨糖醇以及上述化合物中的任何兩種或更多種的組合的 化合物。
[0041] 在一些實施例中，所述第一指示劑化合物可包含酶底物。適合的酶底物包括被屬 于沙門氏菌屬的微生物轉(zhuǎn)化（例如，通過酶水解）為第一可檢測產(chǎn)物（例如，有色的產(chǎn)物 或熒光產(chǎn)物）的顯色酶底物或熒光酶底物。優(yōu)選地，酶底物被屬于邦戈爾沙門氏菌種的微 生物和屬于腸道沙門氏菌種的微生物轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。適合的酶底物的非限制性 例子包括用于檢測辛酸鹽酯酶活性或用于檢測α-半乳糖苷酶活性的酶底物。適合的顯 色酶底物包括，例如，選自5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯、4-硝基苯基辛酸酯、2-萘基辛 酸酯、4-甲基傘形酮辛酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-a -D-半乳糖苷、6-氯-3-吲哚氧 基-a -D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-a -D-半乳糖苷、1-萘基-a -D-半乳糖苷、 2-萘基-a -D-半乳糖苷、試齒靈-a -D-半乳糖苷、4_硝基苯基-a -D-半乳糖苷和4_甲 基傘形酮-a -D-半乳糖苷、它們的組合的酶底物。
[0042] 本公開的培養(yǎng)基包括第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，其包含脲酶活性的指示劑。第二區(qū) 別性指示劑系統(tǒng)是陰性地區(qū)分沙門氏菌屬微生物與多種非沙門氏菌屬的革蘭氏陰性腸道 微生物的區(qū)別性指示劑系統(tǒng)。因此，第二區(qū)別性指示劑化合物能夠被非沙門氏菌屬的革蘭 氏陰性腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物。此外，第二區(qū)別性指示劑化合物不被 沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物。
[0043] 脲酶是存在于某些非沙門氏菌屬的革蘭氏陰性腸道微生物（例如，屬于變形桿菌 屬（Proteus)、克雷伯氏菌屬、摩根氏菌屬（Morganella)、普羅維登斯菌屬（Providencia) 和沙雷氏菌屬（Serratia)的某些種）的酶。這些微生物中的一些（例如，奇異變形桿菌 (Proteus mirabilis);參見，例如，JM Matsen 等人，1972，Appl.Microbiol·，第 23 卷，第 592-594頁，該文獻全文以引用方式并入本文）能夠?qū)⒁环N或多種第一區(qū)別性指示劑化合 物（例如，海藻糖、木糖）轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。因此，在僅包括本文所述的第一區(qū)別性 指示劑系統(tǒng)的區(qū)別性培養(yǎng)基中，或許不可能區(qū)分沙門氏菌屬微生物與這些非沙門氏菌屬的 革蘭氏陰性腸道微生物之一。有利地，通過將第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)添加至培養(yǎng)基，能夠?qū)?沙門氏菌屬微生物與非沙門氏菌屬微生物相區(qū)分，因為沙門氏菌屬微生物通常不具有脲酶 活性。
[0044] 本公開的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)可包含脲和適當?shù)膒H指示劑（例如，酚紅、氯酚 紅、中性紅、溴百里酚藍和溴百里酚紫或乙酰丙酮偶氮苯二甲酰肼（phthalhydrazidylazoa cetylacetone)。脲酶活性使脲水解為二氧化碳和氨，其在水的存在下形成氫氧化銨。因此， 在一些實施例中，第二可檢測產(chǎn)物包括銨化合物。具有脲酶活性并在脲的存在下生長的微 生物菌落產(chǎn)生銨化合物，其導致菌落周圍的培養(yǎng)基的pH升高。存在于培養(yǎng)基中的適當?shù)膒H 指示劑能夠通常以細菌菌落周圍的區(qū)域或暈環(huán)顯示所導致的pH變化（例如，在以酚紅作為 pH指示劑的情況下，菌落可以是染上紫色的和/或菌落可在其周圍具有紫色區(qū)域）。脲酶活 性的其他指示劑可以是適合的，包括，例如，熒光的脲酶底物（例如，3-(1-乙酰丙酮偶氮） 苯二甲酰肼）。
[0045] 本公開的組合物還包含至少一種第一選擇劑來抑制革蘭氏陽性的微生物的生長， 從而減少對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭和有利于諸如沙門氏菌屬成員的革蘭氏陰性的微生物的生長。 適合的第一選擇劑的非限制性例子包括選自抗生素、膽汁鹽、膽汁鹽3號、膽酸、脫氧膽酸、 結(jié)晶紫、氯化鈉、新生霉素、萘啶酸、鏈霉素、多粘菌素 B和上述選擇劑中的任何兩種或更多 種的組合的選擇劑。
[0046] 本公開的組合物任選地可包含至少一種第二選擇劑來抑制至少一種不是沙門氏 菌屬成員的革蘭氏陰性的腸道微生物的生長。在一些實施例中，所述第二選擇劑還可抑制 至少一種革蘭氏陽性的微生物的生長。有利地，第二選擇劑與第一選擇劑結(jié)合，進一步抑制 微生物（革蘭氏陰性的和/或革蘭氏陽性的微生物），從而減少對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭和有利 于沙門氏菌屬微生物的生長。此外，所述至少一種第二選擇劑還可基本上阻止否則將使第 一區(qū)別性化合物和/或第三區(qū)別性化合物轉(zhuǎn)化為其相應的可檢測產(chǎn)物的非沙門氏菌屬革 蘭氏陰性微生物的生長。因此，第二選擇劑可降低非沙門氏菌屬微生物在所述組合物中或 在其上生長并被解釋為可能的沙門氏菌屬微生物的概率。適合的第二選擇劑的非限制性例 子包括選自β_內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖苷類抗生素、喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素、多 粘菌素抗生素和上述抗生素中的任何兩種或更多種的組合的選擇劑。在一個實施例中，所 述至少一種第二選擇劑包括萘啶酸、鏈霉素和多粘菌素 Β的組合。優(yōu)選地，所述至少一種第 二選擇劑各自在營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基中的濃度被選擇為允許沙門氏菌屬微生物的生長。更優(yōu)選 地，所述至少一種第二選擇劑各自在營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基中的濃度被選擇為允許所有沙門氏菌 屬微生物的生長。
[0047] 任選地，本公開的組合物還可包括第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第三區(qū)別性指 示劑系統(tǒng)包含被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測產(chǎn)物的第三區(qū)別性指示劑化合 物。本公開的第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)包含能夠被半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢 測產(chǎn)物的第三區(qū)別性指示劑化合物。因此，第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)區(qū)分了產(chǎn)生半 乳糖苷酶活性的微生物和不產(chǎn)生β_半乳糖苷酶活性的微生物。例如，許多沙門氏菌 屬不產(chǎn)生β_半乳糖苷酶活性，并且能夠通過使用β_半乳糖苷酶活性的指示劑而與 腸桿菌科的利用乳糖的成員相區(qū)分，如A.Rambach所公開的（"New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp. From Proteus spp. And other enteric bacteria"，1990, Appl. Environ. Microbiol.，vol. 56, pp. 301-303 ( "用于幫助 區(qū)分沙門氏菌屬物種與變形桿菌屬物種以及其他腸道細菌的新的平板培養(yǎng)基"，1990年， Appl. Environ. Microbiol.，第56卷，第301-303頁）；該文獻全文以引用方式并入本文）。
[0048] 然而，一些報道表明，超過90%的來自一些沙門氏菌屬物種（例如，邦戈爾 沙門氏菌）和亞種（例如，腸道沙門氏菌亞利桑那亞種（S. enterica arizonae)和 腸道沙門氏菌雙相亞利桑那亞種（S. enterica diarizonae))的分離的微生物已被 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生β _半乳糖苷酶活性（例如，參見A. M. Littell, "Plating medium for differentiating Salmonella arizonae from other Salmonellae，'，1977, Appl. Environ. Microbiol.，vol. 33, pp. 485-487( "用于區(qū)分亞利桑那沙門氏菌與其他沙門氏菌屬的平板 培養(yǎng)基"1997, Appl. Environ. Microbiol.，第33卷，第485-487頁）；該文獻全文以引用方式 并入本文）。因此，如果樣品中存在產(chǎn)β-半乳糖苷酶的沙門氏菌屬，被設計為基于β-半 乳糖苷酶活性區(qū)分沙門氏菌屬微生物和非沙門氏菌屬的微生物的培養(yǎng)基和/或相應的方 法可能錯誤地低估樣品中沙門氏菌屬微生物的數(shù)量。研究人員已發(fā)現(xiàn)了即使在該方法中使 用的培養(yǎng)基依靠 β-半乳糖苷酶活性的指示劑來區(qū)分沙門氏菌屬微生物和非沙門氏菌屬 的微生物時，也出人意料地能夠區(qū)分一些產(chǎn)β-半乳糖苷酶的沙門氏菌屬微生物的方法。 [0049] 根據(jù)本公開的適合的第三區(qū)別性指示劑化合物的非限制性例子包括 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、5-溴-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、 5_溴-6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、2-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、3, 4-環(huán)己酮七葉 苷-β -D-半乳糖苷和4-硝基苯基-β -D-半乳糖苷。在一些實施例中，第三區(qū)別性指示劑 系統(tǒng)包含第三區(qū)別性指示劑化合物（例如，乳糖）和pH指示劑。在任何實施例中，任選地， 所述組合物還能夠包含，例如，β_半乳糖苷酶活性的誘導劑諸如異丙基β-D-l-硫代半乳 糖苷（IPTG)。
[0050] 本發(fā)明的組合物的任何實施例能夠被用于培養(yǎng)裝置中，以檢測試驗樣品中的微生 物。適合的培養(yǎng)裝置包括，例如，在用以檢測樣品中存在的微生物的方法中被用于容納營養(yǎng) 物質(zhì)培養(yǎng)基的任何培養(yǎng)裝置。適合的培養(yǎng)裝置的非限制性例子包括皮氏培養(yǎng)皿、多孔板、 管、燒瓶、薄膜培養(yǎng)裝置等等。
[0051] 本公開的組合物可以以脫水的形式被配置在薄膜培養(yǎng)裝置中，如美國專利 No. 4, 565, 783 ;5, 601，998 ;5, 681，712 ;6, 265, 203 ;和 6, 638, 755 中所公開的；上述每一專 利中的每個全文以引用方式并入本文。在這些實施例中，例如，樣品（例如，含水液體樣品 或懸浮在含水的懸浮培養(yǎng)基中的固體樣品）能夠通過將該樣品吸移進培養(yǎng)裝置而與脫水 的組分接觸。在該實施例中，所述組合物的一種或多種組分可以在樣品被置入培養(yǎng)裝置中 之前或之后被溶解或懸浮在樣品中。
[0052] 任選地，包含本公開的組合物的培養(yǎng)裝置（例如，薄膜培養(yǎng)裝置）還可包括非區(qū)別 性的指示劑系統(tǒng)。適合的非區(qū)別性的指示劑化合物包括被生長的微生物代謝或換句話講 與它們反應，并且在這種情況下產(chǎn)生第四可檢測產(chǎn)物的指示劑化合物，所述第四可檢測產(chǎn) 物可導致微生物菌落或鄰近菌落的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基顯色或發(fā)熒光，以便于可視化、成像和/ 或定量。當存在于經(jīng)接種的培養(yǎng)基中時，非區(qū)別性的指示劑以及從其來源的第四可檢測產(chǎn) 物，應當基本上不妨礙第一可檢測產(chǎn)物或第二可檢測產(chǎn)物和/或第三可檢測產(chǎn)物的檢測。 適合的非區(qū)別性的指示劑化合物的非限制性例子包括顯色的氧化還原指示劑，諸如三苯基 四唑偷氯化物、對-甲苯基四唑紅、四唑紫、藜蘆基四唑藍和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸 二鈉鹽。非區(qū)別性的指示劑系統(tǒng)任選地可以在薄膜培養(yǎng)裝置中的粘合劑層中被提供，如美 國專利No. 4, 565, 783中所述。
[0053] 在一個實施例中，所述組合物基本上由膠凝劑（例如，如本文所述的任何適合的 膠凝劑）、有利于沙門氏菌屬微生物的生長的營養(yǎng)物質(zhì)（例如，如本文所述的任何適合的 營養(yǎng)物質(zhì)）、抑制革蘭氏陽性微生物的生長的至少一種第一選擇劑（例如，如本文所述的 任何適合的第一選擇劑）、包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系 統(tǒng)（例如，如本文所屬的任何適合的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和第一區(qū)別性指示劑化合物） 和包含被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物的第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示 劑系統(tǒng)（例如，如本文所述的任何適合的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和第二區(qū)別性指示劑化合 物）組成。在該實施例中，所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn) 化為第一可檢測產(chǎn)物。在該實施例中，所述種第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培 養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多 個屬轉(zhuǎn)化。
[0054] 在一個實施例中，所述組合物基本上由膠凝劑（例如，如本文所述的任何適合的 膠凝劑）、有利于沙門氏菌屬微生物的生長的營養(yǎng)物質(zhì)（例如，如本文所述的任何適合的營 養(yǎng)物質(zhì)）、抑制革蘭氏陽性微生物的生長的至少一種第一選擇劑（例如，如本文所述的任 何適合的第一選擇劑）、包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng) (例如，如本文所屬的任何適合的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和第一區(qū)別性指示劑化合物）、包 含被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物的第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系 統(tǒng)（例如，如本文所述的任何適合的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和第二區(qū)別性指示劑化合物） 和包含被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測產(chǎn)物的第三區(qū)別性指示劑化合物的第三 區(qū)別性指示劑系統(tǒng)（例如，如本文所述的任何適合的第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和第三區(qū)別性 指示劑化合物）組成。在該實施例中，所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的 多個成員轉(zhuǎn)化為第一可檢測產(chǎn)物。在該實施例中，所述種第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠 被在所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道 微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
[0055] 本公開的組合物能夠被用于檢測樣品中的沙門氏菌屬微生物的方法。在本公開的 方法中被檢測的樣品包括多種可能被懷疑包含沙門氏菌屬微生物的樣品。尤其值得關注的 樣品包括來自食品加工或飲料加工操作的原材料、中間產(chǎn)物、或成品材料。其他適合的樣 品包括，例如，水樣品（例如，地表水、工業(yè)用水）、環(huán)境樣品（例如，空氣樣品；來自墻壁、地 板、排水溝、食品接觸表面、加工設備的表面樣品）和臨床樣品。臨床樣品的非限制性例子 包括血液、膽汁、胃腸道樣品、直腸樣品和糞便樣品。試驗樣品可包括液體以及溶于或懸浮 于液體介質(zhì)中的一種或多種固體。
[0056] 圖1示出了根據(jù)本公開的檢測樣品中沙門氏菌屬微生物的方法10的一個實施例。 方法10包括提供試驗樣品、所述組合物的組分和培養(yǎng)裝置的步驟45。本發(fā)明的組合物的組 分可以在培養(yǎng)裝置中被提供（例如，作為皮氏培養(yǎng)皿中的含水的組合物、薄膜培養(yǎng)裝置中 的一個或多個基本上無水的可再水化的涂層）或者它們可以根據(jù)本領域中已知的方法被 添加至培養(yǎng)裝置。
[0057] 方法10還包括使所述組合物與樣品接觸以形成經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置的步驟50。樣 品能夠以任何的多種方式在培養(yǎng)裝置中與所述組合物接觸。例如，在本發(fā)明的方法的一個 實施例中，所述組合物能夠作為以含水的形式的混合物（例如，在含水的半固體培養(yǎng)基中） 被置于培養(yǎng)裝置中。在該實施例中，樣品（例如，液體樣品、固體樣品、過濾器上捕集的液體 和/或固體樣品、液體介質(zhì)中懸浮的固體樣品）能夠通過本領域已知的技術(shù)諸如，例如移 液、平板涂布接種技術(shù)和劃線平板接種技術(shù)，被置入在、并任選地分布在所述混合物內(nèi)或在 其上。
[0058] 在一個可供選擇的實施例中，樣品（例如，包括液體和/或固體材料）與包含所述 組合物的液體混合物（例如，熔化的、溫熱的液體瓊脂溶液）接觸并與其混合。如果尚未存 在于培養(yǎng)裝置中，則將包含樣品和所述組合物的混合物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)裝置。
[0059] 在另一個可供選擇的實施例中，組合物以脫水的形式被設置在培養(yǎng)裝置中，諸如 在本文所述的薄膜培養(yǎng)裝置中。將適合的含水液體（例如，無菌水、無菌稀釋液；任選地包 含所述組合物的一種或多種組分）移液至培養(yǎng)裝置中，并使培養(yǎng)裝置中的膠凝劑再水化。 隨后，樣品能夠被置入（例如，通過移液、劃線、置入包括樣品的膜過濾器）培養(yǎng)裝置，與上 述組分接觸。
[0060] 本領域的普通技術(shù)人員將認識到所述組合物在其中能夠在培養(yǎng)裝置中與樣品接 觸的多種其他方法。
[0061] 重新參考圖1，方法10還包括孵育經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第一時間長度的步驟55。通 常，在升高的溫度下（例如，約35-45°C )孵育（例如，在培養(yǎng)箱、烘箱等等中）經(jīng)接種的培 養(yǎng)裝置，以有利于腸道微生物的生長。在一些實施例中，在約37°C的溫度下孵育經(jīng)接種的培 養(yǎng)裝置。在一些實施例中，孵育培養(yǎng)裝置能夠包括在包括端值在內(nèi)的介于41-44°C之間的 溫度下孵育培養(yǎng)裝置。在一些實施例中，其中所述組合物包含用于檢測β_半乳糖苷酶活 性的指示劑系統(tǒng)，經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置可以在高于40°C的溫度下被孵育，以區(qū)分邦戈爾沙門 氏菌與樣品中的其他革蘭氏陰性的腸道微生物，如2011年12月28日提交的美國專利申請 No. 61/580,860中所述，該文獻全文以引用方式并入本文。
[0062] 培養(yǎng)裝置被孵育一段足以允許樣品中存在的腸道微生物生長和增殖的第一時間 長度。通常，培養(yǎng)裝置將被孵育一段至少6小時的第一時間長度。在一些實施例中，培養(yǎng)裝 置被孵育一段至少8小時的第一時間長度。在一些實施例中，培養(yǎng)裝置被孵育一段至少10 小時的第一時間長度。在一些實施例中，培養(yǎng)裝置被孵育一段約14至約48小時的第一時 間長度。在一些實施例中，培養(yǎng)裝置被孵育一段約18至約48小時的第一時間長度。在一 些實施例中，培養(yǎng)裝置被孵育一段約24至約36小時的第一時間長度。在一個優(yōu)選的實施 例中，培養(yǎng)裝置被孵育一段約24±2小時的第一時間長度。
[0063] 方法10還包括觀察培養(yǎng)裝置以檢測可檢測產(chǎn)物的步驟60?？蓹z測產(chǎn)物可以是本 文所述的第一可檢測產(chǎn)物。第一可檢測產(chǎn)物是試驗樣品中可能存在沙門氏菌屬微生物的指 示。沙門氏菌屬微生物將第一區(qū)別性指示劑化合物轉(zhuǎn)化（例如，通過發(fā)酵、通過代謝活動、 通過酶活性）為第一可檢測產(chǎn)物。通常，在第一孵育時間長度之后觀察培養(yǎng)裝置中的營養(yǎng) 物質(zhì)培養(yǎng)基。在任何實施例中，觀察所述營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基以檢測第一可檢測產(chǎn)物的存在能 夠包括觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測第一可檢測顏色。在一些實施例中，第一可檢測顏色能夠 通過熒光被檢測（例如，在其中第一區(qū)別性指示劑化合物包含4-甲基傘形酮- a -D-半乳 糖苷的一個實施例中）。
[0064] 在一個實施例中，其中第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)包含可發(fā)酵碳水化合物和pH指示 齊IJ，所述第一可檢測顏色可以是能夠?qū)⑺鎏妓衔镛D(zhuǎn)化為一種或多種酸性產(chǎn)物的微生 物菌落附近的（例如，相鄰的）與pH指示劑相關的有色區(qū)域。在一些實施例中，菌落可能 看上去具有與周圍的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基中的pH指示劑相同的顏色。
[0065] 在一個實施例中，其中第一區(qū)別性指示劑化合物包含顯色酶底物，所述第一可 檢測顏色可以是微生物菌落附近的有色區(qū)域。例如，有色區(qū)域可以包含從微生物的酶 與顯色底物（例如，4-硝基苯基-α-D-半乳糖苷）的反應產(chǎn)生的可擴散的水溶性產(chǎn)物 (例如，4-硝基苯酚）。作為另外一種選擇，有色區(qū)域可以包含從微生物的酶與顯色底物 (5-溴-4-氯-3-吲哚基-a -D-半乳糖苷）的反應產(chǎn)生的水不溶性產(chǎn)物（例如，靛藍）。 [0066] 觀察培養(yǎng)裝置（步驟60)包括觀察該培養(yǎng)裝置以檢測本文所述的第二可檢測產(chǎn)物 的存在或不存在。第二可檢測產(chǎn)物通過可與細菌菌落相關聯(lián)的脲酶活性對脲酶底物的水解 作用產(chǎn)生。在一些實施例中，第二可檢測產(chǎn)物可包括pH指示劑，其在通過脲酶活性在含水 液體中對脲的水解作用產(chǎn)生的產(chǎn)物氫氧化銨的存在下改變顏色。不同于可以包含，例如，被 發(fā)酵為酸性產(chǎn)物的碳水化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)（酸性產(chǎn)物使得鄰近與第一區(qū)別 性指示劑反應的菌落的培養(yǎng)基pH的降低），與第二區(qū)別性指示劑（例如，脲）反應的菌落產(chǎn) 生足夠的氫氧化銨，使鄰近該菌落的培養(yǎng)基的pH升高，即使該菌落能夠?qū)⒌谝恢甘緞┗?物發(fā)酵為酸性產(chǎn)物。因此，觀察到鄰近微生物菌落的第二可檢測產(chǎn)物（例如，與脲的水解相 關聯(lián)的有色區(qū)域）是該菌落不屬于沙門氏菌屬的指示。
[0067] 當?shù)谌齾^(qū)別性指示劑系統(tǒng)存在于培養(yǎng)裝置中時（例如，其存在于所述組合物中）， 觀察培養(yǎng)裝置（步驟60)包括觀察該培養(yǎng)裝置以檢測本文所述的第三可檢測產(chǎn)物的存在或 不存在。類似于第二可檢測產(chǎn)物的檢測，觀察到第三可檢測產(chǎn)物（例如，有色的或熒光的微 生物菌落和/或鄰近菌落的區(qū)域）是該菌落不屬于沙門氏菌屬的指示。
[0068] 在一些實施例中，方法10還能夠包括使經(jīng)接種的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基與包含第三區(qū) 另|J性指示劑化合物的第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)接觸的任選的步驟65。第三區(qū)別性指示劑化合 物能夠被沙門氏菌屬微生物轉(zhuǎn)化為第四可檢測產(chǎn)物，并且因此，第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)起 確認第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的結(jié)果（即，沙門氏菌屬微生物的存在的指示）的作用。即，第 一可檢測產(chǎn)物和第四可檢測產(chǎn)物均提供沙門氏菌屬微生物的存在的指示。
[0069] 第四區(qū)別性指示劑化合物能夠是用于檢測沙門氏菌屬微生物的任何適合的指示 劑化合物，只要從其來源的第四可檢測產(chǎn)物是能夠與第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的第一可檢測 產(chǎn)物、第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的第二可檢測產(chǎn)物和第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的第三可檢測產(chǎn) 物相區(qū)分的，優(yōu)選地為可在光學上區(qū)分的，更優(yōu)選地為可從視覺上區(qū)分的。因此，在一個實 施例中，第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)可包含與能夠被轉(zhuǎn)化（例如，通過發(fā)酵）為第一可檢測產(chǎn)物 (例如，酸性化合物諸如乳酸和/或例如氣體如二氧化碳）的營養(yǎng)物質(zhì)（例如，碳水化合物） 結(jié)合的pH指示劑，如本文所述。在另一個實施例中，第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)可包含顯色酶 底物，如本文所述。在另一個實施例中，第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)可以是顯色酶底物，如本文 所述。本文所述的任何第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)可適合被用作第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，只要 其基本上不妨礙并且可區(qū)分于第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)和/或第 四指不劑系統(tǒng)（當存在時）。
[0070] 有利地，第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)能夠被用作"確認"沙門氏菌屬微生物在樣品中的 存在的方式。即，當觀察到第一可檢測產(chǎn)物在培養(yǎng)裝置中的存在時，這種存在能夠被解釋為 沙門氏菌屬微生物在樣品中可能的存在的指示。然而，當?shù)谒目蓹z測產(chǎn)物的存在與第一可 檢測產(chǎn)物的存在一起被觀察到時（即，第一和第四可檢測產(chǎn)物與相同的細菌菌落相關聯(lián)）； 這種觀察結(jié)果能夠指示沙門氏菌屬微生物在樣品中存在的更高的可能性（例如，顯著更高 的可能性）。
[0071] 在第一孵育時間長度之后，能夠使用多種方法使第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)在經(jīng)接種 的培養(yǎng)裝置中與營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基相接觸，包括，例如，通過使包括第四指示劑系統(tǒng)的制品與 營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基接觸。這可以通過，例如，使用具有包括第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的涂層的 制品來進行。例如，具有包含第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)的涂層的制品可以使用與美國專利 No. 6, 022, 682中所描述的相似的方法制備，該專利全文以引用方式并入本文。
[0072] 在包含第四區(qū)別性指示劑化合物的第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)與經(jīng)接種的營養(yǎng)物質(zhì) 培養(yǎng)基接觸之后，所述方法可包括孵育平板第二時間長度的任選的步驟（未顯示）。
[0073] 孵育經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第二時間長度能夠包括將該裝置保持在升高的溫度下 (例如，在溫控培養(yǎng)箱中）。在升高的溫度下（例如，高于25°C但低于或等于約44°C)孵育 經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置能夠有利于第四區(qū)別性指示劑混合物通過腸道微生物（例如，沙門氏菌 屬的成員）向第四可檢測產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，孵育經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第二時間長度包括 在包括端值在內(nèi)的35-42 °C的溫度下孵育所述培養(yǎng)裝置。優(yōu)選地，孵育經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第 二時間長度包括在42°C ±1°C的溫度下孵育所述培養(yǎng)裝置。
[0074] 在一些實施例中，第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)在孵育的第一時間長度之后與經(jīng)接種的 營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基接觸。有利地，這樣可縮短檢測第四可檢測產(chǎn)物所需的第二孵育時間長度 的長度。因此，在一些實施例中，第二孵育時間長度能夠是1小時至約6小時。在一些實施 例中，第二孵育時間長度能夠是約2小時至約5小時。在一個優(yōu)選的實施例中，第二孵育時 間長度是4小時± 1小時。
[0075] 本領域的普通技術(shù)人員將認識到，在任何實施例中，第一可檢測產(chǎn)物、第二可檢測 產(chǎn)物、第三可檢測產(chǎn)物、或第四可檢測產(chǎn)物中的任何一種，當存在時應當基本上不妨礙任何 其他可檢測產(chǎn)物的檢測（例如，通過顏色掩蔽或熒光淬滅）。本領域的普通技術(shù)人員將認識 至IJ，在一個實施例中，其中第一可檢測產(chǎn)物、第二可檢測產(chǎn)物、第三可檢測產(chǎn)物和/或第四 可檢測產(chǎn)物是通過顏色和/或熒光被檢測，每一可檢測產(chǎn)物應當包含不同于（例如，顏色上 可區(qū)分的）其他可檢測產(chǎn)物的發(fā)色團和/或熒光團。
[0076] 本公開的方法包括觀察培養(yǎng)裝置以檢測第一可檢測產(chǎn)物、第二可檢測產(chǎn)物、第三 可檢測產(chǎn)物和/或第四可檢測產(chǎn)物。在本發(fā)明的方法的任何實施例中，觀察培養(yǎng)裝置能夠 包括觀察該培養(yǎng)裝置中的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基。在本發(fā)明的方法的任何實施例中，觀察培養(yǎng)裝 置能夠包括通過視覺上觀察所述培養(yǎng)裝置（例如，利用一個或多個人眼）。
[0077] 另外或作為另外一種選擇，在任何實施例中，觀察培養(yǎng)裝置能夠包括以機械方式 觀察所述培養(yǎng)裝置（例如，使用成像系統(tǒng)諸如，例如，美國專利No. 6, 243, 486 ;7, 496, 225 ; 和7, 351，574中描述的成像系統(tǒng)，上述每一專利的每個全文以引用方式并入本文。在該實 施例中，觀察培養(yǎng)裝置能夠包括使用成像裝置生成所述培養(yǎng)裝置的圖像。除生成培養(yǎng)裝置 的圖像外，所述方法還任選地能夠包括使用處理器分析該圖像。
[0078] 本公開的方法能夠被用于檢測樣品中的微生物并任選地對其進行計數(shù)。例如，觀 察到第一可檢測產(chǎn)物在培養(yǎng)裝置中的存在能夠指示沙門氏菌屬微生物（例如，邦戈爾沙門 氏菌種的成員或腸道沙門氏菌種的成員）在樣品中可能的存在。然而，在根據(jù)本公開的方 法中，觀察到第一可檢測產(chǎn)物與第二可檢測產(chǎn)物一起存在指示沙門氏菌屬微生物之外的微 生物的存在。
[0079] 根據(jù)本公開對微生物進行計數(shù)還能夠包括對一種或多種類型的微生物進行計數(shù)。 這些類型可通過它們各自與所述指示劑系統(tǒng)中的任何一種或多種的反應或沒有反應而被 區(qū)分。能夠通過本發(fā)明的方法被計數(shù)的微生物的類型的非限制例子包括沙門氏菌屬微生 物、非沙門氏菌屬微生物、產(chǎn)β -半乳糖苷酶的微生物和產(chǎn)脲酶的微生物。
[0080] 當根據(jù)本公開使用時，本發(fā)明的方法能夠檢測沙門氏菌屬微生物在樣品中的存在 或不存在。圖2示出了與從圖1中示出的方法獲得的結(jié)果一起使用的分析流程圖的一個實 施例。該流程圖能夠被用于確定任何給定的微生物菌落（如果其基本上是純的并且空間上 是與其他微生物菌落分隔的）包含沙門氏菌屬的成員還是非沙門氏菌屬的革蘭氏陰性腸 道微生物。
[0081] 在上文描述的第一孵育時間長度之后，觀察培養(yǎng)裝置以檢測第一可檢測產(chǎn)物（步 驟100)的存在或不存在和檢測第二可檢測產(chǎn)物（步驟110)的存在或不存在。第一可檢測 產(chǎn)物和/或第二可檢測產(chǎn)物能夠如本文所述被檢測。
[0082] 如果在孵育時間長度之后沒有檢測到第一可檢測產(chǎn)物，則試驗樣品被推定為不包 含沙門氏菌屬微生物（即，結(jié)果105被認為是"推測為陰性"）。如果觀察到第一可檢測產(chǎn) 物，則進一步觀察培養(yǎng)裝置以檢測第二可檢測產(chǎn)物與第一可檢測產(chǎn)物一起的存在。如果第 一可檢測產(chǎn)物和第二可檢測產(chǎn)物均被觀察到與一個微生物菌落相關聯(lián)，則該微生物菌落被 推定為不包含沙門氏菌屬微生物（即，結(jié)果115被認為是"陰性的"）。
[0083] 如果第一可檢測產(chǎn)物被觀察到與一個微生物菌落相關聯(lián)，而第二可檢測產(chǎn)物沒有 被觀察到與該菌落相關聯(lián)，則結(jié)果117被認為是"推測為陽性"（即，結(jié)果指示該菌落可能屬 于沙門氏菌屬。在這種情況下，操作者可使用本文所述的第四區(qū)別性指示劑系統(tǒng)來確認該 微生物是否是沙門氏菌屬的成員。因此，在觀察微生物菌落以檢測第一可檢測產(chǎn)物和第二 可檢測產(chǎn)物之后，觀察該菌落以檢測第四可檢測產(chǎn)物的存在或不存在（步驟120)。如果第 四可檢測產(chǎn)物被觀察到與產(chǎn)生第一可檢測產(chǎn)物并且不產(chǎn)生第二可檢測產(chǎn)物的菌落相關聯(lián)， 則關于該菌落的結(jié)果125被認為是"確認為陽性"（即，有三項獨立的結(jié)果指示該菌落中存 在的微生物屬于沙門氏菌屬）。如果第四可檢測產(chǎn)物沒有被觀察到與產(chǎn)生第一可檢測產(chǎn)物 并且不產(chǎn)生第二可檢測產(chǎn)物的菌落相關聯(lián)，則結(jié)果135指示該微生物菌落可能是或可能不 是屬于沙門氏菌屬，并且可使用附加的測試（例如，基因測試、免疫學測試、生物化學測試） 來幫助鑒定該微生物。
[0084] 實施例
[0085] 實施例1是一種組合物，所述組合物包含：
[0086] 半固體培養(yǎng)基，其包含：
[0087] 膠凝劑；
[0088] 至少一種抑制革蘭氏陽性微生物的生長的第一選擇劑；
[0089] 包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)；和
[0090] 包含第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第二區(qū)別性指示劑 化合物被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物；
[0091] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可 檢測產(chǎn)物；
[0092] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成 可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
[0093] 實施例2是根據(jù)實施例1所述的組合物，其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物是選 自蜜二糖、2-脫氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麥芽糖、L-鼠李糖、海藻糖、 D-木糖、山梨糖醇以及上述化合物中的任何兩種或更多種的組合的化合物。
[0094] 實施例3是根據(jù)實施例1或?qū)嵤├?所述的組合物，所述組合物還包含緩沖劑。 [0095] 實施例4是根據(jù)實施例3所述的組合物，其中所述緩沖劑選自MOPS、磷酸鹽、TES、 HEPES以及它們的組合。
[0096] 實施例5是根據(jù)前述實施例中任一項所述的組合物，所述組合物還包括第三區(qū)別 性指示劑系統(tǒng)，所述第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)包含被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測 產(chǎn)物的第三區(qū)別性指示劑化合物。
[0097] 實施例6是根據(jù)實施例5所述的組合物，其中所述第三區(qū)別性指示劑化合物是顯 色酶底物。
[0098] 實施例7是根據(jù)實施例6所述的組合物，其中所述第三區(qū)別性指示劑化合物選自 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、鄰-硝 基苯基-β -D-半乳糖苷、對-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、3, 4-環(huán)己酮七葉苷-β -D-半乳 糖苷和6-氯_3_ Π 引哚基-β -D-半乳糖苷。
[0099] 實施例8是根據(jù)前述實施例中任一項所述的組合物，其中所述至少一種第一選擇 劑選自膽汁鹽、膽酸、脫氧膽酸、結(jié)晶紫或上述化合物中任何兩種或更多種的組合。
[0100] 實施例9是根據(jù)前述實施例中任一項所述的組合物，其中所述pH指示劑選自酚 紅、氯酚紅、中性紅、溴百里酚藍和溴百里酚紫。
[0101] 實施例10是根據(jù)前述實施例中任一項所述的組合物，所述組合物還包含至少一 種第二選擇劑，所述第二選擇劑抑制至少一種不是沙門氏菌屬成員的革蘭氏陰性腸道微生 物的生長。
[0102] 實施例11是根據(jù)實施例10所述的組合物，其中所述至少一種第二選擇劑選自 β -內(nèi)酰胺類抗生素、氨基糖甙類抗生素、喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素、多粘菌素抗生素 以及上述抗生素中的任何兩種或更多種的組合；其中所述至少一種第二選擇劑的濃度被選 擇為允許沙門氏菌屬微生物的生長。
[0103] 實施例12是根據(jù)實施例11所述的組合物，其中所述至少一種第二選擇劑包括萘 啶酸、鏈霉素和多粘菌素 Β的組合；其中所述至少一種選擇劑各自在所述組合中的濃度被 選擇為允許沙門氏菌屬微生物的生長。
[0104] 實施例13是根據(jù)實施例5所述的組合物，其中所述第一選擇劑包括膽汁鹽； 所述至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物包括2-脫氧-D-核糖和蜜二糖；所述pH指示 劑包括酚紅，所述第二區(qū)別性指示劑化合物包括脲，所述第三區(qū)別性指示劑化合物包括 5_氯-4-溴-3-吲哚氧基-β -D-半乳糖苷；并且所述至少一種第二選擇劑包括萘啶酸、鏈 霉素和多粘菌素 Β。
[0105] 實施例14是根據(jù)前述實施例中任一項所述的組合物，其中所述膠凝劑選自瓊脂、 瓊脂糖、果膠、明膠、瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、藻 酸脂以及上述中的任何兩種或更多種的組合。
[0106] 實施例15是基本上由下列組成的組合物：
[0107] 半固體培養(yǎng)基，其包含：
[0108] 膠凝劑；
[0109] 有利于多種革蘭氏陰性腸道微生物的生長的營養(yǎng)物質(zhì)；
[0110] 至少一種抑制多種革蘭氏陽性微生物的生長的第一選擇劑；
[0111] 包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)；和
[0112] 包含第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第二區(qū)別性指示劑 化合物被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物；
[0113] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可 檢測產(chǎn)物；
[0114] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成 可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
[0115] 實施例16是基本上由下列組成的組合物：
[0116] 半固體培養(yǎng)基，其包含：
[0117] 膠凝劑；
[0118] 有利于沙門氏菌屬微生物的生長的營養(yǎng)物質(zhì)；
[0119] 至少一種抑制革蘭氏陽性微生物的生長的第一選擇劑；
[0120] 包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)；和
[0121] 包含第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第二區(qū)別性指示劑 化合物被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物；
[0122] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可 檢測產(chǎn)物；
[0123] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培養(yǎng)基中和/或在其上形成 可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
[0124] 實施例17是基本上由下列組成的組合物：
[0125] 半固體培養(yǎng)基，其包含：
[0126] 膠凝劑；
[0127] 有利于沙門氏菌屬微生物的生長的營養(yǎng)物質(zhì)；
[0128] 至少一種抑制革蘭氏陽性微生物的生長的第一選擇劑；
[0129] 包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)；
[0130] 包含第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第二區(qū)別性指示劑 化合物被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物；和
[0131] 包含第三區(qū)別性指示劑化合物的第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第三區(qū)別性指示劑 化合物被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測產(chǎn)物；
[0132] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬的多個成員轉(zhuǎn)化為第一可 檢測產(chǎn)物；
[0133] 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成 可檢測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
[0134] 實施例18是一種檢測沙門氏菌屬微生物的方法，所述方法包括：
[0135] 提供試驗樣品、培養(yǎng)裝置和實施例1至17中任一項所述的組合物；
[0136] 在所述培養(yǎng)裝置中使所述組合物與所述試驗樣品接觸，以形成經(jīng)接種的培養(yǎng)裝 置；
[0137] 孵育所述經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第一時間長度；以及
[0138] 觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測第一可檢測產(chǎn)物，其中所述第一可檢測產(chǎn)物是沙門氏菌 屬微生物的存在的第一指示。
[0139] 實施例19是根據(jù)實施例18所述的方法，其中檢測所述第一可檢測產(chǎn)物包括觀察 所述pH指示劑與由細菌產(chǎn)生的酸性化合物的反應。
[0140] 實施例20是根據(jù)實施例18或?qū)嵤├?9所述的方法，所述方法還包括觀察所述營 養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基以檢測第二可檢測產(chǎn)物，其中所述第二可檢測產(chǎn)物指示非沙門氏菌屬的微生 物的存在。
[0141] 實施例21是根據(jù)實施例20所述的方法，其中檢測第二可檢測產(chǎn)物包括觀察所述 pH指示劑與由細菌產(chǎn)生的堿性化合物的反應。
[0142] 實施例22是根據(jù)實施例18至21中任一項所述的方法，所述方法還包括觀察所述 營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基以檢測第三可檢測產(chǎn)物，其中所述第三可檢測產(chǎn)物指示非沙門氏菌屬的微 生物的存在。
[0143] 實施例23是根據(jù)實施例22所述的方法，其中檢測所述第三可檢測產(chǎn)物包括檢測 由β-半乳糖苷酶活性產(chǎn)生的有色產(chǎn)物。
[0144] 實施例24是根據(jù)實施例18至23中任一項所述的方法，所述方法還包括：
[0145] 提供具有能夠被沙門氏菌屬微生物代謝為第四可檢測產(chǎn)物的驗證性指示劑化合 物的制品，其中當所述第四可檢測產(chǎn)物存在時，其能夠與所述第一可檢測產(chǎn)物、第二可檢測 產(chǎn)物和第三可檢測產(chǎn)物相區(qū)分；
[0146] 使所述制品與所述培養(yǎng)基接觸；
[0147] 孵育所述裝置第二時間長度；以及
[0148] 觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測所述第四可檢測產(chǎn)物；
[0149] 其中檢測到所述第四可檢測產(chǎn)物與所述第一可檢測產(chǎn)物一起存在是沙門氏菌屬 微生物在所述樣品中存在的第二指示。
[0150] 實施例25是根據(jù)實施例24所述的方法，其中孵育所述培養(yǎng)裝置包括孵育該裝置 約2小時至約5小時。
[0151] 實施例26是根據(jù)實施例18至25中任一項所述的方法，所述方法還包括對第一類 型的微生物的多個菌落進行計數(shù)。
[0152] 實施例27是根據(jù)實施例26所述的方法，所述方法還包括對第二類型的微生物的 多個菌落進行計數(shù)。
[0153] 實施例28是根據(jù)實施例18至27中任一項所述的方法，其中孵育所述培養(yǎng)裝置包 括在包括端值在內(nèi)的介于41-44°C之間的溫度下孵育所述培養(yǎng)裝置。
[0154] 實施例29是根據(jù)實施例18至28中任一項所述的方法，其中觀察所述培養(yǎng)裝置包 括視覺上觀察所述培養(yǎng)裝置。
[0155] 實施例30是根據(jù)實施例18至29中任一項所述的方法，其中觀察所述培養(yǎng)裝置包 括使用成像裝置生成所述培養(yǎng)裝置的圖像。
[0156] 實施例31是根據(jù)實施例30所述的方法，所述方法還包括使用處理器分析所述圖 像。
[0157] 實魁
[0158] 本發(fā)明的目的和優(yōu)點進一步通過以下實例來說明，但這些實例中列舉的特定材料 及其量，以及其他條件和細節(jié)不應解釋為對本發(fā)明的不當限制。除非另外指明，所有份數(shù)和 百分比均以重量計，所有水為蒸餾水，并且所有分子量為重均分子量。通過將所選擇的微生 物劃線接種在TSA平板（含有5%羊血液的胰酶大豆瓊脂平板；美國加尼福尼亞州圣瑪利 亞的 Hardy Diagnostics 公司（Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA))并在 37°C孵育平板 過夜，制備了純的細菌培養(yǎng)物。所有的微生物計數(shù)是根據(jù)針對菌落形成單位數(shù)的標準微生 物計數(shù)方法進行的，計數(shù)值是近似數(shù)量。
[0159] 材料。除非另有說明，材料是可從美國馬里蘭州巴爾的摩的Alpha Biosciences 公司（Alpha Biosciences, Baltimore, MD)商購獲得的。列有ATCC編號的微生物培養(yǎng)物購 自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC;美國弗吉尼亞州馬納薩斯（Manassas，VA))。實例的制 備中利用的材料示出在表1中。
[0160] 表1.材料
[0161]

【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，其包含： 半固體培養(yǎng)基，其包含： 膠凝劑； 至少一種抑制革蘭氏陽性微生物的生長的第一選擇劑； 包含至少一種第一區(qū)別性指示劑化合物的第一區(qū)別性指示劑系統(tǒng)；和 包含第二區(qū)別性指示劑化合物的第二區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述第二區(qū)別性指示劑化合 物被脲酶活性轉(zhuǎn)化為第二可檢測產(chǎn)物； 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物能夠被沙門氏菌屬（Salmonella)的多個成員轉(zhuǎn)化 為第一可檢測產(chǎn)物； 其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物不能夠被在所述培養(yǎng)基之內(nèi)和/或之上形成可檢 測的菌落的非沙門氏菌屬的、革蘭氏陰性的腸道微生物的多個屬轉(zhuǎn)化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一區(qū)別性指示劑化合物是選自蜜二糖、 2_脫氧-D-核糖、甘露糖醇、L-阿拉伯糖、半乳糖醇、麥芽糖、L-鼠李糖、海藻糖、D-木糖、 山梨糖醇以及上述化合物中的任何兩種或更多種的組合的化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的組合物，其還包含緩沖劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述緩沖劑選自MOPS、磷酸鹽、TES、HEPES以及 它們的組合。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其還包括第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)，所述 第三區(qū)別性指示劑系統(tǒng)包含被β-半乳糖苷酶活性轉(zhuǎn)化為第三可檢測產(chǎn)物的第三區(qū)別性 指示劑化合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述第三區(qū)別性指示劑化合物是顯色酶底物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述第三區(qū)別性指示劑化合物選自 5_溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷、鄰-硝 基苯基-β -D-半乳糖苷、對-硝基苯基-β -D-半乳糖苷、3, 4-環(huán)己酮七葉苷-β -D-半乳 糖苷和6-氯_3_ Π 引哚基-β -D-半乳糖苷。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述至少一種第一選擇劑選自膽汁 鹽、膽酸、脫氧膽酸、結(jié)晶紫或上述化合物中任何兩種或更多種的組合。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述pH指示劑選自酚紅、氯酚紅、 中性紅、溴百里酚藍和溴百里酚紫。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其還包含至少一種第二選擇劑，所述第 二選擇劑抑制至少一種不是沙門氏菌屬成員的革蘭氏陰性腸道微生物的生長。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述至少一種第二選擇劑選自β-內(nèi)酰胺類 抗生素、氨基糖甙類抗生素、喹諾酮類抗生素、磺胺類抗生素、多粘菌素抗生素以及上述抗 生素中的任何兩種或更多種的組合；其中所述至少一種第二選擇劑的濃度被選擇為允許沙 門氏菌屬微生物的生長。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述至少一種第二選擇劑包括萘啶酸、鏈霉 素和多粘菌素 Β的組合；其中所述至少一種選擇劑各自在所述組合中的濃度被選擇為允許 沙門氏菌屬（Salmonella)微生物的生長。
13. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述第一選擇劑包括膽汁鹽；所述至少一種第 一區(qū)別性指示劑化合物包括2-脫氧-D-核糖和蜜二糖；所述pH指示劑包括酚紅，所述第二 區(qū)別性指示劑化合物包括5-氯-4-溴-3-吲哚氧基-β -D-半乳糖苷；并且所述至少一種 第二選擇劑包括萘啶酸、鏈霉素和多粘菌素 Β。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的組合物，其中所述膠凝劑選自瓊脂、瓊脂糖、果 膠、明膠、瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、褐藻膠以及 上述中的任何兩種或更多種的組合。
15. -種檢測沙門氏菌屬微生物的方法，所述方法包括： 提供試驗樣品、培養(yǎng)裝置和權(quán)利要求1至14中任一項所述的組合物； 在所述培養(yǎng)裝置中使所述組合物與所述試驗樣品接觸以形成經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置； 孵育所述經(jīng)接種的培養(yǎng)裝置第一時間長度；以及 觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測第一可檢測產(chǎn)物，其中所述第一可檢測產(chǎn)物是沙門氏菌屬微 生物的存在的第一指示。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中檢測所述第一可檢測產(chǎn)物包括觀察所述pH指示 劑與由細菌產(chǎn)生的酸性化合物的反應。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的方法，該方法還包括觀察所述營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng) 基以檢測第二可檢測產(chǎn)物，其中所述第二可檢測產(chǎn)物指示非沙門氏菌屬的微生物的存在。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中檢測所述第二可檢測產(chǎn)物包括觀察所述pH指示 劑與由細菌產(chǎn)生的堿性化合物的反應。
19. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法，該方法還包括觀察所述營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng) 基以檢測第三可檢測產(chǎn)物，其中所述第三可檢測產(chǎn)物指示非沙門氏菌屬的微生物的存在。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中檢測所述第三可檢測產(chǎn)物包括檢測由β-半乳 糖苷酶活性產(chǎn)生的有色產(chǎn)物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求15至20中任一項所述的方法，該方法還包括： 提供具有能夠被沙門氏菌屬微生物代謝為第四可檢測產(chǎn)物的驗證性指示劑化合物的 制品，其中當所述第四可檢測產(chǎn)物存在時，其能夠與所述第一可檢測產(chǎn)物、第二可檢測產(chǎn)物 和第三可檢測產(chǎn)物相區(qū)分； 使所述制品與所述培養(yǎng)基接觸； 孵育所述裝置第二時間長度；以及 觀察所述培養(yǎng)裝置以檢測所述第四可檢測產(chǎn)物； 其中檢測到所述第四可檢測產(chǎn)物與所述第一可檢測產(chǎn)物一起存在是沙門氏菌屬微生 物在所述樣品中存在的第二指示。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中孵育所述裝置包括孵育該裝置2小時至5小時。
23. 根據(jù)權(quán)利要求15至22中任一項所述的方法，該方法還包括對第一類型的微生物的 多個菌落進行計數(shù)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，該方法還包括對第二類型的微生物的多個菌落進行 計數(shù)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求15至24中任一項所述的方法，其中孵育所述培養(yǎng)裝置包括在包括端 值在內(nèi)的介于41-44°C之間的溫度下孵育所述培養(yǎng)裝置。
26. 根據(jù)權(quán)利要求15至25中任一項所述的方法，其中觀察所述培養(yǎng)裝置包括視覺上觀 察所述培養(yǎng)裝置。
27. 根據(jù)權(quán)利要求15至26中任一項所述的方法，其中觀察所述培養(yǎng)裝置包括使用成像 裝置生成所述培養(yǎng)裝置的圖像。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，該方法還包括使用處理器分析所述圖像。
【文檔編號】C12Q1/04GK104093851SQ201280065492
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月28日
【發(fā)明者】克里斯蒂娜·A·賓斯費爾德, 帕特里克·A·馬赫, 瑪拉·S·切爾特, 亞當·J·斯塔內(nèi)納斯 申請人:3M創(chuàng)新有限公司