由乙酸和甘油生產(chǎn)乙醇的工程化酵母菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于由木質(zhì)纖維素水解液生產(chǎn)乙醇的方法，該木質(zhì)纖維素水解液包括己糖、戊糖和乙酸，由此使用經(jīng)基因修飾的酵母細胞，其含有編碼乙醛脫氫酶的外源基因和編碼具有NAD+-連接的甘油脫氫酶活性的酶的細菌基因。該方法進一步的特征在于，甘油存在或者供應(yīng)到培養(yǎng)基中，經(jīng)修飾的酵母細胞由此發(fā)酵己糖、戊糖、乙酸和甘油為乙醇。本發(fā)明還涉及用于上述方法的酵母細胞。所述酵母細胞優(yōu)選地地含有提高甘油利用的基因修飾，例如增加一種或多種二羥基丙酮激酶活性以及將甘油轉(zhuǎn)運到細胞中的基因修飾。所述酵母細胞還進一步優(yōu)選包括功能化的外源木糖異構(gòu)酶基因和/或功能化的外源基因，其賦予細胞將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖-5-磷酸的能力，并且它們可以包括增加乙酰-CoA合成酶活性的基因修飾。
【專利說明】由乙酸和甘油生產(chǎn)乙醇的工程化酵母菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物例如酵母菌體內(nèi)的代謝工程。特別地，本發(fā)明涉及由乙酸和甘 油生產(chǎn)乙醇的已經(jīng)工程化酵母菌株。除了乙酸和甘油，該酵母菌株還可以消耗己糖和戊糖， 以用于生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的工程化菌株由乙酸和甘油生產(chǎn)乙醇的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 第二代生物乙醇是通過將例如植物生物質(zhì)（plant biomass)的木質(zhì)纖維素組分水 解成用于發(fā)酵成乙醇的游離的單糖（例如己糖和戊糖）而生產(chǎn)的。木質(zhì)纖維素水解液含有 大量的乙酸，乙酸是用于生產(chǎn)乙醇的微生物（例如酵母菌）的發(fā)酵能力的強效抑制劑。
[0003] Sonderegger 等（2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:2892 - 2897)公開了憐酸轉(zhuǎn) 乙酰酶和乙醒脫氫酶在木糖發(fā)酵釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株中的異源表 達。通過結(jié)合天然的磷酸轉(zhuǎn)酮酶（phosphoketolase)，Sonderegger等由此創(chuàng)造了功能化的 磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑，該途徑具有NADH的凈再氧化（net reoxidation)的能力，NADH通過木糖 還原酶和木糖醇脫氫酶（在菌株中用于木糖的利用）的異源表達產(chǎn)生。
[0004] Guadalupe 等（2009,Appl. Environ. Microbiol, doi:10. 1128/AEM. 01772-09)公 開了一種釀酒酵母菌株，在該菌株中通過破壞內(nèi)源性依賴NAD的甘油-3-磷酸脫氫酶基因 (GPD1和GPD2)消除了副產(chǎn)品甘油的生產(chǎn)。大腸桿菌mhpF基因（編碼乙?；蕾嘚AD的乙 醛脫氫酶）的表達修復(fù)了 GPD-破壞菌株通過補充含有乙酸的培養(yǎng)基以厭氧生長的能力。
[0005] Yu 等（2010, Bioresour. Technol. 101 (11) :4157-61. Epub2010Feb9)公開 了代謝 工程化的釀酒酵母菌株，該菌株通過甘油脫氫酶（GCY)、二羥基丙酮激酶（DAK)和甘油攝取 蛋白質(zhì)（GUP1)的同時過表達，以提高由甘油生產(chǎn)乙醇的量。
[0006] Lee 和 Dasilva (2006, Metab Eng. 8 (1) : 58-65)公開了工程化酵母菌（釀酒酵母 菌株）以通過尤其是（inter alia)大腸桿菌的mgs和gldA基因的引入表達由甘油產(chǎn)生 1，2-丙二醇。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種用于能夠由乙酸和甘油（以及己糖和戊糖）生產(chǎn)乙醇的 菌株，以及這些菌株用于生產(chǎn)乙醇和/或其它發(fā)酵產(chǎn)物的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 定義
[0009] 在本文中的序列同一性被定義為兩條或多條氨基酸（多肽或蛋白質(zhì)）序列或者兩 條或多條核苷酸（多核苷酸）序列之間的關(guān)系，這種關(guān)系是通過序列比對來確定的。在本領(lǐng) 域中，"同一性"也指氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)性的程度，這種情況可以通過匹配 成串（strings)的序這種列來確定。通過將氨基酸序列和一條多肽的保守氨基酸取代與第 二多肽序列比對來確定兩條氨基酸序列之間的"相似性"。"同一性"和"相似性"可以通過已 知的方法很容易地計算。術(shù)語"序列同一性"或"序列相似性"是指兩條（多）肽或兩條核苷 酸序列，當(dāng)最佳比對時，優(yōu)選在其整個長度（比較時至少是最短序列）和最大化匹配的數(shù)量 以及最小化間隙的數(shù)量（例如，由ClustalW程序（1. 83)，GAP或BESTFIT使用默認(rèn)參數(shù)），共 享至少一定百分比的如本文其他部分所定義的序列同一'丨生。GAP使用Needleman和Wunsch 全局比對算法以在它們的整個長度比對兩條序列，最大化匹配的數(shù)量并且最小化間隙的數(shù) 量。通常，該GAP默認(rèn)參數(shù)隨間隙建立罰分（gap creation penalty) =50 (核苷酸）/8 (蛋 白質(zhì)）和間隙擴展罰分（gap extension penalty) = 3(核苷酸）/2(蛋白質(zhì)）使用。對于 核苷酸，使用的默認(rèn)評分矩陣（default scoring matrix)為nwsgapdna，對于蛋白質(zhì)，使用 的默認(rèn)評分矩陣為 Blosum62(Hentikoff&Hentikoff，1992, PNAS89,915-919)。優(yōu)選的用于 比對本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列的多重比對程序為應(yīng)用替換矩陣（blosum matrixS)和默認(rèn)設(shè)置 (間隙開放罰分（Gap opening penalty) : 10 ;間隙擴展罰分：0· 05)的 ClustalW (1. 83)。它 比當(dāng)RNA序列被認(rèn)為是與DNA序列基本上相似或具有一定程度的序列同一性時清晰，DNA序 列中的胸腺嘧啶（T)被認(rèn)為等于RNA序列中的尿嘧啶（U)。用于序列同一性百分比的序列 比對和分?jǐn)?shù)的確定可以通過使用計算機程序例如GCG Wisconsin Package,版本10. 3,購自 Accelrys Inc.，9685Scranton Road, San Diego, CA92121-3752USA;或使用用于Windows 的 開源軟件Emboss (目前版本2. 7. 1-07)。備選地，相似性或同一性的百分?jǐn)?shù)可以通過使用例 如FASTA、BLAST等的數(shù)據(jù)庫來搜索確定。
[0010] 設(shè)計確定同一性的優(yōu)選方法以在測試的序列間產(chǎn)生最大的匹配。確定同一 性和相似性的方法編纂在公開可用的計算機程序中。優(yōu)選的確定兩個序列同一性和 相似性的計算機程序方法包括例如GCG程序包（Devereux、J.，et al.，Nucleic Acids Researchl2(l) :387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN Mol. Biol. 215:403-410 (1990)。BLAST X 程序是從 NCBI 和其他來源（BLAST Manual、 Altschul, S. , et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, MD20894 ；Altschul, S. , et al.,J. Mol. Biol. 215:403-410(1990))公開可獲得的。還可以使用眾所周知的Smith Waterman算法來 確定同一'I"生。
[0011] 優(yōu)選的用于多肽序列比對的參數(shù)包括如下：算法（Algorithm) :Needleman and Wunsch，J. Mol. Biol. 48:443-453(1970);比對矩陣（Comparison matrix) :BL0SSUM62 來 自 Hentikoff and Hentikoff, Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 89:10915-10919(1992);間隙罰 分（Gap Penalty) :12 ;和間隙長度罰分（Gap Length Penalty) :4。就像來自位于麥迪遜， 威斯康星州（Madison，WI)的遺傳學(xué)電腦集團的"Ogap"程序一樣，帶有這些參數(shù)的有用的 程序是公開可獲得的。前述的參數(shù)為用于氨基酸比對（對于端隙（end gaps)不伴隨罰分 (penalty))的默認(rèn)參數(shù)。
[0012] 優(yōu)選的用于核酸比對的參數(shù)包括如下：規(guī)則系統(tǒng)：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);比對矩陣：匹配（matches) = +10,失配（mismatch) = 0 ;間隙罰 分：50 ;間隙長度罰分：3?？色@得如來自麥迪遜，威斯康星州（Madison，Wis)的遺傳學(xué)電腦 集團的間隙程序。以上給出的是核酸比對的默認(rèn)參數(shù)。
[0013] 任選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，在確定氨基酸相似性程度時，本領(lǐng)域技術(shù)人員 還可以考慮稱為"保守的"氨基酸取代。保守的氨基酸取代指的是具有相似的側(cè)鏈的殘基的 可替換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨 酸；一組具有脂肪族-羥基的側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨 基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸 是半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組為：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨 酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公開的氨基酸 序列取代變體為公開的序列中至少一個殘基缺失且不同的殘基在其位置插入的氨基酸序 列。優(yōu)選地，氨基酸的變化是保守的。優(yōu)選的各個自然發(fā)生的氨基酸的保守取代如下：Ala 至lj Ser ;Arg 到 Lys ;Asn 到 Gin 或 His ;Asp 到 Glu ;Cys 到 Ser 或 Ala ;Gln 到 Asn ;Glu 至lj Asp ;Gly 到 Pro ;His 到 Asn 或 Gin ;Ile 到 Leu 或 Val ;Leu 到 lie 或 Val ;Lys 到 Arg ;Gln 或 Glu ;Met 到 Leu 或 lie ;Phe 到 Met、Leu 或 Tyr ;Ser 到 Thr ;Thr 到 Ser ;Trp 到 Tyr ;Tyr 至lj Trp 或 Phe ;以及 Val 到 lie 或 Leu。
[0014] 本發(fā)明的核苷酸序列也可以由它們和本文公開的或部分公開的特定核苷酸序列 雜交（在溫和、優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下）的能力來確定。本文所述的嚴(yán)格雜交條件被定義 為允許核酸序列的至少約25,優(yōu)選約50、75或100個核苷酸，最優(yōu)選約200個以上的核苷酸 在約65 °C的溶液中發(fā)生雜交，所述溶液含有大約1M鹽，優(yōu)選6 X SSC或任何其他含有類似離 子強度的溶液，并在約65°C的溶液中進行洗滌，洗滌溶液含有約0. 1M或0. 1M以下的鹽，優(yōu) 選0. 2 XSSC或任何其他含有類似離子強度的溶液。優(yōu)選雜交過夜，也就是至少進行10小 時，并且優(yōu)選至少洗滌一小時，其間洗滌溶液至少更換兩次。這些條件通常使得具有約90% 以上的序列同一性的序列發(fā)生特異性雜交。
[0015] 溫和的條件在此定義為以下條件：允許至少50個核苷酸，優(yōu)選約200個或更多的 核苷酸的核酸序列，在約45 °C的溫度下，在含有約1M鹽，優(yōu)選6 X SSC的溶液或具有相當(dāng)?shù)?離子強度的任意的其它溶液中雜交，以及在室溫下在含有約1M鹽，優(yōu)選6 X SSC的溶液或具 有相當(dāng)?shù)碾x子強度的任意的其它溶液中洗滌。優(yōu)選地，雜交過夜進行，即至少10小時，并且 優(yōu)選地，洗滌進行至少一小時，并至少更換兩次洗滌溶液。這些條件通常允許具有至多50% 的序列一致性的序列的特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變這些雜交條件以特別地鑒定 一致性在50%和90%之間變化的序列。
[0016] "核酸構(gòu)建體"或"核酸載體"在此理解為通過重組DNA技術(shù)的使用得到的人造核 酸分子。因此，雖然核酸構(gòu)建體可能含有（部分）自然產(chǎn)生的核酸分子，但是術(shù)語"核酸構(gòu) 建體"不包括自然產(chǎn)生的核酸分子。術(shù)語"表達載體"或"表達構(gòu)建體"是指能夠影響宿主 細胞或與該種序列相容的宿主生物體中的基因的表達的核苷酸序列。這些表達載體通常至 少包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄調(diào)控序列和任選的3'轉(zhuǎn)錄終止信號。也可以存在必要的或有利于實現(xiàn) 表達的附加因子，例如表達增強元件。所述表達載體將被引入到合適的宿主細胞，并能夠影 響試管內(nèi)細胞培養(yǎng)的宿主細胞中的編碼序列的表達。所述表達載體將適合于在本發(fā)明的宿 主細胞或生物體中復(fù)制。
[0017] 本文所使用的術(shù)語"啟動子"或"轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列"指的是用來控制一種或多種編 碼序列的轉(zhuǎn)錄的核酸片段，并且相對于編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點的轉(zhuǎn)錄方向而言它位于上 游，其結(jié)構(gòu)特征是存在依賴DNA的RNA聚合酶的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點和任何其他DNA序 列，所述其他DNA序列包括但并不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、阻抑蛋白和激活蛋白結(jié)合位點、 以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的直接或間接地調(diào)控由啟動子開始的轉(zhuǎn)錄量的任何其他核苷 酸序列。"組成型"啟動子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中具有活性的啟動 子。"可誘導(dǎo)型"啟動子是受生理或發(fā)育例如應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑調(diào)控的啟動子。
[0018] 術(shù)語"可篩選標(biāo)記"是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的術(shù)語，在本文中用于描述在表達 時可用來篩選含有可篩選標(biāo)記的細胞的任何基因?qū)嶓w。術(shù)語"報告物"雖然主要指的是可 見標(biāo)記例如綠色熒光蛋白（GFP)，但是也可以用來與標(biāo)記互換?？珊Y選標(biāo)記可以是顯性的或 隱性的或雙向的。
[0019] 本文中使用的術(shù)語"可操作地連接"指的是將多核苷酸元件以有功能的方式連接。 當(dāng)核酸和其他核酸序列以有功能的方式連接時，它是"可操作地連接"。例如，如果啟動子或 增強子能夠影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它就是與編碼序列可操作地連接。可操作地連接意味著 被連接的DNA序列通常是連續(xù)的，且當(dāng)必須連接兩個蛋白編碼區(qū)時，應(yīng)當(dāng)連續(xù)并處于讀碼 框內(nèi)。
[0020] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"多肽"可以互換使用，并且是指由氨基酸的鏈組成的分子，不涉 及作用、尺寸、三維結(jié)構(gòu)或來源的特定模式。
[0021] "真菌（fungi) "（奇異的霉菌（fungus))在此理解為在外部消化它們的食物、吸收 營養(yǎng)物分子到它們的細胞的異養(yǎng)真核微生物。真菌是真核生物的一個單獨的王國，并且包 括酵母菌、霉菌和蘑燕。本文所用的術(shù)語真菌、霉菌和由真菌引起的（fungal)從而明確包 括酵母菌以及絲狀真菌。
[0022] 術(shù)語"基因"是指一條DNA片段，它包括在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄成RNA分子（如mRNA)的 區(qū)域（轉(zhuǎn)錄區(qū)域），可操作地連接至合適的調(diào)節(jié)的區(qū)域（如啟動子）。基因通常包括幾個 可操作連接的片段例如啟動子、5'前導(dǎo)序列，編碼區(qū)和包括多聚腺苷酸化位點的3'非翻譯 (nontranslated)序列（3'端）。"基因的表達"指的是其中可操作地連接到合適的調(diào)節(jié)的 區(qū)域（特別是啟動子）的DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成RNA的過程，這是生物活性的，即它能夠被翻譯 成具有生物活性的蛋白或肽。
[0023] 當(dāng)術(shù)語"同源的"用來指示給定的（重組的）核酸或多肽分子與給定的宿主生物 或宿主細胞之間的關(guān)系時，應(yīng)理解為是指在自然界中的核酸或多肽分子是由同一物種的， 優(yōu)選同一品種或菌株的宿主細胞或生物產(chǎn)生的。如果是同源宿主細胞，編碼多肽的核酸序 列通常（但不一定）比其天然環(huán)境被可操作地連接到另一個（異源的）啟動子序列和，如 果適用，另一個（異源）的分泌信號序列和/或終止子序列?？梢岳斫獾氖钦{(diào)控序列、信號 序列、終止子序列等也可以在同源宿主細胞中。在本文中，僅"同源"序列中的元素的使用 允許"自我克隆"轉(zhuǎn)基因生物（GM0公司）（此處的自我克隆定義如歐盟指令98/81/EC附錄 II)的構(gòu)建。當(dāng)用于指示兩個核酸序列的關(guān)聯(lián)性時，術(shù)語"同源的"是指可以雜交成互補單 鏈核酸序列的單鏈核酸序列。雜交的程度可以依賴于許多因素，包括序列之間的同一性的 量以及雜交條件如后面所討論的溫度和鹽濃度。
[0024] 當(dāng)用在關(guān)于核酸（DNA或RNA)或蛋白質(zhì)時，術(shù)語"異源的"和"外源的"指的是不作 為其存在的生物、細胞、基因組或DNA或RNA序列中自然出現(xiàn)的部分的核酸或蛋白質(zhì)，或者 說是在細胞或位置或地點中的基因組或DNA或RNA序列中發(fā)現(xiàn)的不同于其在自然界中發(fā)現(xiàn) 的核酸或蛋白質(zhì)。異源的和外源的核酸或蛋白質(zhì)針對其被引入的細胞而言不是內(nèi)源的，但 是已經(jīng)從其它細胞或合成或重組地產(chǎn)生而獲得通常，盡管不一定，此類核酸編碼的蛋白質(zhì) (即外源的蛋白質(zhì)）并不是通過其中DNA被轉(zhuǎn)錄或表達的細胞正常產(chǎn)生的。用于編碼蛋白 質(zhì)的相似的外源的RNA通常在存在該外源的RNA的細胞中不表達。異源的/外源的核酸和 蛋白質(zhì)也可以被稱作外來核酸或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員之一將會認(rèn)為本文的術(shù)語異源的 或外源的核酸或蛋白質(zhì)對于細胞來說包括在其中的表達的任何核酸或蛋白質(zhì)是外來的。術(shù) 語異源的和外源的也同樣適用于核酸或氨基酸序列的非天然組合，即其中至少兩個組合的 序列相對于彼此是外來的。
[0025] 酶的"比活性"此處應(yīng)理解為是指每總的宿主細胞蛋白質(zhì)的量中特定的酶的活性 的量，通常表示為每毫克總的宿主細胞蛋白質(zhì)中酶的活性的單位。在本發(fā)明的上下文中，特 定的酶的比活性相比于（其它相同）野生型宿主細胞中的酶的比活性可以增加或減少。
[0026] "厭氧條件"或厭氧發(fā)酵方法在本文中定義為在缺氧的情況下，或者在其中基本不 消耗氧，優(yōu)選地消耗小于5. 0、2. 5或1毫摩爾/升/小時，更優(yōu)選0毫摩爾/升/小時（即氧 消耗不可檢出）的條件或發(fā)酵過程中運行，并且其中有機分子用作電子給體和電子受體。

【具體實施方式】
[0027] 外源乙醛脫氫酶在酵母中的表達使酵母轉(zhuǎn)化乙酸為乙醇，該乙酸可以存在于高含 量的木質(zhì)纖維素水解液中。乙酸到乙醇對NADH依賴性的減少已被提出作為在釀酒酵母的 厭氧葡萄糖生長培養(yǎng)基中作為氧化還原槽（redox sink)以用于甘油形成的替代，從而為在 工業(yè)化乙醇生產(chǎn)中生產(chǎn)甘油（作為副產(chǎn)品）的消除提供化學(xué)計量基準(zhǔn)，并且因此具有較高 的乙醇產(chǎn)量（Guadalupe等.如上文）。然而，這些反應(yīng)的化學(xué)計量是這樣的：1分子的乙 酸還原成為乙醇將需要兩個甘油分子不能夠被生產(chǎn)。然而本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，事實上通常 存在于工業(yè)的木質(zhì)纖維素水解液中的乙酸的量為使得其將乙酸還原為乙醇所需要的NADH 的量，該NADH的量超過了在厭氧環(huán)境下酵母的生長中，阻止甘油產(chǎn)生的變成可用的NADH的 量。本發(fā)明的發(fā)明人如今已驚奇地發(fā)現(xiàn)，極大量的乙酸能夠由酵母菌通過同時消耗甘油以 還原成為乙醇，而不是通過防止其產(chǎn)生。
[0028] 大量的甘油作為副產(chǎn)物，通過使用植物油或動物脂肪與醇的酯交換反應(yīng)的生物柴 油制取技術(shù)中產(chǎn)生。因此，作為在全球范圍內(nèi)的生物柴油制取技術(shù)增長的結(jié)果，預(yù)計在未來 幾年粗甘油的可利用性將增加。因此大量的甘油將以低成本利用。本發(fā)明提供的手段和方 法可以用于穩(wěn)定通過例如來自在生物柴油制取技術(shù)中作為副產(chǎn)物而得到的甘油的物價，該 方法通過將甘油轉(zhuǎn)化為可被用作生物燃料的乙醇。同時，本發(fā)明解決了存在于木質(zhì)纖維素 水解液中的高含量的乙酸抑制酵母菌將這些水解液生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵能力的問題。本發(fā)明的 另一個優(yōu)點是，使得在本發(fā)明的酵母菌細胞中的高滲透壓甘油響應(yīng)途徑（high-osmolarity glycerol response pathway)完好（相對于如上Guadalupe等描述的，（所有）磷酸甘油 脫氫酶基因失活的菌株），獲得了更強大的能夠更好的處理可能在工業(yè)發(fā)酵條件下出現(xiàn)的 滲透壓力的酵母菌株。
[0029] 本發(fā)明的第一方面涉及一種真菌宿主細胞，其包括編碼具有減少乙酰CoA轉(zhuǎn)化成 乙醛的能力的酶的外源基因，該基因賦予細胞將乙酸轉(zhuǎn)化為乙醇的能力。具有降低乙酰CoA 轉(zhuǎn)化成乙醛的能力的酶在本文中被理解為催化如下反應(yīng)的酶（A⑶H ;EC1. 2. 1. 10):
[0030] 乙醛 + NAD--- + 輔+_ Α ο 乙酰-輔_ A + NADH + Η---。
[0031] 因此，該催化乙酰CoA轉(zhuǎn)化為乙醛（反之亦然）的酶，也被稱作（乙?；蕾嘚AD 的）乙醛脫氫酶或乙酰CoA還原酶。所述酶可以是雙功能酶，它進一步催化乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇 (反之亦然，見下文）。為方便起見，在此我們將具有至少減少乙酰CoA轉(zhuǎn)化為乙醛或乙醇的 能力的酶稱為"乙醛脫氫酶"。本文進一步理解的是真菌宿主細胞具有內(nèi)源性乙酰-CoA合 成酶和乙醇脫氫酶活性，其允許細胞通過被提供乙醛脫氫酶活性，以實現(xiàn)乙酸轉(zhuǎn)化為乙醇。
[0032] 外源基因可以編碼僅具有乙醛脫氫酶活性（即僅具有降低乙酰CoA轉(zhuǎn)化為乙醛的 能力的酶）的單功能酶，例如由大腸桿菌mhpF基因編碼的乙醛脫氫酶。編碼具有乙醛脫氫 酶活性的酶的合適的外源基因包括編碼與SEQ ID N0:1至少具有45%、50%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸 序列。包括具有乙醛脫氫酶活性的單功能酶的原核生物的合適的例子如表1所示。這些單 功能酶的氨基酸序列在公共數(shù)據(jù)庫中可獲得，并且可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員使用，以設(shè)計編 碼相應(yīng)的單功能酶的最佳的核苷酸序列（參見例如SEQ ID NO :2)
[0033] 表1 :關(guān)于大腸桿菌mhpF基因的具有乙醛脫氫酶活性的酶
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種生產(chǎn)乙醇的方法，其中，該方法包括用酵母細胞發(fā)酵培養(yǎng)基的步驟，其中，所述 培養(yǎng)基含有或被供給： a) 己糖源和戊糖源中的至少一種； b) 乙酸源；以及 c) 甘油源， 所述酵母細胞以此發(fā)酵乙酸、甘油，以及己糖和戊糖中的至少一種成為乙醇，并且任選 地，回收乙醇，其中，所述酵母細胞包括編碼具有乙醛脫氫酶活性的酶的外源基因，該基因 賦予細胞將乙酸轉(zhuǎn)化為乙醇的能力，以及其中，所述酵母細胞包括編碼具有NAD+-連接的甘 油脫氫酶活性的酶的細菌基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述編碼具有乙醛脫氫酶活性的酶的外源基因 包括編碼具有下列氨基酸序列中的至少一種的氨基酸序列的核苷酸序列： i) 與SEQ ID NO: 1至少具有64%的氨基酸序列同一性， ii) 與SEQ ID N0:3至少具有76%的氨基酸序列同一性，以及 iii) 與SEQ ID N0:5至少具有61%的氨基酸序列同一性；以及 其中，所述編碼具有NAD+-連接的甘油脫氫酶活性的酶的細菌基因包括編碼與SEQ ID N0:7至少具有45%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述酵母細胞包括降低細胞中NAD+依賴性 甘油3-磷酸脫氫酶比活的基因修飾。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述降低細胞中NAD+依賴性甘油3-磷酸脫氫酶 的比活的基因修飾為降低或者失活編碼磷酸甘油脫氫酶的內(nèi)源基因的表達的基因修飾，所 述磷酸甘油脫氫酶具有與SEQ ID NO: 16至少具有70%的序列同一性的氨基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述酵母細胞包括增加二羥基丙酮激酶比 活的基因修飾，其中，所述基因修飾過表達編碼二羥基丙酮激酶的核苷酸序列，以及其中， 優(yōu)選地，所述編碼二羥基丙酮激酶的核苷酸序列包括編碼與SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9和 SEQ ID N0:25中的至少一中具有至少50%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序 列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2-5中任意一項所述的方法，其中，所述細胞還包括增加下列中的至 少一種的基因修飾： i) 特異性的乙酰-CoA合成酶活性，以及其中，優(yōu)選地，所述基因修飾過表達編碼乙 酰-CoA合成酶的核苷酸序列；以及 ii) 將甘油轉(zhuǎn)運到細胞中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，相比于由釀酒酵母（S. cerevisiae)ACSl基因編 碼的乙酰-CoA合成酶，所述編碼乙酰-CoA合成酶的核苷酸序列編碼的乙酰-CoA合成酶具 有更高的最大速率，或者其中，相比于由釀酒酵母ACS2基因編碼的乙酰-CoA合成酶，所述 編碼乙酰-CoA合成酶的核苷酸序列編碼的乙酰-CoA合成酶對醋酸具有更高的親和力，并 且其中，提高將甘油轉(zhuǎn)運到細胞中的所述基因修飾過表達編碼甘油攝取蛋白和甘油通道中 的至少一種的核苷酸序列，其中，優(yōu)選地，編碼甘油攝取蛋白的核苷酸序列包括編碼與SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11中的至少一種具有至少50%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列 的核苷酸序列，以及其中，優(yōu)選地，編碼甘油通道的核苷酸序列包括編碼與SEQ ID N0:12的 250位和530位氨基酸之間的氨基酸序列具有至少30%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列 的核苷酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中，所述基因修飾在厭氧條件下增加特異性的乙 酰-CoA合成酶活性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2-8中任意一項所述的方法，其中，所述酵母細胞至少包括： i) 功能化的外源性木糖異構(gòu)酶基因，該基因賦予細胞將木糖異構(gòu)化為木酮糖的能力； 以及 ii) 編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶的 功能化的外源基因，這些基因一起賦予細胞將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖-5-磷酸的能 力，以及其中，優(yōu)選地，所述酵母細胞包括至少一種另外的基因修飾，該基因修飾導(dǎo)致的特 性選自由以下特性所組成的組中： a) 增加木酮糖激酶的比活； b) 增加磷酸戊糖途徑的通量； c) 降低非特異性的醛糖還原酶比活； d) 增加木糖和阿拉伯糖中的至少一種到宿主細胞中的轉(zhuǎn)運； e) 降低對代謝產(chǎn)物阻遏的敏感性； f) 增加對乙醇、滲透壓或有機酸的耐受性；以及 g) 降低副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
10. 根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述酵母細胞為選自由酵母屬 (Saccharomyces)、克魯維酵母屬（Kluyveromyces)、假絲酵母屬（Candida)、畢赤酵母屬 (Pichia)、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬（Hansenula)、克勒克酵母屬 (Kloeckera)、許旺酵母屬（Schwanniomyces)和耶氏酵母屬（Yarrowia)所組成的組中的 屬。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述酵母細胞屬于選自由釀酒酵 母（S. cerevisiae)、少孢酵母（S. exiguus)、貝酵母（S. bayanus)、乳酸克魯維酵母 (K. lactis)、馬克斯克魯維酵母（K.marxianus)和栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)所組成的組中的種。
12. 根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基含有或者被供給木質(zhì)纖 維素水解液。
13. 根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中，所述酵母細胞在厭氧條件下發(fā)酵。
14. 一種酵母細胞，該酵母細胞含有： a) 編碼具有乙醛脫氫酶活性的酶的外源基因，該基因賦予細胞將乙酸轉(zhuǎn)化成乙醇的能 力；以及 b) 編碼具有NAD+-連接的甘油脫氫酶活性的酶的細菌基因， 由此，所述酵母細胞不包括降低細胞中特異性的NAD+依賴性甲酸脫氫酶活性的基因修 飾的酵母細胞。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述酵母細胞如權(quán)利要求2-11中任意一項所 定義。
【文檔編號】C12P7/10GK104126011SQ201280059218
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月30日
【發(fā)明者】J·A·M·德邦, A·W·R·H·托伊尼森, P·克阿拉森, W·W·A·哈特曼, S·范博伊塞克姆 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)有限公司