具有木聚糖酶活性的多肽以及編碼它們的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性、催化結(jié)構(gòu)域、和碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，以及編碼這些多肽、催化結(jié)構(gòu)域、和碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用這些多肽、催化結(jié)構(gòu)域、和碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。
【專利說明】具有木聚糖酶活性的多肽以及編碼它們的多核苷酸
[0001]關(guān)于在聯(lián)邦政府資助的研究與開發(fā)下完成的發(fā)明的權(quán)利聲明
[0002]本發(fā)明是在受到政府資助的、在由能源部授予的合作協(xié)議DE-FC36-08G018080下做出的。政府在本發(fā)明中擁有一定權(quán)利。
[0003]對序列表的引用
[0004]本申請包含一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過引用結(jié)合在此。
[0005]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性、催化結(jié)構(gòu)域、和碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，以及編碼這些多肽、催化結(jié)構(gòu)域、和碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用這些多肽、催化結(jié)構(gòu)域、和碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。
[0007]相關(guān)技術(shù)說明
[0008]作為世界上最大規(guī)模的可再生生物質(zhì)資源的木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素、纖維素、以及半纖維素組成，其中后者中大部分是木聚糖。木聚糖酶(例如，內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶,EC3.2.1.8)水解木聚糖中的內(nèi)部β-1,4-木糖苷鍵(xylosidic linkage),以產(chǎn)生較小分子量的木糖和木-低聚體。木聚糖是由1，4-β-糖苷-連接的D-吡喃木糖形成的多糖。β_木糖苷酶催化短β (I —4)_低聚木糖的外切水解，以將連續(xù)的D-木糖殘基從非還原端移除。
[0009]纖維素是由β -1, 4-鍵連接的葡萄糖的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解β -連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在任意位置消化纖維素聚合物，使其易受纖維二糖水解酶的攻擊。纖維二糖水解酶從纖維素聚合物的末端順序釋放纖維二糖分子。纖維二糖是葡萄糖的水溶性β-1，4-連接的二聚體。葡糖苷酶將纖維二 糖水解成葡萄糖。
[0010]將木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化為乙醇具有如下優(yōu)點(diǎn)，即易于獲得大量原料、避免燃燒或填埋材料的可取性、以及乙醇燃料的清潔性?，F(xiàn)在認(rèn)為木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物、和城市固體廢物是生產(chǎn)乙醇的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(例如，葡萄糖)，就容易通過酵母將這些可發(fā)酵糖發(fā)酵成乙醇。
[0011]在本領(lǐng)域中存在通過補(bǔ)充另外的酶來改進(jìn)纖維素分解酶組合物的需求，以為木質(zhì)纖維素的降解增加效益并且為其提供具成本效益的酶溶液。
[0012]本發(fā)明提供了具有木聚糖酶活性的多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，這些多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0014](a)與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；[0015](b)由在至少高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0016](c)由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；
[0017](d)在一個(gè)或多個(gè)(例如若干個(gè))位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQID NO: 2的成熟多肽的變體；以及
[0018](e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或⑷的多肽的一個(gè)片段。
[0019]本發(fā)明還涉及包括選自下組的催化結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0020](a)與SEQ ID NO:2的氨基酸23至342具有至少80%序列一致性的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；
[0021](b)由在至少高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列；或其全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；
[0022](c)由與SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；
[0023](d)在一個(gè)或多個(gè)位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸23至342的變體；以及
[0024](e)具有增強(qiáng)纖維素分解活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片段。
[0025]本發(fā)明還涉及包括可操作地連接至一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:
[0026](a)與SEQ ID NO:2的氨基酸366至400具有至少80%序列一致性的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0027](b)由在至少非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435或其全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0028](c)由與SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435具有至少80%的序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；
[0029](d)在一個(gè)或多個(gè)位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸366至400的變體；以及
[0030](e)具有結(jié)合活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片段。
[0031]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的多核苷酸；包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、和重組宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)這些多肽的方法。
[0032]本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或包含木聚糖的材料的方法，這些方法包括:在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料或包含木聚糖的材料。在一個(gè)方面中，這些方法進(jìn)一步包括回收降解的或轉(zhuǎn)化的纖維素材料或包含木聚糖的材料。
[0033]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，這些方法包括:(a)在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物糖化纖維素材料或包含木聚糖的材料；(b)用一種或多種(例如，若干種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料或包含木聚糖的材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且(C)從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0034]本發(fā)明還涉及發(fā)酵一種纖維素材料或包含木聚糖的材料的方法，這些方法包括:用一種或多種(例如，若干種)發(fā)酵微生物發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料，其中該纖維素材料或包含木聚糖的材料在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一種酶組合物糖化。在一個(gè)方面中，發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料來生產(chǎn)一種發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)方面中，這些方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0035]本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸I至22或由其組成，該信號肽被可操作地連接至編碼一種蛋白質(zhì)的基因，其中該蛋白質(zhì)對該信號肽而言是外源的；包括這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、以及重組宿主細(xì)胞；以及生產(chǎn)一種蛋白質(zhì)的方法。
[0036]附圖簡要說明
[0037]圖1 不出了膠囊青霉(Penicillium capsulatum)GHlO 木聚糖酶(P244K1)對研磨過篩的堿性預(yù)處理的玉米芯在50°C _60°C下由一種酶組合物水解為葡萄糖的作用。
[0038]圖2示出了膠囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)對研磨過篩的堿性預(yù)處理的玉米芯在50°C _60°C下由一種酶組合物水解為木糖的作用。
[0039]定義
[0040]乙酰木聚糖酯酶:術(shù)語“乙酰木聚糖酯酶”是指一種催化乙?；鶊F(tuán)從聚合木聚糖、乙酰化的木糖、乙 ?；钠咸烟?、α -萘基乙酸酯、以及對-硝基苯基乙酸酯上水解的羧酸酯酶(EC3.1.1.72)。出于本發(fā)明的目的，在50mM包含0.01% TWEEN?20(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯)的乙酸鈉(PH5.0)中，使用0.5mM對-硝基苯基乙酸酯作為底物確定乙酰木聚糖酯酶活性。將一單位的乙酰木聚糖酯酶定義為在PH5下、在25°C下，能夠每分鐘釋放I微摩的對-硝基苯酚陰離子的酶量。
[0041]等位變體:術(shù)語“等位變體”是指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可變形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽中無改變)，或可以編碼出具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0042]a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:術(shù)語“ a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶”是指一種催化a _L_阿拉伯糖苷中的末端非還原a-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基水解的a-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(arabinofuranohydrolase) (EC3.2.1.55)。這種酶作用于a -L-阿拉伯呋喃糖苷、包含(1，3)_和/或(1，5)_鍵的a-L-阿聚糖、阿糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶還被稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、C1-L-阿拉伯糖苷酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、聚糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本發(fā)明的目的，使用5mg的中等粘度小麥阿糖基木聚糖(愛爾蘭麥格酶國際有限公司(Megazyme InternationalIreland, Ltd.)，布雷，威克洛郡，愛爾蘭(Bray, C0.Wicklow, Ireland)) /ml 的 IOOmM 乙酸鈉
(pH5)，總體積為200 μ 1，在40°C下持續(xù)30分鐘，隨后通過.AM丨NEX? HPX-87H柱色譜法
(伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.),赫拉克勒斯,加利福尼亞州，美國(Hercules, CA, USA))進(jìn)行阿拉伯糖分析來確定a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0043]α -葡萄糖醛酸酶:術(shù)語“ α -葡萄糖醛酸酶”是指一種催化α -D-葡萄糖醛酸苷(glucuronoside)向D-葡萄糖醛酸酯和乙醇的水解的a-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶(glucuronohydrolase) (EC3.2.1.139)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù) de Vries (德弗里斯)，1998, J.Bacteriol.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)180:243-249確定α-葡萄糖醛酸酶活性。一單位的α -葡萄糖醛酸酶等于在ρΗ5下、在40°C下，能夠每分鐘釋放I微摩的葡萄糖醛酸或4-0-甲基葡萄糖醛酸的酶量。
[0044]β -葡糖苷酶:術(shù)語“ β -葡糖苷酶”是指一種催化末端非還原β -D-葡萄糖殘基水解而釋放β-D-葡萄糖的β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù) Venturi (文圖里)等人，2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production, purification and some biochemicalproperties (來自嗜熱毛殼菌變種嗜糞毛殼菌的細(xì)胞外β-D-葡糖苷酶:生產(chǎn)、純化以及一些生化特性)，J.Basic Microbiol.(《基礎(chǔ)微生物學(xué)雜志》)42:55-66的程序，使用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作為底物確定β-葡糖苷酶活性。將一單位的葡糖苷酶定義為在50mM包含0.01%TWEEN? 20的檸檬酸鈉中，在25°C下、在pH4.8下，由ImM作為
底物的對硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷每分鐘產(chǎn)生的1.0微摩的對-硝基苯酚陰離子。
[0045]β -木糖苷酶:術(shù)語“ β -木糖苷酶”是指一種催化短β (I — 4)-低聚木糖的外切水解，以將連續(xù)的D-木糖殘基從非還原端移除的β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。出于本發(fā)明的目的，將一單位的木糖苷酶定義為在IOOmM包含
0.01%TWEEN? 20的檸檬酸鈉中，在40°C下、在pH5下，由ImM作為底物的對硝基苯
基-β -D-木糖苷每分鐘產(chǎn)生的1.0微摩的對-硝基苯酚陰離子。
[0046]碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域:術(shù)語“碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指介導(dǎo)酶結(jié)合至纖維素底物的非晶區(qū)域的酶的區(qū)域。碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)典型地發(fā)現(xiàn)于酶的N末端處或C末端的端點(diǎn)處。
[0047]催化結(jié)構(gòu)域:術(shù)語“催化結(jié)構(gòu)域”是指含有酶的催化機(jī)構(gòu)的酶的區(qū)域。
[0048]cDNA:術(shù)語“cDNA”是指可以通過得自真核或原核細(xì)胞的，從成熟的、剪接的mRNA分子的反轉(zhuǎn)錄而制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。早先的初始RNA轉(zhuǎn)錄本是mRNA的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mRNA之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。
[0049]纖維二糖水解酶:術(shù)語“纖維二糖水解酶”是指一種催化纖維素、纖維寡糖、或任何包含β -1, 4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β -D-糖苷鍵的水解，從而從這條鏈的還原端(纖維二糖水解酶I)或非還原端(纖維二糖水解酶II)釋放纖維二糖的1，4-β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶(Ε.C.3.2.L 91 和Ε.C.3.2.1.176) (Teeri (泰利)，1997，Crystallinecellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases (結(jié)晶纖維素降解:纖維二糖水解酶功能的新見解)，Trends in Biotechnology (《生物技術(shù)趨勢》)15:160-167 ;泰利等人，1998，Biochem.Soc.Trans.(《生化學(xué)會學(xué)報(bào)》)26:173-178)。根據(jù)由Lever (萊韋爾)等人，1972，Anal.Biochem.(《分析生物化學(xué)》)47:273-279 ；vanTilbeurgh (范泰白勒夫)等人，1982, FEBS Letters (《歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(bào)》)，149:152-156 ;范泰白勒夫和Claeyssens (克萊伊森)，1985，《歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(bào)》，187:283-288 ;以及Tomme(多姆)等人，1988，Eur.J.Biochem.(《歐洲生物化學(xué)雜志》)170:575-581描述的 程序確定纖維二糖水解酶活性。
[0050]纖維素分解酶或纖維素酶:術(shù)語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”是指一種或多種(例如，若干種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括一種或多種內(nèi)切葡聚糖酶、一種或多種纖維二糖水解酶、一種或多種β-葡糖苷酶、或其組合。用于測量纖維素分解活性的兩種基本途徑包括:如在 Zhang(張)等人，Outlook for cellulase improvement:Screeningand selection strategies (纖維素酶改進(jìn)展望:篩選和選擇策略)，2006, BiotechnologyAdvances (《生物技術(shù)進(jìn)展》)24:452-481中所綜述，(I)測量總纖維素分解活性，以及(2)測量單獨(dú)的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)。通常使用不溶性底物測量總纖維素分解活性，這些不溶性底物包括瓦特曼Ne I濾紙(WhatmanNa lfilter paper)、微晶纖維素、細(xì)菌性纖維素、藻類纖維素、棉花、預(yù)處理的木質(zhì)纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定是將瓦特曼_I濾紙用作底物的濾紙測定。該測定是由國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)建立的(Ghose (高斯)，1987，Measurementof cellulase activities (纖維素酶活性的測量)，Pure Appl.Chem.(《純粹與應(yīng)用化學(xué)》)59:257-68)。
[0051]出于本發(fā)明的目的，通過測量在下述條件下由一種或多種纖維素分解酶進(jìn)行的纖維素材料水解的增加來確定纖維素分解酶活性:l_50mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS (或其他預(yù)處理的纖維素材料)中纖維素在適合的溫度(例如，50°C、55°C、或60°C)持續(xù)3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。典型的條件是:1ml反應(yīng)，洗滌的或未洗滌的PCS，5%不溶性固 體，50mM乙酸鈉pH5，ImM MnSO4, 50°C、55°C、或60°C，72小時(shí)，由
ΑΜΙΝΕΧ? HPX-87H柱(伯樂實(shí)驗(yàn)室有限公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國)進(jìn)行
糖分析。
[0052]纖維素材料:術(shù)語“纖維素材料”是指包含纖維素的任何材料。在生物質(zhì)的初生細(xì)胞壁中的主要多糖是纖維素，第二豐富的是半纖維素，并且第三豐富的是果膠。細(xì)胞停止生長之后產(chǎn)生的次生細(xì)胞壁也包含多糖，并且它通過與半纖維素共價(jià)交聯(lián)的聚合木質(zhì)素得到強(qiáng)化。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是線性β_ (1-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如具有一系列取代基的復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的木聚糖、木葡聚糖、阿糖基木聚糖、以及甘露聚糖。雖然纖維素通常是多形的，但在植物組織中發(fā)現(xiàn)的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶性結(jié)晶基體。半纖維素通常與纖維素以及其他半纖維素以氫鍵結(jié)合，這幫助穩(wěn)定細(xì)胞壁基質(zhì)。
[0053]纖維素通常發(fā)現(xiàn)于例如植物的莖、葉、殼、皮、和穗軸，或樹的葉、枝、和木材中。纖維素材料可以是，但不限于，農(nóng)業(yè)殘余物、草本材料(包括能源作物)、城市固體廢物、紙漿與造紙廠殘余物、廢紙、和木材(包括森林殘余物)(參見例如，Wiselogel (維塞勞格爾)等人，1995,在Handbook on Bioethanol (《生物乙醇手冊》)(CharlesE.Wyman (查爾斯E.懷曼),編輯),第105-118頁，Taylor (泰勒)&Francis (弗朗西斯)，華盛頓；懷曼，1994, Bioresource Technology (《生物資源技術(shù)》)50:3-16 ；Lynd (林德),1990, Applied Biochemistry and Biotechnology (《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》)24/25:695-719 ;Mosier (莫西爾)等人，1999, Recent Progress in Bioconversionof Lignocellulosics (木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的最新進(jìn)展)，Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology (《生化工程/生物技術(shù)進(jìn)展》)，T.Scheper (斯科皮爾),總編輯,第65卷,第23-40頁，Springer-Verlag(施普林格出版社)，紐約)中)。在此應(yīng)該理解的是，纖維素可以處于木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素、和半纖維素的植物細(xì)胞壁材料的形式。在一個(gè)優(yōu)選方面中，該纖維素材料是任何生物質(zhì)材料。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該纖維素材料是木質(zhì)纖維素，該木質(zhì)纖維素包括纖維素、半纖維素、以及木質(zhì)素。
[0054]在一個(gè)方面中，該纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是城市固體廢物。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是廢紙。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是木材(包括森林殘余物)。
[0055]在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是蘆竹屬植物。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是甘蔗渣。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是竹子。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是玉米芯。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是玉米纖維。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是玉米秸桿。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是芒屬植物。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是橙皮。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是稻秸。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是柳枝稷。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是麥秸。
[0056]在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是山楊。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是桉樹。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是冷杉。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是松樹。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是白楊。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是云杉。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是柳樹。
[0057]在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是藻類纖維素。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是細(xì)菌纖維素。在另一 個(gè)方面中，該纖維素材料是棉短絨。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是濾紙。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是微晶纖維素。在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是經(jīng)磷酸處理過的纖維素。
[0058]在另一個(gè)方面中，該纖維素材料是一種水生生物質(zhì)。如在此使用，術(shù)語“水生生物質(zhì)”是指在水生環(huán)境中通過光合作用過程產(chǎn)生的生物質(zhì)。水生生物質(zhì)可以是藻類、挺水植物、浮葉植物、或沉水植物。
[0059]纖維素材料可以按原樣使用或可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法經(jīng)受預(yù)處理，如在此所描述。在一個(gè)優(yōu)選方面中，該纖維素材料是經(jīng)預(yù)處理的。
[0060]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”是指多核苷酸，其直接明確多肽的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放讀碼框確定，其以起始密碼子例如ATG、GTG或TTG開始，并以終止密碼子例如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0061]控制序列:術(shù)語“控制序列”是指表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各個(gè)控制序列可以相對于編碼多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。這樣的控制序列包括但不局限于前導(dǎo)子，聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列，和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入特定限制性位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有接頭，以促進(jìn)這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸編碼區(qū)的連接。
[0062]內(nèi)切葡聚糖酶:術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”是指內(nèi)切_1，4-(1，3 ;l，4)-13-D_葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣多糖中的1，4-β-D-糖苷鍵，混合的β_1，3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β-1，4鍵，以及包含纖維素組分的其他植物材料的內(nèi)切水解。可以通過測量底物粘度的減小，或通過還原糖測定確定還原端增加來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性(張等人，2006，《生物技術(shù)進(jìn)展》24:452-481)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)高斯，1987，《純粹與應(yīng)用化學(xué)》59:257-268的程序，在pH5、40°C下，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物，確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。
[0063]表達(dá):術(shù)語“表達(dá)”包括產(chǎn)生多肽涉及的任何步驟，包括但不局限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
[0064]表達(dá)載體:術(shù)語“表達(dá)載體”是指包括編碼多肽的多核苷酸并且可操作地與提供了其表達(dá)的控制序列相連接的線性或環(huán)狀DNA分子。
[0065]家族61糖苷水解酶:術(shù)語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”是指根據(jù) Henrissat (亨利薩塔)B.，1991, A classification of glycosyl hydrolases basedon amino-acid sequence similarities (基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分類)，Biochem.J.(《生物化學(xué)雜志》)280:309-316，和亨利薩塔B.，和Bairoch (巴洛赫)A.，1996，Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases (糖基水角軍酶的基于序列的分類的更新)，《生物化學(xué)雜志》316:695-696,落入糖苷水解酶家族61中的一種多肽?；谝粋€(gè)家族成員的非常弱的內(nèi)切-1，4-β -D-葡聚糖酶活性的測量值，將這一家族中的酶類最初分類為一個(gè)糖苷水解酶家族。這些酶的結(jié)構(gòu)和作用方式是非典型性的并且不能認(rèn)為它們是真正的糖苷酶。然而，根據(jù)當(dāng)與一種纖維素酶或纖維素酶的混合物結(jié)合時(shí)，它們能夠增強(qiáng)木質(zhì)纖維素的分解，仍將它們保留在CAZy分類中。
[0066]阿魏酸酯酶:術(shù)語“阿魏酸酯酶”是指一種催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰(feruloyl))基團(tuán)從酯化的糖(其在天然生物質(zhì)底物中通常是阿拉伯糖)上水解的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰-糖水 解酶(EC3.1.1.73)，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸酯)。阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)還被稱為阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羥基肉桂酰酯酶、FAE-1I1、肉桂酰酯水解酶、FAEA, cinnAE、FAE-1、或FAE-1I。出于本發(fā)明的目的，在50mM乙酸鈉(pH5.0)中，使用0.5mM對-硝基苯基阿魏酸酯作為底物確定阿魏酸酯酶活性。一單位的阿魏酸酯酶等于在pH5下、在25°C下，能夠每分鐘釋放I微摩的對-硝基苯酚陰離子的酶量。
[0067]片段:術(shù)語“片段”是指具有不存在于成熟多肽或結(jié)構(gòu)域的氨基和/或羧基末端的一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))氨基酸的一種多肽或一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；其中該片段具有木聚糖酶活性或碳水化合物結(jié)合活性。在一個(gè)方面中，一個(gè)片段包含SEQ ID NO: 2的至少320個(gè)氨基酸殘基，例如至少340個(gè)氨基酸殘基或至少360個(gè)氨基酸殘基。
[0068]半纖維素分解酶或半纖維素酶:術(shù)語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”是指一種或多種(例如，若干種)水解半纖維素材料的酶。參見例如，Shallom(沙魯姆)，D.和Shoham (沙哈姆)，Y.Microbial hemicellulases (微生物的半纖維素酶).Current OpinionIn Microbiology (《微生物學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)》)，2003，6 (3): 219-228)。半纖維素酶是在植物生物量的降解中關(guān)鍵的組分。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于:乙酰甘露聚糖酯酶，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，香豆酸酯酶，阿魏酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖醛酸酶，葡萄糖醛酸(glucuronoyl)酯酶，甘露聚糖酶，甘露糖苷酶，木聚糖酶，以及木糖苷酶。這些酶(半纖維素酶)的底物是一異質(zhì)組的支鏈的以及線性的多糖，這些多糖經(jīng)由氫鍵連接至植物細(xì)胞壁中的纖維素微絲，從而將其交聯(lián)成一個(gè)強(qiáng)健的網(wǎng)絡(luò)。半纖維素酶還被共價(jià)地附接至木質(zhì)素，從而與纖維素一起形成高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。用于其完全降解，半纖維素酶的可變結(jié)構(gòu)和組織需要許多酶的協(xié)同作用。半纖維素酶的催化模塊是水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)或水解乙酸酯的酯鍵或阿魏酸側(cè)基的碳水化合物酯酶(CE)?；谄湟患壭蛄械耐葱裕梢詫⑦@些催化模塊分成GH和CE家族。一些具有總體類似的折疊的家族可以被進(jìn)一步分組為按字母順序標(biāo)記的親族(clan)(例如，GH-A)。這些酶以及其他碳水化合物活性酶的最翔實(shí)并更新的分類在碳水化合物-活性酶(CAZy)數(shù)據(jù)庫中是可獲得的。可以根據(jù)高斯和Bisaria (比薩拉)，1987，Pure&App1.Chem.(《純粹和應(yīng)用化學(xué)》)59:1739-1752，在適合的溫度(例如，501:、551:、或60°0、和？!1(例如，5.0或5.5)下測量半纖維素分解酶活性。
[0069]高嚴(yán)謹(jǐn)度條件:術(shù)語“高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn) DNA 印跡(Southern blotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0.3% SDS、200 微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS，在65°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0070]宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指對轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等敏感的任何細(xì)胞類型，其具有包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0071]分離的:術(shù)語“分離的”是指處于非天然發(fā)生的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(I)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，(2)任何物質(zhì)，包括但不局限于從與其性質(zhì)上相關(guān)的一種或多種或所有天然發(fā)生的組分至少部分除去的任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3) 相對于自然中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，由人手工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動子更強(qiáng)的啟動子)。
[0072]低嚴(yán)謹(jǐn)度條件:術(shù)語“低嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE.0.3% SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0073]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”是指在翻譯和任何翻譯后修飾(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的一種多肽。在一個(gè)方面中，基于預(yù)測SEQ ID NO: 2的氨基酸I至22是一個(gè)信號肽的SignalP程序(Nielsen (尼爾森)等人，1997, Protein Engineering(《蛋白質(zhì)工程》)10:1-6),該成熟多肽是SEQ ID N0:2的氨基酸23至400(P244K1)。在本領(lǐng)域中已知的是，一個(gè)宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多肽(即，具有一個(gè)不同的C-末端和/或N-末端的氨基酸)的混合物。
[0074]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”是指編碼具有木聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個(gè)方面中，基于預(yù)測SEQ ID NO:1的核苷酸I至66編碼一個(gè)信號肽的SignalP程序(尼爾森等人，1997，同上)，該成熟多肽編碼序列是SEQ ID Ν0:1的核苷酸 67 至 1435 (D72Z3A)或其 cDNA 序列。
[0075] 中嚴(yán)謹(jǐn)度條件:術(shù)語“中嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE.0.3% SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0.2%SDS，在55 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0076]中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件:術(shù)語“中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42°C下在5X SSPE.0.3% SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2XSSC,0.2% SDS，在60°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0077]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會另外出現(xiàn)的方式被修飾成包含核酸區(qū)段的、或合成的單鏈或雙鏈的核酸分子，它包含一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0078]可操作地連接的:術(shù)語“可操作地連接的”是指其中一個(gè)控制序列位于相對于一個(gè)多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置處，這樣使得該控制序列指導(dǎo)該編碼序列的表達(dá)的配置。
[0079]具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽:術(shù)語“具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽”是指催化由具有纖維素分解活性的酶水解纖維素材料的增強(qiáng)的GH61多肽。出于本發(fā)明的目的，通過測量在以下條件下來自由纖維素分解酶對纖維素材料的水解的還原糖的增加或纖維二糖和葡萄糖的總和的增加來確定增強(qiáng)纖維素分解活性:l-50mg的總蛋白/g的預(yù)處理的玉米秸桿(PCS)中的纖維素在適合的溫度(例如40°C-80°C，如50°C、55°C、60°C、65°C、或70°C )和適合的pH(例如，4-9，如5.0,5.5,6.0,6.5、或7.0)下持續(xù)1-7天，其中總蛋白由50-99.5% w/w纖維素分解酶蛋白和0.5-50% w/w具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽的蛋白組成，與不具有增強(qiáng)纖維素分解活性的相等的總蛋白負(fù)載的對照水解(l-50mg的纖維素分解蛋白/g的PCS中的纖維素)進(jìn)行比較。在一個(gè)優(yōu)選方面中，將在2-3%的總蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014，重組產(chǎn)生于米曲霉中)或2_3%的總蛋白重量煙曲霉β-葡糖苷酶(如描述于W02002/095014中，重組產(chǎn)生于米曲霉中)的纖維素酶
蛋白負(fù)載的存在下的CTELLUCLAST? 1.5L (諾維信公司，巴格斯韋德(Bagsv$rd )，丹
麥)的混合物用作纖維素分解活性的來源。
[0080]具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽通過將達(dá)到相同程度的水解所需的纖維素分解酶優(yōu)選地減少至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍來增強(qiáng)由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解。
[0081]預(yù)處理的玉米秸桿:術(shù)語“PCS”或“預(yù)處理的玉米秸桿”是指來源于由加熱和稀硫酸處理、堿預(yù)處理、中性預(yù)處理、或本領(lǐng)域已知的任何預(yù)處理的玉米秸桿的纖維素材料。
[0082]序列一致性:用參數(shù)“序列一致性”來描述兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性。
[0083]出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性，該算法如 EMBOSS 軟件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件)，Rice (賴斯)等人,2000, Trends Genet.(《遺傳學(xué)趨勢》)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle (尼德爾)程序所實(shí)施的。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用尼德爾(Needle)標(biāo)記為“最長一致性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性并且被計(jì)算如下:
[0084](一致的殘基XlOO)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0085]出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)確定兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件)，賴斯等人，2000，同上)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的Needle程序所實(shí)施的。使用的這些參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。使用Needle (尼德爾)標(biāo)記為“最長一致性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性并且被計(jì)算如下:
[0086](一致的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0087]子序列:術(shù)語“子序列”是指具有從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失的一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))核苷酸的多核苷酸；其中該子序列編碼具有木聚糖酶活性的片段。在一個(gè)方面中，子序列包含SEQ ID NO:1的至少960個(gè)核苷酸，例如至少1020個(gè)核苷酸或至少1080個(gè)核苷酸。 [0088]變體:術(shù)語“變體”是指具有木聚糖酶活性的、包含一個(gè)改變(即在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處的一個(gè)取代、插入和/或缺失)的一個(gè)多肽。取代是指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸被一個(gè)不同的氨基酸替代；缺失是指占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸的移除；并且插入是指鄰近于并且緊跟著占據(jù)一個(gè)位置的氨基酸之后添加一個(gè)氨基酸。
[0089]非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件:術(shù)語“非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡(Southern blotting)程序,在42°C下在5X SSPE>0.3%SDS,200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS，在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0090]非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件:術(shù)語“非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡(Southern blotting)程序,在42°C下在5X SSPE>0.3%SDS、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。載體材料最終使用2X SSC、0.2% SDS，在45°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0091]包含木聚糖的材料:術(shù)語“包含木聚糖的材料”是指包含含有β -(1-4)-連接的木糖殘基的主鏈的植物細(xì)胞壁多糖的任何材料。陸生植物的木聚糖是具有i3-(l_4)-D-吡喃木糖主鏈的雜聚物，該主鏈由短的碳水化合物鏈支化。它們包括D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，這些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖組成?？梢詫⒛揪厶穷愋偷亩嗵欠殖赏茨揪厶?homoxylan)和異源木聚糖(heteroxylan)，異源木聚糖包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醒酸)阿糖基木聚糖、阿糖基木聚糖、以及復(fù)雜的異源木聚糖。參見例如,Ebringerova(艾柏林格勞威)等人，2005，Adv.Polym.Sc1.(《聚合物科學(xué)進(jìn)展》)186:1-67。
[0092]在本發(fā)明的工藝中，可以使用任何包含木聚糖的材料。在一個(gè)優(yōu)選方面中，該包含木聚糖的材料是木質(zhì)纖維素。
[0093]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性:術(shù)語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”是指水解包含木聚糖的材料的生物活性。用于測量木聚糖分解活性的兩種基本途徑包括:(1)測量總的木聚糖分解活性，并且(2)測量單獨(dú)的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的測定的最近進(jìn)展總結(jié)于若干出版物中，這些出版物包括 Biely (別雷)和 Puchard (普查德)，2006, Journal of the Science of Foodand Agriculture (《食品與農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志》)86 (11): 1636-1647 ;Spanikova (斯帕尼克娃)和別雷，2006，《歐洲生化學(xué)會聯(lián)合會快報(bào)》580(19):4597-4601 ;Herrmann (赫爾曼)，Vrsanska (娃贊斯卡),Jurickova (朱莉科瓦),Hirsch (赫施),別雷,和Kubicek (庫比切克)，1997，Biochemical Journal (《生物化學(xué)雜志》)321:375-381。
[0094]可以通過確定由不同類型的木聚糖(包括例如燕麥斯卑爾脫(oat spelt)、山毛櫸木材、以及落葉松木材木聚糖)形成的還原糖或通過光度確定由不同共價(jià)染色的木聚糖釋放的染色的木聚糖片段測量總木聚糖降解活性。最常見的總木聚糖分解活性測定基于由聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生的還原糖，如描述于別雷，別雷，Poutanen (坡泰恩)，1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity(用于木聚糖酶活性測定的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室測試方法)，Journal of Biotechnology (《生物技術(shù)雜志》)23(3):257-270中。還可以在37°C下，用0.2% AZCL-阿糖基木聚糖作為底物在0.01%
TRITON? X-100 (4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和200mM磷酸鈉緩沖液
(pH6)中確定木聚糖酶活性。將一單位的木聚糖酶活性定義為在200mM磷酸鈉(pH6)中，在37°C下、在pH6下，由作為底物的0.2% AZCL-阿糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0 μ摩爾的可可堿乙酸鈉。
[0095]出于本發(fā)明的目的，通過測量在以下典型條件下由一種或多種木聚糖降解酶水解樺木木聚糖(西格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical C0.，Inc.),圣路易斯市,密蘇里州，美國)的增加確定木聚糖降解活性:1ml反應(yīng)，5mg/ml底物(總固體)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mM乙酸鈉pH5，50°C，24小時(shí)，使用對羥基苯甲酸酰肼(PHBAH)測定進(jìn)行糖分析，如由萊韋爾，1972, A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates (用于碳水化合物的比色測定的新反應(yīng))，《分析生物化學(xué)》47:273-279描述。
[0096]木聚糖酶:術(shù)語“木聚糖酶”是指催化木聚糖中的1，4-β-D-木糖苷鍵的內(nèi)部水解的1，4-β -D-木聚糖-木聚糖水解酶(E.C.3.2.1.8)。出于本發(fā)明的目的，在37°C下，用
0.2% AZCL-阿糖基木聚糖作為底物在0.01 % TRITON? X-100和200mM磷酸鈉緩沖液
(pH6)中確定木聚糖酶活性。將一單位的木聚糖酶活性定義為在200mM磷酸鈉(pH6)中，在37°C下、在pH6下，由作為底物的0.2% AZCL-阿糖基木聚糖每分鐘產(chǎn)生1.0 μ mole的可可堿乙酸鈉。
[0097]本發(fā)明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的木聚糖酶活性的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、以及至少100%。
[0098]發(fā)明詳細(xì)說明[0099]具有木聚糖酶活性的多肽
[0100]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%，例如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的分離的多肽，這些多肽具有木聚糖酶活性。在一個(gè)方面中，這些多肽與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有多達(dá)10個(gè)(例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))氨基酸的差異。
[0101]本發(fā)明的多肽優(yōu)選地包括SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其等位變體，或由其組成；或?yàn)槠渚哂心揪厶敲富钚缘钠?。在另一個(gè)方面中，該多肽包括SEQ ID N0:2的成熟多肽或由其組成。在另一個(gè)方面中，該多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸23到400或由其組成。
[0102]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與以下雜交的多核苷酸編碼的具有木聚糖酶活性的分離多肽:(i) SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)其cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)體(Sambrook(薩姆布魯克)等人，1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，第二版,Cold Spring Harbor (冷泉港)，紐約)。
[0103]SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，連同SEQ ID NO: 2的多肽、其成熟多肽或其片段可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法用于設(shè)計(jì)核酸探針以鑒定和克隆來自不同屬或種的株系的、編碼具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。具體地說，可以使用此類探針，遵循標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，與感興趣細(xì)胞的基因組DNA或cDNA雜交，以便鑒定并分離出其中對應(yīng)的基因。這樣的探針可以大大短于整 個(gè)序列，但是長度應(yīng)該至少為15個(gè)，例如至少25個(gè)、至少35個(gè)、或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針的長度為至少100個(gè)核苷酸，例如長度為至少200個(gè)核苷酸、至少300個(gè)核苷酸、至少400個(gè)核苷酸、至少500個(gè)核苷酸、至少600個(gè)核苷酸、至少700個(gè)核苷酸、至少800個(gè)核苷酸、或至少900個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測相應(yīng)的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)。本發(fā)明涵蓋此類探針。
[0104]可以針對與以上描述的探針雜交并且編碼具有木聚糖酶活性的多肽的DNA對由這類其他株系制備的基因組DNA或cDNA庫進(jìn)行篩選。來自這類其他株系的基因組DNA或其他DNA可以通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其他分離技術(shù)來分離。可將來自文庫的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他合適的載體材料上。為了鑒定與SEQID NO: 1、其成熟多肽編碼序列或其子序列雜交的克隆或DNA，將該載體材料用于DNA印跡中。
[0105]出于本發(fā)明的目的，雜交是指，在非常低到非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，多核苷酸雜交到對應(yīng)于以下的標(biāo)記的核酸探針上:(i)SEQ ID NO:1 ;(ii)其成熟多肽編碼序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全長互補(bǔ)體；或(V)其一個(gè)子序列。在這些條件下與該核酸探針雜交的分子可以使用例如X射線薄膜或本領(lǐng)域中已知的任何其他檢測手段進(jìn)行檢測。
[0106]在一個(gè)方面中，該核酸探針是以下多核苷酸，該多核苷酸編碼SEQ ID N0:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一個(gè)方面中，該核酸探針是SEQ ID N0:1 ;其成熟多肽編碼序列；或其cDNA序列。[0107]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%，例如至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷酸編碼的具有木聚糖酶活性的分離多肽。
[0108]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在一個(gè)或多個(gè)(例如若干個(gè))位置處包含一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體。在一個(gè)方面中，引入進(jìn)SEQ IDNO: 2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個(gè)，例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè)。這些氨基酸變化可具有一個(gè)微小的性質(zhì)，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代或者插入；典型地I至30個(gè)氨基酸的小缺失；小氨基或羧基末端擴(kuò)展，例如氨基末端甲硫氨酸殘基；高達(dá)20至25個(gè)殘基的一個(gè)小接頭肽；或者通過改變凈電荷或另一種功能來促進(jìn)純化的一個(gè)小擴(kuò)展，例如一個(gè)多組氨酸束(tract)、一個(gè)抗原表位或者一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0109]保守取代的實(shí)例是在以下各組的范圍內(nèi):堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及甲硫氨酸)?？傮w上不會改變特異性活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且例如由H.Neurath (諾伊拉特)和R.L.Hill (希爾)1979年描述于The Proteins (《蛋白質(zhì)》)中,Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，紐約。常見取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly。 [0110]可替代地，氨基酸改變本質(zhì)是多肽的物理化學(xué)特性的改變。例如，氨基酸變化可以改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變pH最佳值等。
[0111]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知程序來鑒定多肽中的必需氨基酸，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham(坎寧安)和Wells (威爾斯)，1989, Science (《科學(xué)》)244:1081-1085)。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在該分子中的每一殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且對所得突變體分子的木聚糖酶活性進(jìn)行測試以鑒別對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見Hilton(希爾頓)等人，1996, J.Biol.Chem.(《生物化學(xué)雜志》)，271:4699-4708。酶活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用也可以通過對結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析來進(jìn)行確定，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記，與假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變相結(jié)合來進(jìn)行確定。參見例如de Vos (德福斯)等人，1992，Science (《科學(xué)》)255:306-312 ;Smith (史密斯)等人，1992，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)224:899-904 ;Wlodaver (沃勒達(dá)爾)等人，1992，F(xiàn)EBS Lett.(《歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)盟通訊》)309:59-64。還可以從與相關(guān)多肽的比對推斷鑒別必需氨基酸。
[0112]使用已知的誘變、重組和/或改組方法、隨后進(jìn)行一個(gè)相關(guān)的篩選程序可以做出單一或多種氨基酸取代、缺失和/或插入并對其進(jìn)行測試，這些相關(guān)的篩選程序例如由Reidhaar-Olson(瑞德哈爾-奧爾森)和Sauer (薩奧爾)，1988,《科學(xué)》241:53-57 ；Bowie (鮑依)和薩奧爾，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學(xué)院院刊》)86:2152-2156 ；W095/17413 ;或者W095/22625所描述的那些?？梢允褂玫钠渌椒ò?易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman(洛曼)等人，1991，《生物化學(xué)》30:10832-10837 ；美國專利號5，223，409 ；W092/06204)以及定區(qū)誘變(Derbyshire (德比希爾)等人，1986，Gene (《基因》)46:145 ；Ner(內(nèi)爾)等人，1988，《DNA》7:127)。
[0113]可以結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動化篩選方法來檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness (內(nèi)斯)等人，1999, Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)17:893-896)。編碼活性多肽的誘變的DNA分子可以回收自宿主細(xì)胞，并且使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法對其進(jìn)行迅速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。
[0114]本發(fā)明的多肽可以是一種雜合多肽，其中一個(gè)多肽的一個(gè)區(qū)域在另一個(gè)多肽的一個(gè)區(qū)域的N末端或C末端處融合。
[0115]本發(fā)明的多肽可以是一種融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一個(gè)多肽是在本發(fā)明多肽的N末端或C末端處融合。通過將編碼另一多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸而產(chǎn)生融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列，這樣使得它們在框內(nèi)并且使得融合多肽的表達(dá)處于相同的一個(gè)或多個(gè)啟動子和終止子的控制下。還可以使用內(nèi)含肽技術(shù)構(gòu)建融合多肽，其中在翻譯后產(chǎn)生融合多肽(Cooper (庫珀)等人，1993，EMBO J.(《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志》)12:2575-2583 ;Dawson (道森)等人，1994，《科學(xué)》266:776-779)。
[0116]融合多肽可以進(jìn)一步包括兩個(gè)多肽之間的一個(gè)切割位點(diǎn)。在分泌融合蛋白時(shí)，該位點(diǎn)被切割，從而釋放這兩個(gè)多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不局限于以下各項(xiàng)中披露的位點(diǎn):Martin(馬丁 )等人,2003, J.1nd.Microbiol.Biotechnol.(《工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》)3:56 8-576 ;Svetina(斯韋蒂納)等人，2000，J.Biotechnol.(《生物技術(shù)雜志》)76:245-251 ；Rasmussen (拉斯馬森)-Wilson (威爾遜)等人，1997, Appl.Environ.Microbiol.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)63:3488-3493 ;Ward(華德)等人，1995，Biotechnology (《生物技術(shù)》)13:498-503 ;以及 Contreras (孔特拉斯)等人，1991,Biotechnology (《生物技術(shù)》)9:378-381 ;Eaton(伊頓)等人，1986, Biochemistry (《生物化學(xué)》)25:505-512 ;Collins (柯林斯)-Racie (萊斯)等人，1995, Biotechnology (《生物技術(shù)》)13:982-987 ;Carter (卡特)等人，1989, Proteins: Structure, Function, andGenetics (《蛋白質(zhì):結(jié)構(gòu)、功能和遺傳學(xué)》)6:240-248 ;以及Stevens (史蒂文斯)，2003,Drug Discovery World(《世界藥物發(fā)現(xiàn)》)4:35-48。
[0117]具有木聚糖酶活性的多肽的來源
[0118]本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽可以從任何屬的微生物獲得。為了本發(fā)明的目標(biāo)，結(jié)合給定來源，如在此使用，術(shù)語“獲得自”應(yīng)指由該來源或由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的株系產(chǎn)生的多核苷酸編碼的多肽。在一個(gè)方面中，獲得自給定來源的多肽被分泌到細(xì)胞外。
[0119]在一個(gè)方面中，該多肽是一種青霉屬多肽。在一個(gè)方面中，該多肽是一種膠囊青霉多肽。在一個(gè)方面中，該多肽是一種膠囊青霉IBT4903多肽。
[0120]將理解的是，對于上述種類而言，本發(fā)明涵蓋完全狀態(tài)和不完全狀態(tài)兩者、以及其他分類學(xué)等效物，例如無性型，而忽略它們?yōu)槿怂姆N類名稱。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地識別鑒定適當(dāng)?shù)刃铩?br> [0121]公眾可在許多培養(yǎng)物保藏中心易于獲得這些種類的菌株，如美國種質(zhì)保存中心(ATCC)、德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH, DSMZ)、荷蘭菌種保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures, CBS)及美國農(nóng)業(yè)研究局專利菌種保藏中心，北方地區(qū)研究中心(NRRL) ο
[0122]該多肽可以從其他來源鑒別并獲得，這些其他來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物或者使用上述探針直接從天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)獲得的DNA樣品。用于直接地從天然生活環(huán)境分離微生物和DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。然后，可通過類似地對另一種微生物的基因組DNA或cDNA庫，或混合的DNA樣品進(jìn)行篩選來獲得編碼該多肽的多核苷酸。一旦已經(jīng)用一個(gè)或多個(gè)探針檢測到編碼一個(gè)多肽的一種多核苷酸，則可以通過利用對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說已知的技術(shù)來分離或克隆該多核苷酸(參見，例如薩拉布魯克等人，1989，同上)。
[0123]催化結(jié)構(gòu)域
[0124]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO:2的氨基酸23到342具有至少80%，例如至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的催化結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面中，這些催化結(jié)構(gòu)域包括的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2的氨基酸23到342具有多達(dá)10個(gè)(例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))氨基酸的差異。
[0125]該催化結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地包括SEQ ID NO:2的氨基酸23到342或其等位變體或由其組成；或?yàn)槠渚哂性鰪?qiáng)纖維素分解活性的片段。
[0126]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下(如上所定義)與SEQ IDNO:1的核苷酸67到1261 ;其cDNA序列；或其全長互補(bǔ)體雜交的多核苷酸編碼的催化結(jié)構(gòu)域(薩拉布魯克等人，1989，同上)。
[0127]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及由以下多核苷酸編碼的催化結(jié)構(gòu)域，這些多核苷酸與SEQ ID NO:1的核苷酸67到1261或其cDNA序列具有至少80%，例如至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。
[0128]編碼該催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸優(yōu)選地包括SEQ ID NO:1的核苷酸67到1261或其cDNA序列或由其組成，或?yàn)榘谀z囊青霉IBT4903中的序列。
[0129]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及SEQ ID NO:2的氨基酸23到342的催化結(jié)構(gòu)域變體，這些變體在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包含一個(gè)取代、缺失和/或插入。在一個(gè)方面中，引入SEQ ID N0:2的氨基酸23到342的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個(gè)，例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè)。
[0130]結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0131]在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO:2的氨基酸366到400具有至少80%，例如至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面中，這些碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2的氨基酸366到400具有多達(dá)10個(gè)(例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))氨基酸的差異。
[0132]該碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地包括SEQ ID NO: 2的氨基酸366到400或其等位變體或由其組成；或?yàn)槠渚哂刑妓衔锝Y(jié)合活性的片段。
[0133]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件、中高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下(如上所定義)與SEQ IDNO:1的1331到1435或其全長互補(bǔ)體雜交的多核苷酸編碼的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(薩拉布魯克等人，1989，同上)。
[0134]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及由以下多核苷酸編碼的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些多核苷酸與SEQ ID NO:1的核苷酸1331到1435具有至少80%，例如至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100%序列一致性。
[0135]編碼該碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多核苷酸優(yōu)選地包括SEQ ID NO:1的核苷酸1331到1435或由其組成，或?yàn)榘谀z囊青霉IBT4903中的序列。
[0136]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還涉及SEQ ID NO:2的氨基酸366到400的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域變體，這些變體在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))位置處包含一個(gè)取代、缺失和/或插入。在一個(gè)方面中，引入SEQ ID NO: 2的氨基酸366到400的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的數(shù)目多達(dá)10個(gè)，例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè)。
[0137]可操作地連接到該碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的催化結(jié)構(gòu)域可以來自水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。編碼催化結(jié)構(gòu)域的多核苷酸可以從任何原核、真核或其他來源獲得。
[0138]多核苷酸
[0139]本發(fā)明還涉及編碼如在此描述的本發(fā)明的多肽、催化結(jié)構(gòu)域、以及碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的多核苷酸。
[0140]用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的并且包括從基因組DNA或cDNA，或其組合進(jìn)行分離。來自基因組DNA的多核苷酸的克隆可以是有效的，例如通過使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選，以檢測具有共享的結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段。參見例如Innis (英尼斯)等人，1990, PCR:A Guide to Methods andApplication (PCR:方法和應(yīng)用指導(dǎo))，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，紐約?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(NASBA)。這些多核苷酸可以克隆自青霉屬株系或相關(guān)有機(jī)體，并且因此，例如可以是該多核苷酸多肽編碼區(qū)的等位變體或物種的變體。[0141]編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸的修飾對于合成實(shí)質(zhì)上類似于該多肽的多肽可能是必需的。術(shù)語“基本上類似于”該多肽是指該多肽的非天然發(fā)生的形式。這些多肽在一些工程化方式方面可以不同于從其天然來源分離的多肽，例如具體活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH、等方面不同的變體。這些變體可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列呈現(xiàn)的多核苷酸，通過引入不會改變該多肽的氨基酸序列，但對應(yīng)于預(yù)定用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子用法的核苷酸取代，或通過引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來構(gòu)建。對于核苷酸取代的一般描述，參見例如Ford(福特)等人，1991，ProteinExpression and Purification (《蛋白表達(dá)與純化》)2:95-107。
[0142] 核酸構(gòu)建體
[0143]本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，這些核酸構(gòu)建體包括可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，這個(gè)或這些控制序列指導(dǎo)該編碼序列在與這些控制序列可相容的條件下在適合宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
[0144]該多核苷酸可以按各種方式操縱以提供該多肽的表達(dá)。在插入載體之前對多核苷酸操作的適當(dāng)性或必需性取決于表達(dá)載體。用于利用重組DNA方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0145]該控制序列可以是一個(gè)啟動子，即，被宿主細(xì)胞識別以對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的一種多核苷酸。該啟動子包含轉(zhuǎn)錄控制序列，這些序列介導(dǎo)了該多肽的表達(dá)。該啟動子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變體、截短的及雜合啟動子，并且可以是由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。
[0146]在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，適合指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動子的實(shí)例是獲得自以下各項(xiàng)的啟動子:解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌α -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖鹿糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇蕓金芽孢桿菌cryIIIA基因(Agaisse (阿蓋斯)和Lereclus (里瑞克拉斯)，1994, MolecularMicrobiology (《分子微生物學(xué)》)13:97-107)、大腸桿菌Iac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(Egon (埃貢)等人，1988，Gene (《基因》)69:301-315)，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因(dagA)、和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(ViIIa(維拉)-Kamaroff (卡瑪諾夫)等人，1978，《美國國家科學(xué)院院刊》75:3727-3731)，連同tac啟動子(DeBoer (德波爾)等人，1983，《美國國家科學(xué)院院刊》80:21-25)。另外的啟動子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria(來自重組細(xì)菌的有用蛋白)”，Gilbert (吉爾伯特)等人，1980, Scientific American (《科學(xué)美國人》)，242:74-94 ;以及薩姆布魯克等人，1989，同上。串聯(lián)啟動子的實(shí)例披露在W099/43835 中。
[0147]在絲狀真菌宿主細(xì)胞中，用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是獲得自以下各項(xiàng)的基因的啟動子:構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶-樣蛋白酶(W096/00787)、鑲片鐮孢菌淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢菌Daria(達(dá)莉亞)(W000/56900)、鑲片鐮孢菌Quinn(奎恩)(W000/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻譯延伸因子，連同NA2tpi啟動子(來自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的修飾的啟動子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子；非限制性實(shí)例包括來自編碼中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動子，其中已經(jīng)用來自編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的構(gòu)巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換未翻譯的前導(dǎo)子)；及其突變的、截短的、和雜交的啟動子。其他啟動子描述于美國專利號6，011，147中。
[0148]在酵母宿主中，有用的啟動子獲得自以下各項(xiàng)的基因:釀酒酵母烯醇酶(ENOl)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3磷酸去氫酶(ADH1、ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)、以及釀酒酵母3磷酸甘油酸激酶。Romanos (羅馬諾斯)等人，1992, Yeast (《酵母》)8:423-488描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的啟動子。
[0149]該控制序列還可以是被宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3’末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可以用于本發(fā)明中。
[0150]用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyL)、以及大腸桿菌核糖體RNA (rrnB)的基因。
[0151]絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的:構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨 基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II1、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β -木糖苷酶、以及里氏木霉翻譯延伸因子。
[0152]酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的:釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素c (CYCl)、以及釀酒酵母甘油醛-3磷酸去氫酶。Romanos (羅馬諾斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主細(xì)胞的其他有用的終止子。
[0153]該控制序列還可以是在啟動子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩(wěn)定區(qū)，它增加該基因的表達(dá)。
[0154]適合的mRNA穩(wěn)定區(qū)的實(shí)例是從以下獲得的:蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(W094/25612)和枯草芽孢桿菌SP82基因(Hue (化)等人，1995，Journal ofBacteriology (《細(xì)菌學(xué)雜志》)177:3465-3471)。
[0155]該控制序列還可以是一個(gè)前導(dǎo)子，即一種對宿主細(xì)胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區(qū)。該前導(dǎo)子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5’末端。在宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)子都可以使用。
[0156]絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的:米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。
[0157]酵母宿主細(xì)胞的合適的前導(dǎo)子是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的:釀酒酵母烯醇酶(ENOl)、釀酒酵母3磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α -因子、和釀酒酵母醇去氫酶/甘油醛-3磷酸去氫酶(ADH2/GAP)。
[0158]控制序列還可以是一種多腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3’末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識別為將多腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號的序列。可以使用在宿主細(xì)胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
[0159]用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選多腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的:構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶。
[0160]Guo (郭)和 Sherman (謝爾曼)，1995,Mol.Cellular Biol.(《分子與細(xì)胞生物學(xué)雜志》)15:5983-5990描述了酵母宿主細(xì)胞的有用的多腺苷酸化序列。
[0161]控制序列也可以是編碼與多肽的N端連接并指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路的信號肽的信號肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’端本身可包含在翻譯閱讀框中天然與編碼多肽的編碼序列區(qū)段相連接的信號肽編碼序列?？商娲兀幋a序列的5’端可以包含對編碼序列是外源的信號肽編碼序列。該編碼序列不天然地包含一個(gè)信號肽編碼序列時(shí)，可能需要外源信號肽編碼序列?？商娲?，外源信號肽編碼序列可簡單地替換天然的信號肽編碼序列以便增強(qiáng)該多肽的分泌。然而，指導(dǎo)所表達(dá)的多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌通路中的任何信號肽編碼序列都可以使用。
[0162]細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的信號肽編碼序列:芽孢桿菌NCIB11837麥芽淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草 芽孢桿菌prsA。Simonen(西蒙納)和Palva(帕爾瓦)，1993,Microbiological Reviews (《微生物學(xué)評論》)57:109-137描述了另外的信號肽。
[0163]絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的信號肽編碼序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0164]對酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的:釀酒酵母α -因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶。Romanos (羅馬諾斯)等人，1992，同上，描述了其他有用的信號肽編碼序列。
[0165]該控制序列還可以是編碼位于多肽的N末端處的前肽的一個(gè)前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原一般是無活性的并且可以通過從該多肽原上催化切割或自動催化切割前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因中獲得:枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。
[0166]在信號肽和前肽序列兩者都存在的情況下，該前肽序列是緊跟在多肽的N末端之后定位，并且該信號肽序列是緊跟在該前肽序列的N末端之后定位。
[0167]還可以希望添加調(diào)控序列，這些調(diào)控序列相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)控多肽的表達(dá)。調(diào)控序列的實(shí)例是使得基因表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)而打開或關(guān)閉的那些。在原核系統(tǒng)中的調(diào)控序列包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKAa-淀粉酶啟動子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子、和里氏木霉纖維二糖水解酶II啟動子。調(diào)控序列的其他實(shí)例為允許基因擴(kuò)增的那些調(diào)控序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在氨甲蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。
[0168]表達(dá)載體
[0169]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。不同核苷酸和控制序列可以接合在一起以產(chǎn)生一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))便利的限制性位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)處進(jìn)行編碼該多肽的多核苷酸的插入或取代?？商娲兀摱嗪塑账峥梢酝ㄟ^將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入供表達(dá)的適當(dāng)載體中來進(jìn)行表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列是位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0170]重組表達(dá)載體可以是可以便利地經(jīng)受重組DNA程序并且可引起多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0171]該載體可以是一種自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，該載體的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。該載體可以包含用于確保自我復(fù)制任 何裝置?？商娲?，該載體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒、或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含了有待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總DNA)、或轉(zhuǎn)座子。
[0172]載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物提供針對殺生物劑或病毒的抗性、提供針對重金屬的抗性、為營養(yǎng)缺陷型提供原養(yǎng)型等。
[0173]細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因、或賦予抗生素抗性(例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。用于酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記包括，但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不局限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑-琥拍羧胺合酶)、adeB (磷酸核糖-氨基咪唑合成酶)、amdS (乙酰胺酶)、argB (鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar (草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD (硝酸還原酶)、PyrG (乳清酸核苷-5’磷酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpC (鄰氨基苯甲酸合成酶)、連同其等效物。優(yōu)選在曲霉屬細(xì)胞中使用的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌bar基因。優(yōu)選在木霉屬細(xì)胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
[0174]選擇性標(biāo)記可以是在W02010/039889中描述的雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。在一個(gè)方面中，雙選擇性標(biāo)記是hph-tk雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。
[0175]載體優(yōu)選地包含允許該載體整合到宿主細(xì)胞的基因組或允許該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組而自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。
[0176]對于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一個(gè)或多個(gè)精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置處整合的可能性，這些整合的元件應(yīng)該包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10，000個(gè)堿基對、400至10，000個(gè)堿基對、以及800至10，000個(gè)堿基對，這些堿基對與對應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，通過非同源重組可以將該載體整合到該宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。
[0177]對于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞內(nèi)起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制因子。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制因子”是指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0178]細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、PACYC177、以及pACYC184以及允許在芽孢桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060、以及ρΑΜβ I的復(fù)制起點(diǎn)。
[0179]用于在酵母宿主細(xì)胞內(nèi)使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米的復(fù)制起點(diǎn)、ARS1、ARS4、ARSl與CEN3的組合、以及ARS4與CEN6的組合。
[0180]在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI (Gems (格姆斯)等人，1991，Gene (《基因》 )98:61-67 ;Cullen(卡倫)等人，1987，《核酸研究》15:9163-9175 ；W000/24883)。根據(jù)W000/24883中披露的方法可以實(shí)現(xiàn)AMAl基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建。
[0181]可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個(gè)額外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過包含一個(gè)可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因與該多核苷酸可以獲得增加的多核苷酸拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)選擇性試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因拷貝和由此額外的多核苷酸拷貝的細(xì)胞。
[0182]用于連接上文所述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是熟知的(參見，例如Sambrook(薩拉布魯克)等人，1989，同上)。
[0183]宿主細(xì)胞
[0184]本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞包括可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，這個(gè)或這些控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來源。
[0185]該宿主細(xì)胞可以是在重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽中有用的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
[0186]原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括，但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、土芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、大洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括，但不限于彎曲桿菌屬、大腸桿菌、黃桿菌屬、梭桿菌屬、螺桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟球菌屬、假單胞菌屬、沙門菌屬和脲原體屬。
[0187]細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌屬細(xì)胞，包括但不局限于嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
[0188]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞，包括但不局限于似馬鏈球菌、化膿鏈球菌、乳房鏈球菌、以及馬鏈球菌獸疫亞種細(xì)胞。
[0189]細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌細(xì)胞，包括但不局限于不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰鏈絲菌、以及變鉛青鏈霉菌細(xì)胞。
[0190]通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，Chang(常)和Cohen(科恩)，1979, Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學(xué)與基因組》)168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見，例如，Young(楊格)和Spizizen(斯皮茲曾),1961, J.Bacteriol.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)81:823-829 ；或者Dubnau (杜博楠)和Davidoff-Abelson (大衛(wèi)多夫-阿貝爾森)，1971,《分子生物學(xué)雜志》56:209-221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa(茂川)和Dower (道爾)，1988，Biotechniques ( 《生物技術(shù)》)6:742-751)、或者軛合(參見，例如Koehler (凱勒)和Thorne (索恩)，1987，J.Bacteriol.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)169:5271-5278)可以實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌細(xì)胞之中。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見例如，Hanahan (哈那汗)，1983，J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》)166:557-580)或電穿孔(參見例如，Dower (道爾)等人，1988，《核酸研究》16:6127-6145)可以實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞中。通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見例如，Gong (宮)等人,2004, Folia Microbiol.(《微生物學(xué)報(bào)》)(Praha (布拉格))49:399-405)、軛合(參見，例如，Mazodier (馬佐迪耶)等人，1989，《細(xì)菌學(xué)雜志》171:3583-3585)、或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke (布爾克)等人，2001，《美國國家科學(xué)院院刊》98:6289-6294)可以實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌細(xì)胞中。通過電穿孔(參見例如，Choi (崔)等人，2006，J.Microbiol.Methods (微生物學(xué)方法雜志)64:391-397)或軛合(參見例如，Pinedo (皮內(nèi)多)和 Smets (斯梅茨)，2005, Appl.Environ.Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué))71:51-57)可以實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌細(xì)胞中。通過天然感受態(tài)(參見例如，Perry (佩里)和 Kuramitsu (倉光)，1981, Infect.Tmmun.(《感染與免疫》)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt (卡特)和Jollick(朱力克)，1991, Microbios (《微生物》)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，Buckley (巴克利)等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)65:3800-3804)、或者軛合(參見，例如，Clewell (克拉維爾)，1981,Microbiol.Rev.(《微生物學(xué)評論》)45:409-436)可以實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌細(xì)胞中。然而，可以使用在本領(lǐng)域已知的任何方法將DNA引入到宿主細(xì)胞中。
[0191]該宿主細(xì)胞還可以是真核細(xì)胞，例如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細(xì)胞。
[0192]該宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞。如在此使用，“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、以及接合菌門(Zygomycota)、連同卵菌門(Oomycota)和全部有絲分裂孢子真菌(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人在安斯沃思和拜斯比真菌詞典(Ainsworth and Bisby’ s Dictionary of The Fungi),第 8版，1995,國際應(yīng)用生物科學(xué)中心(CAB International),大學(xué)出版社(University Press),英國劍橋(Cambridge, UK)中進(jìn)行定義的)。
[0193]該真菌宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞。如在此使用，“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔(dān)子酵母，以及屬于半知菌(芽生菌)的酵母。由于酵母的分類未來可能改變，故出于本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)當(dāng)如Biology and Activities of Yeast (《酵母生物學(xué)與活性》)(Skinner (斯金納),Passmore (帕斯莫)及Davenport (達(dá)文波特)編輯，Soc.App.Bacteriol.Symposium(《應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會》)，第9輯,1980)中所描述進(jìn)行定義。
[0194]酵母宿主細(xì)胞可以是假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或亞羅酵母屬細(xì)胞，例如乳酸克魯維酵母、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克魯費(fèi)酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酶母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母、或亞羅解脂酵母(Yarrowia Iipolytica)細(xì)胞。
[0195]真菌宿主細(xì)胞可以是絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括所有絲狀形式的細(xì)分真菌門和卵菌門(如由Hawksworth(霍克斯沃思)等人，1995,同上所定義)。絲狀真菌的特征一般在于由甲殼素、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他復(fù)合多糖組成的菌絲體壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長來進(jìn)行的并且碳分解代謝是專性需氧的。相比之下，酵母(例如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的出芽而進(jìn)行的，并且碳分解代謝可以是發(fā)酵的。
[0196]絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是支頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管菌屬、擬蠟菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬、鬼傘菌屬、革蓋菌屬、隱球酵母屬、Filibasidium、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、大毀殼屬、毛霉菌屬、蝕絲霉屬、新美鞭菌屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉菌屬、平革菌屬、白腐菌屬、梨囊鞭菌屬、側(cè)耳屬、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼菌屬、彎頸霉屬、栓菌屬、或木霉屬細(xì)胞。
[0197]例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、煙管菌、干擬臘菌、卡內(nèi)基擬臘菌(Ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬臘孔菌、潘諾希塔擬臘菌(Ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬臘菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬臘菌(Ceriporiopsissubrufa)、蟲擬臘菌、狹邊金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、拉克悼金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、幾狀金抱子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰蓋鬼傘、毛云芝菌、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、射紋革菌、杏鮑菇、太瑞斯梭孢殼霉、長絨毛栓菌、韓國白腐菌、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。
[0198]可以通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及以本身已知的一種方式進(jìn)行細(xì)胞壁再生的一個(gè)過程來轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化曲霉和木霉宿主細(xì)胞的合適程序描述于EP238023，Yelton(約爾頓)等人，1984，《美國國家科學(xué)院院刊》81:1470-1474，以及Christensen (克里斯滕森)等人，1988,Bio/Technology (《生物 / 技術(shù)》)6:1419-1422 中。Malardier (馬拉迪耶)等人，1989，Gene (《基因》)78:147-156和W096/00787描述了用于轉(zhuǎn)化鐮刀菌物種的合適方法?？梢允褂肂ecker (貝克爾)和Guarente (瓜倫特)在Abelson, J.N.(阿貝爾森)和 Simon, M.1.(西蒙)編輯，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology (對酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的指導(dǎo))，Methods in Enzymology (《酶學(xué)方法》)，第194卷，ppl82-187, Academic Press, Inc.(學(xué)院出版社有限公司)，紐約；Ito (伊藤)等人，1983，J.Bacteriol.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)153:163 ;以及Hinnen (希南)等人，1978，《美國國家科學(xué)院院刊》75:1920中描述的程序來轉(zhuǎn)化酵母。
[0199]產(chǎn)生方法
[0200] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；并且可任選地(b)回收該多肽。在一個(gè)方面中，該細(xì)胞是一個(gè)青霉屬細(xì)胞。在一個(gè)方面中，該細(xì)胞是一個(gè)膠囊青霉細(xì)胞。在另一個(gè)方面中，該細(xì)胞是一個(gè)膠囊青霉IBT4903細(xì)胞。
[0201]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)一種本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞；并且可任選地(b)回收該多肽。
[0202]這些細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的一種營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，或者在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中于適合的培養(yǎng)基中并且在允許該多肽表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行的小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)這些細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生的，該培養(yǎng)基包括碳源和氮源及無機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基從商業(yè)供應(yīng)商處可獲得，或者可以根據(jù)公開的組成(例如，在美國模式培養(yǎng)物保藏所目錄中)來制備。如果多肽分泌到該營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收。
[0203]可以使用特異性針對該多肽的本領(lǐng)域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定來確定該多肽的活性。
[0204]可以使用本領(lǐng)域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規(guī)程序，包括但不限于，收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一個(gè)方面中，回收包括本發(fā)明的多肽的全發(fā)酵液。
[0205]可以通過本領(lǐng)域中已知的多種程序來純化該多肽，以獲得大致上純的多肽，這些程序包括，但不限于色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺寸排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點(diǎn)聚焦)、溶解度差異(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE、或萃取(參見，例如Protein Purification(《蛋白純化》),Janson(詹森)和 Ryden (賴登)編輯，VCH 出版社(VCH Publishers)，紐約，1989)。
[0206]在一個(gè)替代性方面中，該多肽未被回收，而是使用表達(dá)該多肽的本發(fā)明的宿主細(xì)胞作為該多肽來源。
[0207]植物
[0208]本發(fā)明還涉及分離的植物，例如轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，該分離的植物、植物部分或植物細(xì)胞包含本發(fā)明的多核苷酸，以用來按可回收的量表達(dá)并且產(chǎn)生多肽或結(jié)構(gòu)域。多肽或結(jié)構(gòu)域可從植物或植物部分回收。可替代地，可以像這樣使用含有多肽或結(jié)構(gòu)域的植物或植物部分，以改善食品或飼料的質(zhì)量，例如改善營養(yǎng)價(jià)值，適口性和流變性質(zhì)，或破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。
[0209]轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草，例如草甸草(藍(lán)草，早熟禾屬)；飼草例如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium);溫帶草例如剪股穎屬(Agrostis)和谷物例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
[0210]雙子葉植物的實(shí)例是煙草，豆類，例如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花的植物(十字花科)、例如花椰菜、油菜籽，以及緊密相關(guān)的模式生物擬南芥。
[0211]植物部分的實(shí)例是莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子、以及塊莖連同包含這些部分的單個(gè)組織，例如表皮、葉肉、薄壁組織、維管組織、分生組織。特定的植物細(xì)胞區(qū)室，例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。此外,任何植物細(xì)胞，無論是何種組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣，植物部分，例如分離以促進(jìn)本發(fā)明的利用的特定組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和種皮。
[0212]還包括在本 發(fā)明的范圍內(nèi)的是這類植物、植物部分、和植物細(xì)胞的后代。
[0213]可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達(dá)該多肽或結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。簡而言之，通過將編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體結(jié)合到植物宿主基因組或葉綠體基因組中并且將所得改性植物或植物細(xì)胞繁殖成轉(zhuǎn)基因的植物或植物細(xì)胞來構(gòu)建該植物或植物細(xì)胞。
[0214]該表達(dá)構(gòu)建體便利地為一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含了對與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)多核苷酸所需的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連接的一種多肽或結(jié)構(gòu)域進(jìn)行編碼的多核苷酸。此外，該表達(dá)構(gòu)建體可以包括一種適用于對已經(jīng)整合入該表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞進(jìn)行鑒別的選擇性標(biāo)記，及將該構(gòu)建體引入所討論的植物中必需的DNA序列(后者取決于待使用的DNA引入方法)。
[0215]調(diào)控序列(如啟動子和終止子序列及可任選的信號或轉(zhuǎn)運(yùn)序列)的選擇例如基于何時(shí)、在何處并且如何表達(dá)所希望的多肽或結(jié)構(gòu)域來決定。例如，編碼多肽的基因的表達(dá)可以是組成性的或可誘導(dǎo)的，或可以為發(fā)育、階段或組織特異性的，并且可以使基因產(chǎn)物革巴向特定組織或植物部分，例如種子或葉。例如，由Tague (塔格)等人，1988, PlantPhysiology (《植物生理學(xué)》)86:506描述的調(diào)控序列。
[0216]對于組成性表達(dá),可以使用35S_CaMV、玉蜀黍泛素1、或水稻肌動蛋白I啟動子(Franck (弗蘭克)等人，1980, Cell (《細(xì)胞》)21:285-294 ;Christensen (克里斯滕森)等A, 1992,Plant Mol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》)18:675-689 ;Zhang (張)等人，1991，PlantCell (《植物細(xì)胞》)3:1155-1165)。器官特異性啟動子可以是以下各項(xiàng)的啟動子，例如來自忙藏庫組織(例如種子、馬鈴薯塊莖、和果實(shí))(Edwards (愛德華茲)和Coruzzi (科魯茲),1990, Ann.Rev.Genet.(《遺傳學(xué)年鑒》)24:275-303)，或來自代謝庫組織(例如分生組織)(Ito (伊藤)等人，1994，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》)24:863-878)，種子特異性啟動子，例如來自水稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白啟動子(Wu(吳)等人，1998，Plant Cell Physiol.(《植物與細(xì)胞生理學(xué)》)39:885-889)，來自豆球蛋白B4的蠶豆啟動子和來自蠶豆的未知種子蛋白基因(Conrad(康拉德)等人，1998, J.Plant Physiol.(《植物生理學(xué)雜志》)152:708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen (陳)等人，1998，PlantCell Physiol.(《植物與細(xì)胞生理學(xué)》)39:935-941)，來自歐洲油菜的貯藏蛋白napA啟動子，或本領(lǐng)域已知的任何其他種子特異性啟動子，例如，如在W091/14772中所述的。此外，啟動子可以是葉特異性啟動子，例如來自水稻或番爺?shù)膔bcs啟動子(Kyozuka(京冢)等人，1993，Plant Physiol.(《植物生理學(xué)》))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra (密特拉)和Higgins (希金斯)，1994，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》)26:85-93)，來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya(加賀)等人，1995，Mol.Gen.Genet.(《分子和普通遺傳學(xué)》)248:668-674)，或傷口可誘導(dǎo)的啟動子，例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu (徐)等人，1993，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》)22:573-588)。同樣，啟動子可通過非生物處理，例如溫度、干旱、或鹽度變化來誘導(dǎo)，或通過外源施加激活啟動子的物質(zhì)，例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脫落酸、和赤霉酸、以及重金屬來誘導(dǎo)。
[0217]還可使用啟動子增強(qiáng)子元件，從而在植物中達(dá)到多肽或結(jié)構(gòu)域的更高表達(dá)。例如，啟動于增強(qiáng)子元件可以是位于啟動子和編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如Xu(徐)等人，1993，同上，披露了使用水稻肌動蛋白I基因的第一內(nèi)含子來增強(qiáng)表達(dá)。
[0218]該選擇性標(biāo)記基因及該表達(dá)構(gòu)建體的任何其他部分可以選自本領(lǐng)域中可用的那些。
[0219]可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)技術(shù)將核酸構(gòu)建體結(jié)合到植物基因組中，這些常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微注射、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化、以及電穿孔(Gasser (加塞爾)等人，1990, Science (《科學(xué)》)244:1293 ；Potrykus (波特里庫斯)，1990, Bio/Technology (《生物 / 技術(shù)》)8:535 ;Shimamoto (島本)等人，1989, Nature (《自然》)338:274)。
[0220]根癌土壤桿菌 介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物(有關(guān)評述，參看霍伊卡(Hooykas)和斯查珀特(Schilperoort)，1992，《植物分子生物學(xué)》19:15-38)和用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法，盡管其他轉(zhuǎn)化方法也可以用于這些植物。一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是胚性愈傷組織或發(fā)育的胚的粒子轟擊(用轉(zhuǎn)化DNA包衣的微觀金或鎢顆粒)(Christou (克里斯托)，1992，Plant J.(《植物雜志》)2:275-281 ;Shimamoto (島本)，1994, Curr.0pin.Biotechnol.(《生物技術(shù)新見》)5:158-162 ;Vasil (瓦西爾)等人，1992, Bio/Technology (《生物 / 技術(shù)》)10:667-674)。如 Omirulleh (奧米如列)等人，1993,Plant Molecular Biology (《植物分子生物學(xué)》)21:415-428中所述,單子葉植物轉(zhuǎn)化的替代方法基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。另外的轉(zhuǎn)化方法包括美國專利號6，395，966和7，151，204(兩者都通過引用以其全文結(jié)合于此)中所描述的那些。
[0221]在轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法對并入了該表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行選擇并且使其再生成為完整植物。通常轉(zhuǎn)化程序被設(shè)計(jì)成通過使用例如用兩種分開的T-DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶進(jìn)行的選擇基因的位點(diǎn)特異性切除，在再生期間或在后代中選擇性清除選擇基因。
[0222]除了用本發(fā)明的構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化具體的植物基因型之外，可以通過將具有構(gòu)建體的植物與缺乏構(gòu)建體的第二植物雜交來制成轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以通過雜交將編碼多肽或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體引入特定植物品種中，無需總是直接地轉(zhuǎn)化該給定品種的植物。因此，本發(fā)明不僅涵蓋了從根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接再生的植物，而且還涵蓋了這類植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根據(jù)本發(fā)明制備的親本植物的任何代的后代。此類后代可以包含根據(jù)本發(fā)明制備的DNA構(gòu)建體。雜交導(dǎo)致通過供體植物系與起始系交叉授粉，將轉(zhuǎn)基因引入植物系。此類步驟的非限制性實(shí)例描述于美國專利號7，151，204中。
[0223]可以通過回交轉(zhuǎn)換過程產(chǎn)生植物。例如，植物包括被稱為回交轉(zhuǎn)換的基因型、系、近交、或雜交的植物。
[0224]遺傳標(biāo)記可以用于協(xié)助將本發(fā)明的一種或多種轉(zhuǎn)基因從一種遺傳背景滲入到另一種遺傳背景中。相對于常規(guī)育種，標(biāo)記輔助選擇提供了很多優(yōu)點(diǎn)，它可以用于避免由表型變異引起的錯(cuò)誤。此外，遺傳標(biāo)記可以提供在一次特定雜交的個(gè)體子代中優(yōu)異種質(zhì)的相對程度的數(shù)據(jù)。例如，當(dāng)具有希望的性狀(否則會具有非農(nóng)藝學(xué)上希望的遺傳背景)的植物與精英親本雜交時(shí)，遺傳標(biāo)記可以用于選擇不僅擁有感興趣的性狀、而且還具有較大比例的希望的種質(zhì)的后代。以此方式，將一個(gè)或多個(gè)性狀滲入特定的遺傳背景所需的世代數(shù)被最小化。
[0225]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或結(jié)構(gòu)域的方法，這些方法包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽或結(jié)構(gòu)域的條件下培養(yǎng)一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼該多肽或結(jié)構(gòu)域的多核苷酸；并且可任選地(b)回收該多肽或結(jié)構(gòu)域。
[0226]木聚糖酶活性的消除或降低
[0227]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，該方法包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其部分，這導(dǎo)致突變體細(xì)胞比在相同條件下培養(yǎng)的親本細(xì)胞產(chǎn)生的多肽少。 [0228]可以使用本領(lǐng)域熟知的方法通過降低或消除該多核苷酸的表達(dá)來構(gòu)建突變體細(xì)胞，例如插入、破壞、替換、或缺失。在一個(gè)優(yōu)選方面中，將該多核苷酸失活。例如，待修飾或失活的多核苷酸可以是活性必需的編碼區(qū)或其部分，或編碼區(qū)的表達(dá)所需的調(diào)控元件。這種調(diào)控或控制序列的實(shí)例可以是啟動子序列或其功能部分，即足以影響該多核苷酸的表達(dá)的部分。可修飾的其他控制序列包括但不局限于前導(dǎo)子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活因子。
[0229]該多核苷酸的修飾或失活可以通過使親本細(xì)胞經(jīng)受誘變，并且選擇該多核苷酸的表達(dá)被降低或消除的突變體細(xì)胞來進(jìn)行。所述誘變可以是特異的或隨機(jī)的，例如通過使用適宜的物理或化學(xué)誘變劑、通過使用適宜的寡核苷酸、或通過對DNA序列PCR產(chǎn)生誘變來進(jìn)行。此外，誘變可通過使用這些誘變劑的任意組合來進(jìn)行。
[0230]適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，鄰甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。
[0231]當(dāng)使用這些試劑時(shí)，誘變一般是在適宜條件下在所選的誘變處理試劑的存在下通過保溫用于誘變的親本細(xì)胞并稀選和/或選擇展示基因表達(dá)降低或不表達(dá)的突變體細(xì)胞來進(jìn)行的。
[0232]該多核苷酸的修飾或失活可以通過在基因中或在其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中插入、取代、或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸來完成。例如，可插入或消除核苷酸從而形成終止密碼子的引入、起始密碼子的消除、或開放讀碼框的改變。這些修飾或失活可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來完成。盡管大體上，修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)待修飾的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但是優(yōu)選的是如下所示例地在體外進(jìn)行修飾。[0233]便利的消除或降低多核苷酸的表達(dá)的方法的實(shí)例是基于基因替換、基因缺失、或基因破壞技術(shù)的。例如，在基因破壞方法中，將對應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，該缺陷的核酸序列替換內(nèi)源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸還編碼可用于選擇其中該多核苷酸已經(jīng)被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。在一個(gè)方面中，用例如在此描述的那些選擇性標(biāo)記來破壞該多核苷酸。
[0234]本發(fā)明還涉及抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，這些方法包括向該細(xì)胞給予或在其中表達(dá)一種雙鏈RNA (dsRNA)分子，其中該dsRNA包括本發(fā)明的多核苷酸的一個(gè)子序列。在一個(gè)優(yōu)選方面中，該dsRNA長約15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)雙核苷酸。
[0235]該dsRNA優(yōu)選是一個(gè)小干擾RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)。在一個(gè)優(yōu)選方面中，該dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該dsRNA是用于抑制翻譯的微小RNA。
[0236]本發(fā)明還涉及此類雙鏈RNA (dsRNA)分子，包括用于抑制該多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列的部分。雖然本發(fā)明不局限于任何具體的作用機(jī)制，但是該dsRNA可以進(jìn)入一個(gè)細(xì)胞并且導(dǎo)致相似的或相同的序列的單鏈RNA (ssRNA)(包括內(nèi)源mRNA)的降解。當(dāng)細(xì)胞被暴露于dsRNA時(shí)，來自同源基因的mRNA選擇性地被一種叫做RNA干擾(RNAi)的過程所降解。
[0237]本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的dsRNAi來選擇性地降解RNA的方法?？梢栽隗w外、離體或體內(nèi)進(jìn)行該過程。在一個(gè)方面中，可以使用這些dsRNA分 子來在細(xì)胞、器官或動物中產(chǎn)生功能缺失突變。用于制備并使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領(lǐng)域中是熟知的；參見例如美國專利號6，489，127 ；6，506，559 ;6，511，824 ；以及 6，515，109。
[0238]本發(fā)明進(jìn)一步涉及在編碼該多肽的多核苷酸或其控制序列或編碼該多肽的沉默基因中包含破壞或缺失的親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比，該突變體細(xì)胞產(chǎn)生的多肽少或不產(chǎn)生多肽。
[0239]這些多肽缺陷的突變體細(xì)胞作為用于天然和異源多肽的表達(dá)的宿主細(xì)胞尤其有用。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生天然或異源多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)該突變體細(xì)胞；并且(b)回收該多肽。術(shù)語“異源多肽”是指對該宿主細(xì)胞來說不是天然的多肽，例如天然蛋白質(zhì)的變體。該宿主細(xì)胞可以包括多于一個(gè)拷貝的編碼該天然或異源多肽的多核苷酸。
[0240]可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)和目的產(chǎn)物的純化。
[0241]本發(fā)明用于生產(chǎn)基本上不含木聚糖酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽的生產(chǎn)中特別有利，尤其是真菌蛋白質(zhì)，例如酶。木聚糖酶缺陷的細(xì)胞還可用于表達(dá)藥學(xué)感興趣的異源蛋白，例如激素、生長因子、受體等。術(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，還包括經(jīng)過氨基酸替代、缺失或添加的修飾或用以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等的其他此類修飾的多肽，例如酶。
[0242]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的基本上不含木聚糖酶活性的蛋白產(chǎn)物。[0243]發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物
[0244]本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多肽的發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物。該發(fā)酵液產(chǎn)物進(jìn)一步包括用于發(fā)酵過程的另外的成分，例如像細(xì)胞(包括，含有用來產(chǎn)生感興趣的多肽的編碼本發(fā)明的多肽的基因的宿主細(xì)胞)、細(xì)胞碎片、生物質(zhì)、發(fā)酵介質(zhì)和/或發(fā)酵產(chǎn)物。在一些實(shí)施例中，該組合物是包含一種或多種有機(jī)酸、殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片、以及培養(yǎng)基的細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液。
[0245]如在此使用，術(shù)語“發(fā)酵液”是指一種由不經(jīng)歷或最少經(jīng)歷回收和/或純化的細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生的制劑。例如，當(dāng)微生物培養(yǎng)株在允許蛋白質(zhì)合成(例如，由宿主細(xì)胞的酶表達(dá))并且將蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的碳受限的條件下孵育生長到飽和時(shí)，產(chǎn)生發(fā)酵液。發(fā)酵液可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級的或分級的內(nèi)容物。典型地，發(fā)酵液是未分級的并且包括在例如通過離心除去微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)后存在的耗盡的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，發(fā)酵液包含耗盡的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶、以及有活力的和/或無活力的微生物細(xì)胞。
[0246]在一個(gè)實(shí)施例中，該發(fā)酵液配制品和細(xì)胞組合物包括一種第一有機(jī)酸組分(包括至少一種1-5碳的有機(jī)酸和/或其鹽)以及一種第二有機(jī)酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機(jī)酸和/或其鹽)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該第一有機(jī)酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽、或兩種或更多種前述酸的混合物并且該第二有機(jī)酸組分是苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽、或兩種或更多種前述酸的混合物。
[0247]在一個(gè) 方面中，該組合物包含一種或多種有機(jī)酸并且可任選地進(jìn)一步包含殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片。在一個(gè)實(shí)施例中，將殺死的細(xì)胞和/或細(xì)胞碎片從細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液中除去以提供一種沒有這些組分的組合物。
[0248]該發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物可以進(jìn)一步包括一種防腐劑和/或抗微生物劑(例如，抑菌劑)，包括但不限于，山梨糖醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領(lǐng)域已知的其他防腐劑和/或抗微生物劑。
[0249]該發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物可以進(jìn)一步包括多種酶活性，例如選自下組的一種或多種(如，若干種)酶，該組由以下各項(xiàng)組成:纖維素酶、半纖維素酶、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽、酯酶、擴(kuò)張蛋白、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素(swollenin)。該發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物還可以包括一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，例如α-半乳糖苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β -木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0250]細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液或組合物可以包含在發(fā)酵結(jié)束時(shí)得到的發(fā)酵材料的未分級的內(nèi)容物。典型地，細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液或組合物包含在允許蛋白質(zhì)合成(例如，纖維素酶和/或一種或多種葡糖苷酶的表達(dá))的碳受限的條件下孵育微生物細(xì)胞(例如，絲狀真菌細(xì)胞)生長到飽和后存在的耗盡的培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液或組合物包含耗盡的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶、以及被殺死的絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，存在于細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液或組合物中的微生物細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行透化和/或裂解。
[0251]如在此描述的全發(fā)酵液或細(xì)胞組合物典型地是一種液體，但是可以包含不溶性組分，例如被殺死的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基組分、和/或一種或多種不溶性酶。在一些實(shí)施例中，可以除去不溶性組分，以提供一種澄清的液體組合物。
[0252]可以通過描述于W090/15861或W02010/096673中的方法生產(chǎn)本發(fā)明的全發(fā)酵液配制品和細(xì)胞組合物。
[0253]下面給出了本發(fā)明的組合物的優(yōu)選用途的實(shí)例。該組合物的劑量以及使用該組合物的其他條件可以基于本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行確定。
[0254]酶組合物
[0255]本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，這些組合物富含這樣的一種多肽。術(shù)語“富含”指示該組合物的木聚糖酶活性已經(jīng)增加，例如，富集因子為至少1.1。
[0256]這些組合物可以包括本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如單組分組合物。可替代地，這些組合物可以包括多種酶活性，例如選自下組的一種或多種(如，若干種)酶，該組由以下各項(xiàng)組成:纖維素酶、半纖維素酶、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽、酯酶、擴(kuò)張蛋白、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素。這些組合物還可以包括一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，例如α-半乳糖苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、β -木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。這些組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備并且可以是液體或干燥組合物的形式?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的方法穩(wěn)定這些組合物。
[0257]下面給出了本發(fā)明的組合物的優(yōu)選用途的實(shí)例。該組合物的劑量以及使用該組合物的其他條件可以基于本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行確定。
[0258]用途
[0259]本發(fā)明還針對用于使用具有木聚糖酶活性的多肽或其組合物的以下工藝。
[0260]本發(fā)明還涉及用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或包含木聚糖的材料的方法，這些方法包括:在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料或包含木聚糖的材料。在一個(gè)方面中，這些方法進(jìn)一步包括回收降解的或轉(zhuǎn)化的纖維素材料或包含木聚糖的材料?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法將纖維素材料或包含木聚糖的材料的降解或轉(zhuǎn)化的可溶性產(chǎn)物與不溶性纖維素材料或包含木聚糖的材料分開，這些方法是例如像離心、過濾、或重力沉降。
[0261]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，這些方法包括:(a)在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物糖化纖維素材料或包含木聚糖的材料；(b)用一種或多種(例如，若干種)發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料或包含木聚糖的材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且(C)從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0262]本發(fā)明還涉及發(fā)酵一種纖維素材料或包含木聚糖的材料的方法，這些方法包括:用一種或多種(例如，若干種)發(fā)酵微生物發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料，其中該纖維素材料或包含木聚糖的材料在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一種酶組合物糖化。在一個(gè)方面中，發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料生產(chǎn)一種發(fā)酵產(chǎn)物。在另一個(gè)方面中，這些方法進(jìn)一步包括從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0263]可以使用本發(fā)明的工藝將纖維素材料或包含木聚糖的材料糖化為可發(fā)酵糖并且將這些可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為許多有用的發(fā)酵產(chǎn)物，例如燃料、可飲用的乙醇、和/或平臺化學(xué)制劑(例如，酸、醇、酮、氣體等)。由纖維素材料或包含木聚糖的材料生產(chǎn)所希望的發(fā)酵產(chǎn)物典型地涉及預(yù)處理、酶水解(糖化)、以及發(fā)酵。
[0264]可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法完成對根據(jù)本發(fā)明的纖維素材料或包含木聚糖的材料的處理。此外，可以使用被配置為根據(jù)本 發(fā)明進(jìn)行操作的任何常規(guī)的生物質(zhì)處理裝置進(jìn)行本發(fā)明的工藝。
[0265]分開的或同時(shí)的水解(糖化)和發(fā)酵包括但不限于:分開的水解和發(fā)酵(SHF)；同時(shí)的糖化和發(fā)酵(SSF);同時(shí)的糖化和共發(fā)酵(SSCF);混合的水解和發(fā)酵(HHF);分開的水解和共發(fā)酵(SHCF);混合的水解和共發(fā)酵(HHCF);以及直接的微生物轉(zhuǎn)變(DMC)，有時(shí)也被叫做整合生物加工(CBP)。SHF使用分開的處理步驟，以首先將纖維素材料酶促水解為可發(fā)酵糖(例如，葡萄糖、纖維二糖、以及戊糖單體)，并且然后將可發(fā)酵糖發(fā)酵為乙醇。在SSF中，將纖維素材料的酶水解和糖向乙醇的發(fā)酵合并在一個(gè)步驟中(Philippidis (菲利皮迪斯)，G.P.，1996, Cellulose bioconversion technology (纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù))，在 Handbook on Bioethanol: Production and Utilization (《生物乙醇:生產(chǎn)與利用手冊》)中，Wyman (懷曼)，C.E.,編輯，Taylor (泰勒)&Francis (弗朗西斯)，華盛頓特區(qū)，179-212)。SSCF涉及多種糖的共發(fā)酵(Sheehan(希恩)，J.，和Himmel (希默爾),M., 1999, Enzymes, energy and the environment:A strategic perspectiveon the U.S.Department of Energy’ s research and development activities forbioethanol (酶，能源與環(huán)境:美國能源部的生物乙醇的研究和開發(fā)活動的戰(zhàn)略視角)，Biotechnol.Prog.(《生物技術(shù)進(jìn)展》)15:817-827)。HHF涉及分開的水解步驟并且另外涉及可以在同一反應(yīng)器中進(jìn)行的同時(shí)的糖化和水解步驟。在HHF工藝中的步驟可以在不同溫度下進(jìn)行，即高溫酶促糖化，隨后是在發(fā)酵菌株可以忍受的較低溫度下的SSF。DMC在一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))步驟中合并了所有的三個(gè)工藝(酶生產(chǎn)、水解、和發(fā)酵)，其中使用相同的生物生產(chǎn)用于將纖維素材料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的酶并且用于將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物的酶(Lynd(林德)等人,2002, Microbial cellulose utilization !Fundamentalsand biotechnology (微生物纖維素利用:基本原理和生物技術(shù)),Microbiol.Mol.Biol.Reviews (《微生物學(xué)與分子生物學(xué)評論》)66:506-577)。在此應(yīng)該理解的是，可以在本發(fā)明的工藝的實(shí)踐中使用本領(lǐng)域已知的包括預(yù)處理、酶水解(糖化)、發(fā)酵或其組合的任何方法。
[0266]常規(guī)的裝置可以包括一個(gè)補(bǔ)料分批攪拌反應(yīng)器、一個(gè)批式攪拌反應(yīng)器、一個(gè)具有超濾作用的連續(xù)流攪拌反應(yīng)器、和/或一個(gè)連續(xù)活塞流柱式反應(yīng)器(continuous plug-flowcolumn reactor) (Fernanda de Castilhos Corazza(費(fèi)爾南達(dá)德卡斯特胡斯克拉茲)，F(xiàn)lavio Faria de Moraes (弗拉維奧法利亞德莫賴斯)，Gisella Maria Zanin (格塞爾拉瑪I? 亞扎寧)和 Ivo Neitzel (伊沃奈特賽爾)，2003, Optimal control in fed-batchreactor for the cellobiose hydrolysis (用于纖維二塘水解的補(bǔ)料分批反應(yīng)器的優(yōu)化控制)，Acta Scientiarum.Technology (《技術(shù)學(xué)報(bào)》)25:33-38 ;Gusakov (古薩考瓦)，A.V.，，和 Sinitsyn(斯尼特森)，A.P., 1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis ofcellulose: 1.A mathematical model for a batch reactor process (纖維素的酶水角軍動力學(xué):1.用于批式反應(yīng)器過程的數(shù)學(xué)模型)，Enz.MiciOb.Technol.(《酶學(xué)與微生物學(xué)技術(shù)》)7:346-352)、一個(gè)碾磨反應(yīng)器(Ryu (劉)和 Lee (李)，1983, Bioconversion of wastecellulose by using an attrition bioreactor(通過使用碾磨生物反應(yīng)器的廢料纖維素的生物轉(zhuǎn)化)，Biotechnol.Bioeng.(《生物技術(shù)與生物工程》)25:53-65)、或一個(gè)具有由電磁場誘導(dǎo)的強(qiáng)烈攪拌作用的反應(yīng)器(Gusakov(古薩考瓦)等人，1996, Enhancement ofenzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensivestirring induced by electromagnetic field(使用具有由電磁場誘導(dǎo)的強(qiáng)烈攪拌作用的新型生物反應(yīng)器增強(qiáng)酶纖維素水解)，Appl.Biochem.Biotechnol.(《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》)56:141-153)。另外的反應(yīng)器類型包括流化床，升流包覆層(blanket)，固定化、以及用于水解和/或發(fā)酵的擠出機(jī)類型的反應(yīng)器。
[0267]預(yù)處理。在實(shí)踐本發(fā)明的工藝中，可以使用本領(lǐng)域中已知的仟何預(yù)處理工藝來破壞纖維素材料或包含木聚糖的材料的植物細(xì)胞壁組分(Chandra(錢德拉)等人，2007，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.(《生化工程 / 生物技術(shù)進(jìn)展》)108:67-93 ;Galbe (蓋爾貝)和 Zacchi (賽琪)，2007, Pretreatment of lignocellulosic materials forefficient bioethanol production(用于有效的生物乙醇生產(chǎn)的木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理)，《生化工程/生物技術(shù)進(jìn)展》108:41-65 ；Hendriks (亨德里克斯)和Zeeman (塞曼)，2009,Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass(予頁處理以增強(qiáng)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的可消化性)，Bioresource Technol.(《生物資源技術(shù)》)100:10-18 ;Mosier (馬塞爾)等人，2005, Features of promising technologies forpretreatment of ligno cellulosic biomass (用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預(yù)處理的有前景的技術(shù)的特征)，《生物資源技術(shù)》96:673-686 ；Taherzadeh (泰和拉德)和Karimi (卡里米)，2008,Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogasproduction:A review(木質(zhì)纖維廢棄物的預(yù)處理以提高乙醇和沼氣產(chǎn)量:評論),Int.J.0fMol.Sc1.(《分子科學(xué)國際雜志》)9:1621-1651 ;Yang(楊)和懷曼，2008,Pretreatment: thekey to unlocking low-cost cellulosic ethanol (預(yù)處理:開放低成本纖維素乙醇的鑰匙)，Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.(《生物燃料，生物產(chǎn)品和生物精制 Biofpr.》)2:26-40)。
[0268]在使用本領(lǐng)域中已知的方法預(yù)處理之前，纖維素材料或包含木聚糖的材料還可以經(jīng)受粒度縮減、篩分、預(yù)浸泡、濕潤、洗滌、和/或調(diào)節(jié)。
[0269]常規(guī)的預(yù)處理包括，但不限于:蒸汽預(yù)處理(伴隨或不伴隨爆炸)、稀酸預(yù)處理、熱水預(yù)處理、堿預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕法氧化、濕法爆炸(wet explosion)、氨纖維爆炸、有機(jī)溶劑預(yù)處理、以及生物預(yù)處理。另外的預(yù)處理包括氨滲濾、超聲波、電穿孔、微波、超臨界CO2、超臨界!120、臭氧、離子液體、以及Y輻射預(yù)處理。
[0270]可以在水解和/或發(fā)酵之前對纖維素材料或包含木聚糖的材料進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理優(yōu)選地是在水解之前進(jìn)行。可替代地，預(yù)處理可以與酶水解同時(shí)進(jìn)行，以釋放可發(fā)酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纖維二糖。在大部分情況下，預(yù)處理步驟本身造成一些生物質(zhì)向可發(fā)酵糖的轉(zhuǎn)化(甚至在沒有酶的情況下)。
[0271]蒸汽預(yù)處理。在蒸汽預(yù)處理中，將纖維素材料或包含木聚糖的材料加熱以破壞植物細(xì)胞壁組分(包括木質(zhì)素、半纖維素、以及纖維素)，以使得纖維素以及其他部分(例如半纖維素)可接觸到酶。使纖維素材料或包含木聚糖的材料到達(dá)或通過一個(gè)反應(yīng)鍋，在該反應(yīng)鍋中注入蒸汽以將溫度增加至所需的溫度和壓力并且將纖維素材料或包含木聚糖的材料保留在其中，持續(xù)所希望的反應(yīng)時(shí)間。蒸汽預(yù)處理優(yōu)選在140°C-250°C (例如，160°C -200°C或170°C _190°C )下進(jìn)行，其中最適溫度范圍取決于添加的化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理的停留時(shí)間優(yōu)選是1-60分鐘，例如1-30分鐘、1-20分鐘、3-12分鐘、或4_10分鐘，其中最適停留時(shí)間取決于溫度范圍和添加的化學(xué)催化劑。蒸汽預(yù)處理允許相對高的固體負(fù)載，這樣使得在預(yù)處理過程中纖維素材料或包含木聚糖的材料通常僅僅是潮濕的。蒸汽預(yù)處理經(jīng)常與預(yù)處理后的材料的爆炸放料(explosive discharge)合并,這被稱為蒸汽爆炸，即，快速閃變至大氣壓和材料的湍流，以通過破碎增加可接觸的表面積(Duff (迪福)和Murray (默里)，1996，《生物資源技術(shù)》855:1-33 ;蓋爾貝和賽琪，2002, Appl.Microbiol.Biotechnol.(《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》)59:618-628 ;美國專利申請?zhí)?0020164730)。在蒸汽預(yù)處理過程中，半纖維素乙?；鶊F(tuán)被裂解，并且所得酸自催化半纖維素部分水解為單糖和低聚糖。僅在有限的程度上除去木質(zhì)素。
[0272]化學(xué)預(yù)處理:術(shù)語“化學(xué)處理”是指促進(jìn)纖維素、半纖維素和/或木質(zhì)素分離和/或釋放的任何化學(xué)預(yù)處理。這樣的一種預(yù)處理可以將結(jié)晶纖維素轉(zhuǎn)化為無定形纖維素。適合的化學(xué)預(yù)處理工藝的實(shí)例包括例如稀酸預(yù)處理、石灰預(yù)處理、濕法氧化、氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)、氨滲濾(APR)、離子液體、以及有機(jī)溶劑預(yù)處理。
[0273]經(jīng)常在蒸汽預(yù)處 理之前添加一種催化劑(例如H2SO4或SO2)(典型地是0.3至5% w/w)，該催化劑減少時(shí)間并降低溫度、增加回收率、并改進(jìn)酶水解(Ballesteros(巴列斯特羅斯)等人，2006，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》129-132:496-508 ；Varga (瓦爾加)等人，2004，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》113-116:509-523 ;Sassner (塞斯尼爾)等人，2006，Enzyme Microb.Technol.(《酶與微生物技術(shù)》)39:756-762)。在稀酸預(yù)處理中，將該纖維素材料或包含木聚糖的材料與稀酸(典型地是H2SO4)和水混合以形成漿料，由蒸汽加熱至所希望的溫度，并且在一段停留時(shí)間后閃變至大氣壓。可以用很多反應(yīng)器設(shè)計(jì)進(jìn)行稀酸預(yù)處理，例如，活塞流式反應(yīng)器、逆流式反應(yīng)器、或連續(xù)逆流式收縮床反應(yīng)器(迪福和默里，1996，同上；Schell (謝爾)等人，2004，《生物資源技術(shù)》91:179-188 ；Lee (李)等人，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.(《生化工程與生物技術(shù)進(jìn)展》)65:93-115)。
[0274]還可以使用堿性條件下的若干預(yù)處理方法。這些堿預(yù)處理包括，但不限于:氫氧化鈉、石灰、濕法氧化、氨滲濾(APR)、以及氨纖維/冷凍爆炸(AFEX)。
[0275]用氧化鈣或氫氧化鈣在85°C _150°C的溫度下進(jìn)行石灰預(yù)處理，并且停留時(shí)間從I小時(shí)到若干天(懷曼等人，2005，《生物資源技術(shù)》96:1959-1966 ;馬塞爾等人，2005，《生物資源技術(shù)》96:673-686)。W02006/110891、W02006/110899、W02006/110900、以及W02006/110901披露了使用氨的預(yù)處理方法。
[0276]濕法氧化是一種熱預(yù)處理，典型地在180°C _220°C進(jìn)行5_15分鐘，同時(shí)添加氧化劑(例如過氧化氫或過壓氧)(Schmidt (施密特)和Thomsen (湯姆森)，1998,《生物資源技術(shù)》64:139-151 ；Palonen(帕隆恩)等人，2004，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》117:1-17 ；瓦爾加等人，2004，《生物技術(shù)與生物工程》88:567-574 ;Martin (馬丁 )等人，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.(《化學(xué)技術(shù)與生物技術(shù)雜志》)81:1669-1677)。預(yù)處理優(yōu)選地在1% -40%干物質(zhì)，例如2% -30%干物質(zhì)或5% -20%干物質(zhì)下進(jìn)行，并且經(jīng)常通過添加堿(例如碳酸鈉)來增加初始pH。
[0277]濕法氧化預(yù)處理方法的修改，被稱為濕法爆炸(濕法氧化和蒸汽爆炸的組合)能夠處理高達(dá)30 %的干物質(zhì)。在濕法爆炸中，在預(yù)處理過程中，在一定的停留時(shí)間后引入氧化劑。然后通過閃變至大氣壓而結(jié)束預(yù)處理(W02006/032282)。
[0278]氨纖維爆炸(AFEX)涉及在溫和溫度(例如90 V -150 °C )和高壓(例如17-20bar)下，用液體或氣體氨處理該纖維素材料或包含木聚糖的材料5_10分鐘，其中干物質(zhì)含量可以高達(dá)60% (Gollapalli (高拉帕里)等人，2002，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》98:23-35 ；Chundawat (卡達(dá)瓦特)等人，2007，《生物技術(shù)與生物工程》96:219-231 ；Alizadeh(Alizadeh)等人，2005，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》121:1133-1141 ；Teymouri (泰木里)等人，2005，《生物資源技術(shù)》96:2014-2018)。在AFEX預(yù)處理過程中，纖維素和半纖維素保持相對完整。木素-碳水化合物復(fù)合物被裂解。
[0279]有機(jī)溶劑預(yù)處理通過用水性乙醇(40% -60%乙醇)在160°C _200°C萃取30-60分鐘而將該纖維素材料或包含木聚糖的材料去木質(zhì)素化(Pan (帕恩)等人，2005，《生物技術(shù)與生物工程》90:473-481 ;帕恩等人，2006，《生物技術(shù)與生物工程》94:851-861 ；Kurabi (卡拉比)等人，2005，《應(yīng) 用生物化學(xué)與生物技術(shù)》121:219-230)。通常添加硫酸作為催化劑。在有機(jī)溶劑預(yù)處理中，除去大部分半纖維素和木質(zhì)素。
[0280]適合的預(yù)處理方法的其他實(shí)例由謝爾等人，2003，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》A105-108:69-85，和馬塞爾等人，2005，《生物資源技術(shù)》96:673-686，以及美國專利申請2002/0164730 進(jìn)行描述。
[0281]在一個(gè)方面中，化學(xué)預(yù)處理優(yōu)選作為稀酸處理，并且更優(yōu)選作為連續(xù)稀酸處理進(jìn)行。酸典型地是硫酸，但是也可以使用其他酸，例如乙酸、檸檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。弱酸處理優(yōu)選在1-5 (例如，，1-4或1-2.5)的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面中，酸濃度優(yōu)選在從0.01至IOwt %酸，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸的范圍內(nèi)。酸與該纖維素材料或包含木聚糖的材料接觸并且優(yōu)選在140°C -200°C，例如165°C _190°C的溫度范圍內(nèi)保持從I到60分鐘范圍內(nèi)的時(shí)間。
[0282]在另一個(gè)方面中，預(yù)處理以水性漿料形式發(fā)生。在優(yōu)選方面中，在預(yù)處理過程中，該纖維素材料或包含木聚糖的材料優(yōu)選以10-80wt%之間，例如20-70wt%或30-60wt%(如大約40wt%)的量存在。預(yù)處理的纖維素材料或包含木聚糖的材料可以不被洗滌或可以使用本領(lǐng)域中已知的任何方法進(jìn)行洗滌，例如用水洗滌。
[0283]機(jī)械預(yù)處理或物理預(yù)處理:術(shù)語“機(jī)械預(yù)處理”或“物理預(yù)處理”是指促進(jìn)顆粒的大小縮減的任何預(yù)處理。例如，此類預(yù)處理可以涉及不同類型的研磨(grinding)或碾磨(milling)(例如,干磨、濕磨或振動球磨)。
[0284]該纖維素材料或包含木聚糖的材料可以物理地(機(jī)械地)且化學(xué)地進(jìn)行預(yù)處理。機(jī)械預(yù)處理或物理預(yù)處理可以與汽蒸/蒸汽爆炸、水熱解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸處理、高溫、高壓處理、輻射(例如微波輻射)、或其組合相結(jié)合。在一個(gè)方面中，高壓是指優(yōu)選在約100至約400psi,例如約150至約250psi范圍內(nèi)的壓力。在另一個(gè)方面中，高溫是指在約100°C至約300°C，例如約140°C至約200°C范圍內(nèi)的溫度。在一個(gè)優(yōu)選方面中，機(jī)械預(yù)處理或物理預(yù)處理在使用如上所定義的高壓和高溫的蒸汽槍水解器系統(tǒng)的分批過程中進(jìn)行，例如可購自順智公司(Sunds Defibrator AB),瑞典的Sunds水解器。根據(jù)需要,可以順序或同時(shí)進(jìn)行物理預(yù)處理和化學(xué)預(yù)處理。
[0285] 因此，在一個(gè)優(yōu)選方面中，使該纖維素材料或包含木聚糖的材料經(jīng)受物理(機(jī)械)或化學(xué)預(yù)處理或其任何組合，以促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素的分離和/或釋放。
[0286]生物預(yù)處理:術(shù)語“生物預(yù)處理”是指促進(jìn)纖維素、半纖維素、和/或木質(zhì)素從該纖維素材料或包含木聚糖的材料分離和/或釋放的任何生物預(yù)處理。生物預(yù)處理技術(shù)可以涉及應(yīng)用溶解木質(zhì)素的微生物和/或酶(參見例如，Hsu(舒)，T.-A.,1996,Pretreatment of biomass (生物質(zhì)的預(yù)處理)，在生物乙醇:生產(chǎn)與利用手冊中，懷曼，C.E.，編輯，泰勒&弗朗西斯，華盛頓特區(qū)，179-212 ;Ghosh(高希)和Singh(辛格),1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbialconversion of cellulosic biomass (用于纖維素生物質(zhì)的酶/微生物轉(zhuǎn)化的物理化學(xué)和生物處理),Adv.Appl.Microbiol.(《應(yīng)用微生物學(xué)進(jìn)展》)39:295-333 ;McMillan (麥克米倫)，J.D.，1994，Pretreating lignocellulosic biomass:a review(預(yù)處理木質(zhì)纖維素生物質(zhì):評論)，在 Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production (用于燃料生產(chǎn)的生物質(zhì)的酶轉(zhuǎn)化)中，西默爾)，Μ.E.,Baker (貝克)，J.0.，和Overend (歐沃尼)，R.P.，編輯，ACS Symposium Series (研討會叢刊)566,美國化學(xué)學(xué)會,華盛頓特區(qū)，第 15 章；Gong(宮)，C.S.，Cao(曹)，N.J.，DuG1:)，J.，和 Tsao(查奧)，G.T., 1999, Ethanol production from renewable resources (從可再生資源生產(chǎn)乙醇)，在 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (《生化工程 / 生物技術(shù)進(jìn)展》)中，Scheper (斯卡皮爾)，T.,編輯，Springer-Verlag(施普林格出版社)柏林海德堡，德國，65:207-241 ；01sson(奧爾森)和 Hahn-Hagerdal (哈恩-海格達(dá)爾)，1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production(用于乙酉享生產(chǎn)的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的發(fā)酵)，Enz.Microb.Tech.(《酶與微生物技術(shù)》)18:312-331 ；以及 Vallander (瓦蘭德)和 Eriksson (埃里克森)，1"0, Production of ethanol fromlignocellulosic materials: State of the art (從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)乙醇:最先進(jìn)的技術(shù))，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.(《生化工程 / 生物技術(shù)進(jìn)展》)42:63-95)。
[0287]糖化。在水解(也被稱作糖化)步驟中，將例如預(yù)處理的纖維素材料或包含木聚糖的材料水解以將纖維素和/或半纖維素分解成可發(fā)酵糖，例如葡萄糖、纖維二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性低聚糖。水解由如在此描述的一種酶組合物在本發(fā)明的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下酶促地進(jìn)行。這些組合物的酶組分可以同時(shí)地或順序地添加。
[0288]酶水解優(yōu)選在易于由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定的條件下，在適合的水性環(huán)境中進(jìn)行。在一個(gè)方面中，水解在適于酶組分的活性，即，對于酶組分最佳的條件下進(jìn)行。水解能以分批補(bǔ)料或連續(xù)的過程進(jìn)行，其中將該纖維素材料或包含木聚糖的材料逐漸補(bǔ)入，例如，包含酶的水解溶液中。
[0289]糖化通常在攪拌罐反應(yīng)器或發(fā)酵罐中，在受控的pH、溫度和混合條件下進(jìn)行。適合的處理時(shí)間、溫度和pH條件可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。例如，糖化可以持續(xù)長達(dá)200小時(shí)，但是典型地進(jìn)行優(yōu)選地約12至約120小時(shí)，例如約16至約72小時(shí)或約24至約48小時(shí)。溫度優(yōu)選在約25°C至約70°C，例如約30°C至約65°C、約40°C至約60°C、或約50°C至約55°C的范圍。pH優(yōu)選在約3至約8，例如約3.5至約7、約4至約6、或約5.0至約5.5的范圍。干燥固體含量優(yōu)選在約5至約50wt%,例如約10至約40wt%或約20至約3(^丨％的范圍。
[0290]這些酶組合物可以包括可用于降解或轉(zhuǎn)化該纖維素材料或包含木聚糖的材料的任何蛋白質(zhì)。
[0291]在一個(gè)方面中，該酶組合物包括或進(jìn)一步包括選自下組的一種或多種(如，若干種)蛋白質(zhì)，該組由以下各項(xiàng)組成:纖維素酶、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽、半纖維素酶、酯酶、擴(kuò)張蛋白、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素。在另一個(gè)方面中，纖維素酶優(yōu)選是一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶。在另一個(gè)方面中，半纖維素酶優(yōu)選是一種或多種(例如，若干種)選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡萄糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。
[0292]在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種或多種(例如，若干種)纖維素分解酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括或進(jìn)一步包括一種或多種(例如，若干種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種或多種(例如，若干種)纖維素分解酶以及一種或多種(例如，若干種)半纖維素分解酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種或多種(例如，若干種)選自纖維素分解酶和半纖維素分解酶的組的酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖 酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種纖維二糖水解酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種β_葡糖苷酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種纖維二糖水解酶以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種β_葡糖苷酶以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種纖維二塘水解酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶以及一種葡糖苷酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種纖維二糖水解酶以及一種β_葡糖苷酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶、一種纖維二塘水解酶、以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶、一種β_葡糖苷酶、以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種纖維二糖水解酶、一種β -葡糖苷酶、以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶、一種纖維二塘水解酶、以及一種葡糖苷酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種內(nèi)切葡聚糖酶、一種纖維二塘水解酶、一種β -葡糖苷酶、以及一種具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽。
[0293]在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種乙酰甘露聚糖酯酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種乙酰木聚糖酯酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種阿拉伯聚糖酶(例如，a-L-阿拉伯聚糖酶)。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種阿拉伯呋喃糖苷酶(例如，a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種香豆酸酯酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種阿魏酸酯酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種半乳糖苷酶(例如，α -半乳糖苷酶和/或β -半乳糖苷酶)。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種葡萄糖醛酸酶(例如，α-D-葡萄糖醛酸酶)。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種葡萄糖醛酸酯酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種甘露聚糖酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種甘露糖苷酶(例如，β_甘露糖苷酶)。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種木聚糖酶。在一個(gè)優(yōu)選方面中，該木聚糖酶是一種家族10木聚糖酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種木糖苷酶(例如，β-木糖苷酶)。
[0294]在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種酯酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種擴(kuò)張蛋白。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種漆酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種木質(zhì)素分解酶。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該木質(zhì)素分解酶是一種錳過氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該木質(zhì)素分解酶是一種木質(zhì)素過氧化物酶。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該木質(zhì)素分解酶是一種產(chǎn)H2O2酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種果膠酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種過氧化物酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種蛋白酶。在另一個(gè)方面中，該酶組合物包括一種膨脹素。
[0295]在本發(fā)明的工藝中，可以在糖化、糖化和發(fā)酵、或發(fā)酵之前或過程中添加一種或多種酶。
[0296]該酶組合物的一種或多種(例如，若干種)組分可以是野生型蛋白、重組蛋白、或野生型蛋白和重組蛋白的組合。例如，一種或多種(例如，若干種)組分可以是一種細(xì)胞的天然蛋白質(zhì)，將該細(xì)胞用作重組地表達(dá)該酶組合物的一種或多種(例如，若干種)其他組分的宿主細(xì)胞。該酶組合物的一種或多種(例如，若干種)組分可以作為單組分來產(chǎn)生，然后將其合并以形成該酶組合物。該酶組合物可以是多組分和單組分蛋白制劑的組合。
[0297]在本發(fā)明的工藝中使用的酶可以處于任何適于使用的形式，例如像發(fā)酵液配制品或細(xì)胞組合物、具有或不具有細(xì)胞碎片的細(xì)胞裂解物、半純化的或純化的酶制劑、或作為酶的來源的宿主細(xì)胞。該酶組合物可以是干粉或顆粒，無粉塵的顆粒、液體、穩(wěn)定的液體、或穩(wěn)定的受保護(hù)的酶。液體酶制劑可以例如根據(jù)確定的工藝通過添加穩(wěn)定劑例如糖、糖醇或另一種多元醇，和/或乳酸或另一種有機(jī)酸得以穩(wěn)定。
[0298]酶和具有木聚糖酶活性的多肽的最佳量取決于若干因素，包括但不限于:纖維素分解酶和/或半纖維素分解酶組分的混合物、纖維素材料或包含木聚糖的材料、纖維素材料或包含木聚糖的材料的濃度、纖維素材料或包含木聚糖的材料的一種或多種預(yù)處理、溫度、時(shí)間、pH、以及包含的發(fā)酵生物(例如，用于同時(shí)糖化和發(fā)酵的酵母)。
[0299]在一個(gè)方面中，對于纖維素材料或包含木聚糖的材料來說的纖維素分解酶或半纖維素分解酶的有效量是約0.5至約50mg，例如約0.5至約40mg、約0.5至約25mg、約0.75至約20mg、約0.75至約15mg、約0.5至約10mg、或約2.5至約10mg/g的纖維素材料或包含木聚糖的材料。
[0300]在另一個(gè)方面中，對于纖維素材料或包含木聚糖的材料來說的具有木聚糖酶活性的多肽的有效量是約0.01至約50.0mg，例如約0.01至約40mg、約0.01至約30mg、約0.01至約 20mg、約 0.01 至約 10mg、約 0.01 至約 5mg、約 0.025 至約 1.5mg、約 0.05 至約 1.25mg、約 0.075 至約 1.25mg、約 0.1 至約 1.25mg、約 0.15 至約 1.25mg、或約 0.25 至約 1.0mg/g 的纖維素材料或包含木聚糖的材料。
[0301]在另一個(gè)方面中，對于纖維素分解酶或半纖維素分解酶來說的具有木聚糖酶活性的多肽的有效量是約0.005至約L 0g，例如約0.01至約L 0g、約0.15至約0.75g、約0.15至約0.5g、約0.1至約0.5g、約0.1至約0.25g、或約0.05至約0.2g/g的纖維素分解酶或半纖維素分解酶。
[0302]具有纖維素分解酶活性或半纖維素分解酶活性的多肽連同其他可用于該纖維素材料或包含木聚糖的材料的降解的蛋白質(zhì)/多肽，例如具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽(此后共同地是“具有酶活性的多肽”)可以衍生自或獲得自任何適合的來源，包括細(xì)菌、真菌、酵母、植物、或哺乳動物來源。術(shù)語“獲得”在此還指該酶可以在宿主生物中利用在此描述的方法重組地產(chǎn)生，其中重組產(chǎn)生的酶對于該宿主生物來說是天然的或異源的，或具有修飾的氨基酸序列，例如，具有一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重組產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段或通過本領(lǐng)域已知的氨基酸重排方法產(chǎn)生的酶。天然酶的含義中涵蓋天然變體，并且異源酶的含義中涵蓋重組(例如通過定點(diǎn)誘變或重排)獲得的變體。
[0303]具有酶活性的多肽可以是一種細(xì)菌多肽。例如，該多肽可以是具有酶活性的革蘭氏陽性細(xì)菌多肽，例如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽抱桿菌屬、熱解纖維素菌屬(Caldicellulosiruptor)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)、Thermobifidia或海洋芽抱桿菌屬(Oceanobacillus)多妝；或具有酶活性的革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，例如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭 桿菌屬、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬、或脲原體屬多肽。
[0304]在一個(gè)方面中，該多肽是具有酶活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)硬芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。
[0305]在另一方面中，該多肽是具有酶活性的馬鏈球菌、化膿鏈球菌、乳房鏈球菌、或馬鏈球菌獸疫亞種多肽。
[0306]在另一方面中，該多肽是具有酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌、灰色鏈絲菌、或變鉛青鏈霉菌多肽。
[0307]具有酶活性的多肽還可以是一種真菌多肽，并且更優(yōu)選是一種酵母多肽，例如具有酶活性的假絲酵母、克魯維酵母、畢赤酵母、子囊菌、裂殖酵母、或亞羅酵母多肽；或更優(yōu)選是一種絲狀真菌多肽，例如具有酶活性的支頂孢、落葉松蕈、支鏈孢、曲霉、短梗霉、一種輪紋病菌(Botryospaeria)、擬臘菌、毛_殼屬菌、金孢子菌、麥角菌、旋孢腔菌、擬鬼傘屬菌、家白蟻、棒囊孢殼菌、栗疫屬菌、隱球酵母、殼色單隔孢屬菌、黑耳屬菌、一種真菌(Filibasidium)、鐮刀菌、赤霉菌、全鞭毛蟲、腐質(zhì)霉、耙齒菌、香菇、小球腔菌、大毀殼屬菌、一種嗜熱菌(Melanocarpus)、亞灰樹花菌、毛霉菌、蝕絲霉屬菌、新美鞭菌、脈孢菌、擬青霉屬菌、青霉菌、平革菌、梨囊鞭菌屬、一種真菌(Poitrasia)、假黑盤菌、一種鞭毛蟲(Pseudotrichonympha)、根毛霉、裂裙菌、柱頂孢霉、踝節(jié)菌、嗜熱子囊菌、梭孢殼菌、彎頸霉、木霉屬菌、長毛盤菌、輪枝孢屬菌、小包腳菇、或炭角菌多肽。
[0308]在一個(gè)方面中，該多肽是具有酶活性的卡氏酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯費(fèi)酵母、諾地酶母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母多肽。
[0309]在另一個(gè)方面中，該多肽是具有酶活性的解纖維枝頂孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、拉克淖金孢子菌、熱帶金孢子菌、糞狀金孢子菌、狹邊金孢子菌、氈金孢子菌、女王杜香金孢子菌、褐薄金孢子菌、桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮刀菌、多枝鐮孢、粉紅鐮孢菌、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮刀菌、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮刀菌、鑲片鐮孢菌、灰腐質(zhì)霉、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白囊耙齒菌、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢原毛平革菌、無色梭孢殼、一種真菌(Thielavia albomyces)、一種真菌(Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱殼、一種真菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢殼、卵孢梭孢殼、一種真菌(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢殼、毛梭孢殼、耐熱梭孢殼、太瑞斯梭孢殼霉、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、綠色木霉多肽、或褐孢長毛盤菌(Trichophaea saccata)多肽。
[0310]也可以使用具有酶活性的多肽的化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體。
[0311]該酶組合物的一種或多種(例如，若干種)組分可以是一種重組組分，即通過克隆編碼該單一組分的DNA序列并且隨后用該DNA序列轉(zhuǎn)化并且在宿主中表達(dá)而產(chǎn)生(參見例如，W091/17243和W091/17244)。該宿主優(yōu)選是一種異源宿主(酶對宿主來說是外源的)，但該宿主在一定條件下也可以是一種同源宿主(酶對宿主來說是天然的)。還可以通過純化來自發(fā)酵液的這樣一種蛋白質(zhì)來制備單組份纖維素分解蛋白質(zhì)。
[0312]在一個(gè)方面中， 一種或多種(例如，若干種)纖維素分解酶包括一種商業(yè)化纖維素分解酶制劑。適用于在本發(fā)明中使用的商業(yè)化纖維素分解酶制劑的實(shí)例包括例如CELLIC? CTec (諾維信公司)、CELLIC? CTec2 (諾維信公司)、CELLIC? CTec3 (諾維信公司)、CELLUCLAST? (諾維信公司)、N0V0ZYM?188 (諾維信公司)、CELLUZYME?(諾維信公司)、CEREFL0?(諾維信公司)、以及ULTRAFL0?(諾維信公司)、ACCELERASE? (杰能科公司(Genencor Int.))、LAMINEX? (杰能科公司)、SPEZYME?CP (杰能科公司)、FILTRASE?NL(DSM) ； METHAPLUS? S/L100 (DSM)、R0HAMENT?7069ff (羅姆公司(R6hm GmbH))、FIBREZYME? LDI (并矢國際公司(Dyadic International, Inc.))、FIBREZYME?
LBR(并矢國際公司)、或VISCOSTAR? 150L(并矢國際公司)。將纖維素酶以從約0.001至約5.0wt%的固體,例如約0.025至約4.0wt%的固體或約0.005至約2.0wt%的固體的
有效量添加。
[0313]可以在本發(fā)明的工藝中使用的細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括，但不限于:嗜酸棲熱纖維素分解菌(Acidothermus cellulolyticus)的內(nèi)切葡聚糖酶(W091/05039 ；W093/15186 ;美國專利號 5，275,944 ；W096/02551 ;美國專利號 5，536,655，W000/70031,W005/093050);嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)內(nèi)切葡聚糖酶 III (W005/093050);以及嗜熱裂孢菌內(nèi)切葡聚糖酶V(TO05/093050)。
[0314]可以在本發(fā)明中使用的真菌內(nèi)切葡聚糖酶的實(shí)例包括，但不限于里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I (Penttila (潘提拉)等人，1986，Gene (《基因》)45:253-263，里氏木霉Cel7B內(nèi)切葡聚糖酶I (GENBANK?登錄號M15665)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II (Saloheimo (薩洛黑莫)等人，1988，《基因》63:11-22)，里氏木霉Cel5A內(nèi)切葡聚糖酶II (GENBANK?登錄號M19373)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III (Okada (網(wǎng)田)等人，1988，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》64:555-563，GENBANK?登錄號AB003694)、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V (薩洛黑莫等人，1994，《分子微生物學(xué)》13:219-228，GENBANK?登錄號Z33381)、棘孢曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Ooi (黃)等人，1990，《核酸研究》18:5884)、白曲霉內(nèi)切葡聚糖酶(Sakamoto (坂本)等人，1995，Current Genetics (《當(dāng)代遺傳學(xué)》)27:435-439)、歐文桿菌(Erwinia carotovara)內(nèi)切葡聚糖酶(Saarilahti (薩利拉特)等人，1990，《基因》90:9-14)、尖孢鐮刀菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK? 登錄號 L2938I)、腐質(zhì)霉嗜熱變種(Humicola grisea var.thermo idea)內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號AB003107)、熱白絲菌(Melanocarpus albomyces)內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號MAL515703)、粗糙脈孢菌內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號XM_324477)、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V、嗜熱毀絲霉CBS117.65內(nèi)切葡聚糖酶、擔(dān)子菌CBS495.95內(nèi)切葡聚糖酶、擔(dān)子菌CBS494.95內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉NRRL8126CEL6B內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉NRRL8126CEL6C內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉NRRL8126CEL7C內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼 霉NRRL8126CEL7E內(nèi)切葡聚糖酶、太瑞斯梭孢殼霉NRRL8126CEL7F內(nèi)切葡聚糖酶、一種真菌(Cladorrhinum foecundissimum) ATCC62373CEL7A內(nèi)切葡聚糖酶、以及里氏木霉菌株號VTT-D-80133內(nèi)切葡聚糖酶(GENBANK?登錄號M15665)。
[0315]可用于本發(fā)明的纖維二糖水解酶的實(shí)例包括，但不限于:棘孢曲霉纖維二糖水解酶II(W02011/059740)、嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶1、嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I1、特異腐質(zhì)霉纖維二糖水解酶1、嗜熱毀絲霉纖維二糖水解酶II (W02009/042871)、赫卡尼亞梭孢殼霉(Thielavia hyrcanie)纖維二糖水解酶II (W02010/141325)、太瑞斯梭孢殼霉纖維二糖水解酶II (CEL6A、W02006/074435)、里氏木霉纖維二糖水解酶1、里氏木霉纖維二糖水解酶I1、以及褐孢長毛盤菌纖維二糖水解酶II (W02010/057086)。
[0316]可用于本發(fā)明的葡糖苷酶的實(shí)例包括，但不限于來自以下各項(xiàng)的葡糖苷酶:棘孢曲霉(Kawaguchi(川口)等人，1996，《基因》173:287-288)、煙曲霉(W02005/047499)、黑曲霉(Dan (丹)等人，2000，《生物化學(xué)雜志》275:4973-4980)、米曲霉(TO2002/095014)、巴西青霉(Penicillium brasilianum) IBT20888 (TO2007/019442 和W02010/088387)、太瑞斯梭孢殼霉(W02011/035029)、以及褐孢長毛盤菌(W02007/019442)。
[0317]該葡糖苷酶可以是一種融合蛋白。在一個(gè)方面中，該葡糖苷酶是米曲霉葡糖苷酶變異體BG融合蛋白(W02008/057637)或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)。
[0318]其他有用的內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、以及葡糖苷酶使用根據(jù)Henrissat(亨利薩塔)B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases basedon amino-acid sequence similarities (基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分類)，Biochem.J.(《生物化學(xué)雜志》)280:309-316，和亨利薩塔B.，和Bairoch (巴洛赫)A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases (糖基水解酶的基于序列的分類的更新)，《生物化學(xué)雜志》316:695-696的分類披露于許多糖基水解酶家族中。
[0319]可以在本發(fā)明中使用的其他纖維素分解酶描述于W098/13465、W098/015619、W098/015633、W099/06574、W099/10481、W099/025847、W099/031255、W02002/101078,W02003/027306, W02003/052054, W02003/052055, W02003/052056, W02003/052057,W02003/052118, W02004/016760, W02004/043980, W02004/048592, W02005/001065,W02005/028636, W02005/093050, W02005/093073, W02006/074005, W02006/117432,W02007/071818、W02007/071820、W02008/008070、W02008/008793、美國專利號 5，457，046、美國專利號5，648，263、以及美國專利號5，686，593中。
[0320]在本發(fā)明的工藝中，具有增強(qiáng)纖維素分解活性的任何GH61多肽可以被用作該酶組合物的組分。
[0321]可用于本發(fā)明的工藝中的具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽的實(shí)例包括，但不限于來自以下各項(xiàng)的GH61多肽:太瑞斯梭孢殼霉(W02005/074647、W02008/148131、和 TO2011/035027)、橙色嗜熱子囊菌(W02005/074656 和 W02010/065830)、里氏木霉(W02007/089290)、嗜熱毀絲霉(W02009/085935、W02009/085859、W02009/085864、和 W02009/085868)、煙曲霉(W02010/138754)、嗜松青霉(W02011/005867)、嗜熱子囊屬(Thermoascus sp.) (W02011/039319)、青霉屬(W02011/041397)、以及硬皮嗜熱子囊菌(Thermoascus crustaceous) (W02011/041504)。
[0322]在一個(gè)方面中，根據(jù)W02008/151043，具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽在一種可溶性活化二價(jià)金屬陽離子(例如錳或銅)的存在下使用。
[0323]在另一個(gè)方面中，具有增強(qiáng)纖維素分解活性的GH61多肽在以下各項(xiàng)的存在下使用:二氧基化合物、雙環(huán)化合物、雜環(huán)化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或一種獲得自經(jīng)預(yù)處理的纖維素材料(例如預(yù)處理的玉米秸桿(PCS))的液體。
[0324]二氧基化合物可以包括包含兩個(gè)或更多個(gè)氧原子的任何適合化合物。在一些方面，二氧基化合物包含 一個(gè)如在此所述的被取代的芳基部分。二氧基化合物可以包括一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))羥基和/或羥基衍生物，而且還包括缺乏羥基和羥基衍生物的、經(jīng)取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性實(shí)例包括鄰苯二酚或兒茶酚；咖啡酸；3，4- 二羥基苯甲酸；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二酚；連苯三酚；沒食子酸；3，4，5-三羥基苯甲酸甲酯；2，3，4-三羥基二苯甲酮；2，6- 二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5- 二羥基苯甲酸；4-氯-1，2-苯二酚；4_硝基-1，2-苯二酚；丹寧酸；沒食子酸乙酯；羥乙酸甲酯；二羥基富馬酸；2_ 丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2，4_戊二醇；3-乙氧基-1，2-丙二醇；2，4，4’ -三羥基二苯甲酮；順-2- 丁烯-1，4- 二醇；3，4- 二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2- 二酮；二羥基丙酮；丙烯醛乙縮醛；4-羥基苯甲酸甲酯；4_羥基苯甲酸；以及3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸甲酯；或其鹽或溶劑化物。
[0325]雙環(huán)化合物可以包含如在此所述的任何適合被取代的稠環(huán)系統(tǒng)。這些化合物可以包含一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))另外的環(huán)，并且除非另有說明，否則不限于具體數(shù)目的環(huán)。在一個(gè)方面中，雙環(huán)化合物是一種類黃酮。在另一個(gè)方面中，雙環(huán)化合物是一種任選地被取代的異黃酮。在另一個(gè)方面中，雙環(huán)化合物是一種任選地被取代的花色羊離子(flavyliumion)，如一種任選地被取代的花色素或任選地被取代的花色素苷，或其衍生物。雙環(huán)化合物的非限制性實(shí)例包括表兒茶素；槲皮酮；楊梅黃酮；紫杉葉素；堪非醇；桑色素；刺槐素；柚皮素；異鼠李素；療黃素；矢車菊素；矢車菊素苷(cyanin);黑豆多酹(kuromanin);花青素鼠李葡糖苷；或其鹽或溶劑化物。
[0326]雜環(huán)化合物可以是如在此所述的任何適合化合物，如包含一個(gè)雜原子的一種任選地被取代的芳香族或非芳香族環(huán)。在一個(gè)方面中，雜環(huán)是包含一個(gè)任選地被取代的雜環(huán)烷基部分或一個(gè)任選地被取代的雜芳基部分的一種化合物。在另一個(gè)方面，任選地被取代的雜環(huán)烷基部分或任選地被取代的雜芳基部分是一個(gè)任選地被取代的5元雜環(huán)烷基或一個(gè)任選地被取代的5元雜芳基部分。在另一個(gè)方面，任選地被取代的雜環(huán)烷基或任選地被取代的雜芳基部分是一個(gè)選自以下的任選地被取代的部分:吡唑基、呋喃基、咪唑基、異噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、噠嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氫噻吩并吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、異喹啉基、異吲哚基、吖啶基、苯并異唑基、二甲基乙內(nèi)酸服、吡嚷基、四氣咲喃基、吡略琳基、吡略烷基、嗎琳基、Π引噪基、二氣呼基、氣呼基、噻呼基、哌啶基以及氧呼基。在另一個(gè)方面中，任選地被取代的雜環(huán)烷基部分或任選地被取代的雜芳基部分是一個(gè)任選地被取代的呋喃基。雜環(huán)化合物的非限制性實(shí)例包括(1，2-二羥基乙基)-3，4-二羥基呋喃-2 (5H)-酮；4-羥基-5-甲基_3_呋喃酮；5-羥基-2 (5H)-呋喃酮；[1，2-二羥基乙基]呋喃-2，3，4(5!1)-三酮；(1-羥基1-丁內(nèi)酯；核糖酸內(nèi)酯;己糖醒酸(aldohexuronicaldohexuronic acid) 內(nèi)酯;葡萄糖酸δ -內(nèi)酯；4_羥基香豆素；二氫苯并呋喃；5-(羥基甲基)糠醛；聯(lián)糠醛；2(5Η)_呋喃酮；5，6- 二氫-2Η-吡喃-2-酮；以及5，6- 二氫-4-羥基-6-甲基-2Η-吡喃-2-酮；或其鹽或溶劑化物。
[0327]含氮化合物可以是具有一個(gè)或多個(gè)氮原子的任何適合化合物。在一個(gè)方面中，含氮化合物包含一個(gè)胺、亞胺、羥胺或氮氧化物部分。含氮化合物的非限制性實(shí)例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2_氨基苯酚；1，2-苯二胺；2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧基；5，6，7，8-四氫生物蝶呤；6，7- 二甲基-5，6，7，8-四氫蝶呤；以及順丁烯酰胺酸；或其鹽或溶劑化物。
[0328]醌化合物可 以是包含一個(gè)如在此所述的醌部分的任何適合化合物。醌化合物的非限制性實(shí)例包括1，4-苯醌；1，4-萘醌；2_羥基-1，4-萘醌；2，3- 二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌或輔酶Qtl ;2，3，5,6-四甲基-1，4-苯醌或杜醌；1，4-二羥基蒽醌；3-羥基-1-甲基-5，6-吲哚啉二酮或腎上腺素紅；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌；吡咯并喹啉醌；或其鹽或溶劑化物。
[0329]含硫化合物可以是包括一個(gè)或多個(gè)硫原子的任何適合化合物。在一個(gè)方面中，含硫化合物包含一個(gè)選自以下的部分:亞硫?；?、硫醚、亞磺酰基、磺?；⒘蝓０?、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性實(shí)例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-1-硫醇；2-巰基乙磺酸；苯硫酚；苯-1，2- 二硫醇；半胱氨酸；蛋氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其鹽或溶劑化物。
[0330]在一個(gè)方面中，對于作為纖維素材料與纖維素的葡糖基單位的摩爾比例來說的上述的這樣一種化合物的有效量是約10_6至約10，例如約10_6至約7.5、約10_6至約5、約10_6至約2.5、約I(T6至約1、約I(T5至約1、約I(T5至約10'約I(T4至約10'約I(T3至約10'或約10-3至約10'在另一個(gè)方面中，上述的這樣一種化合物的有效量是約0.1 μ M至約1Μ，例如約0.5 μ M至約0.75Μ、約0.75 μ M至約0.5Μ、約I μ M至約0.25Μ、約I μ M至約0.1Μ、約5 μ M至約50mM、約10 μ M至約25mM、約50 μ M至約25mM、約10 μ M至約10mM、約5 μ M至約5mM、或約0.1mM至約ImM。
[0331]術(shù)語“液體”是指在如在此描述的條件下，由木質(zhì)纖維素和/或半纖維素材料或其單糖(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)在漿料中的處理產(chǎn)生的水性、有機(jī)、或其組合的溶液相，及其可溶性內(nèi)容物?？梢酝ㄟ^加熱和/或施壓，可任選地在一種催化劑(例如，酸)的存在下，可任選地在一種有機(jī)溶劑的存在下，并且可任選地與該材料的物理破壞組合來處理木質(zhì)纖維素或半纖維素材料(或原料)，并且然后將該溶液與剩余固體分離來生產(chǎn)GH61多肽的纖維素分解增強(qiáng)的液體。此類條件決定了在由纖維素酶制劑水解纖維素底物的過程中，通過液體和GH61多肽的組合可獲得的纖維素分解增強(qiáng)的程度。可以使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法將液體與所處理的材料分離，例如過濾、沉降、或離心。
[0332]在一個(gè)方面中，對于纖維素來說的液體的有效量是約10_6至約10g/g的纖維素，例如約ICT6至約7.5g、約ICT6至約5g、約ICT6至約2.5g、約ICT6至約lg、約ICT5至約lg、約I(T5至約10、、約I(T4至約10、、約I(T3至約lO^g、或約I(T3至約l(T2g/g的纖維素。
[0333]在一個(gè)方面中，一種或多種(例如，若干種)半纖維素分解酶包括一種商業(yè)化半纖維素分解酶制劑。適于在本發(fā)明中使用的商業(yè)化半纖維素分解酶制劑的實(shí)例包括例如 SHEARZYME?(諾維信公司)、CELLIC? HTec (諾維信公司)、CELLIC? HTec2(諾
維信公司)、CELLIC? HTec3 (諾維信公司)、VISCOZYMF R (諾維信公司)、1.JLTRAFLO? (諾維信公司)、PULPZYME? HC(諾維信公司)、MULTIFECT?木聚糖酶(杰能科公司)、ACCELLERASE? XY (杰能科公司)、ACCELLERASE?XC(杰能科公司)、ECOPULP? TX-200A(AB 酶公司(AB Enzymes))、HSP6000 木聚糖酶(DSM)、DEP0L?333P(生物催化劑有限公司(Biocatalysts Limit)，威爾士，英國)、DEP0L?740L.(生物催化 劑有限公司，威爾士，英國)、以及DEP0L?762P (生物催化劑有限公司，威爾士，英國)。
[0334]可用于本發(fā)明的工藝中的木聚糖酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的木聚糖酶:棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790 ;W094/21785)、煙曲霉(W02006/078256)、嗜松青霉(W02011/041405)、青霉屬(W02010/126772)、太瑞斯梭孢殼霉 NRRL8126 (W02009/079210)、以及褐孢長毛盤菌GHlO (W02011/057083)。
[0335]可用于本發(fā)明的工藝中的木糖苷酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的β -木糖苷酶:粗糙脈孢菌(SwissProt登錄號Q7S0W4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登錄號Q92458)、以及埃默森籃狀菌(SwissProt登錄號Q8X212)。
[0336]可用于本發(fā)明的工藝中的乙酰木聚糖酯酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的乙酰木聚糖酯酶:棘孢曲霉(W02010/108918)、球毛殼菌(Uniprot登錄號Q2GWX4)、細(xì)麗毛殼(GeneSeqP登錄號AAB82124)、特異腐質(zhì)霉DSM1800 (W02009/073709)、紅褐肉座菌(W02005/001036)、嗜熱毀絲霉(Myceliophtera thermophila) (W02010/014880)、粗糙脈孢菌(UniProt登錄號q7s259)、穎枯殼針孢(Uniprot登錄號Q0UHJ1)、以及太瑞斯梭孢殼霉NRRL8126(W02009/042846)。
[0337]可用于本發(fā)明的工藝中的阿魏酸酯酶(feruloyl esterase, ferulicacid esterase)的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的阿魏酸酯酶:特異腐質(zhì)霉DSM1800 (W02009/076122)、費(fèi)希新薩托菌(Neosartorya fischeri) (UniProt 登錄號A1D9T4)、粗糙脈孢菌(UniProt登錄號Q9HGR3)、黃灰青霉(W02009/127729)、以及太瑞斯梭孢殼霉(W02010/053838 和 TO2010/065448)。[0338]可用于本發(fā)明的工藝中的阿拉伯呋喃糖苷酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的阿拉伯呋喃糖苷酶:黑曲霉(GeneSeqP登錄號AAR94170)、特異腐質(zhì)霉DSM1800 (W02006/114094 和 W02009/073383)、以及巨芒(M.giganteus) (W02006/114094)。
[0339] 可用于本發(fā)明的工藝中的α-葡萄糖醛酸酶的實(shí)例包括但不限于來自以下各項(xiàng)的α -葡萄糖醒酸酶:棒曲霉(UniProt登錄號alccl2)、煙曲霉(SwissProt登錄號Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登錄號Q96WX9)、土曲霉(SwissProt登錄號Q0CJP9)、特異腐質(zhì)霉(W02010/014706)、黃灰青霉(W02009/068565)、埃默森籃狀菌(UniProt 登錄號 Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登錄號Q99024)。
[0340]用于本發(fā)明的工藝中的具有酶活性的多肽可以通過在含有適合的碳源和氮源以及無機(jī)鹽的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，使用本領(lǐng)域已知的程序發(fā)酵上面指出的微生物菌株來產(chǎn)生(參見例如，Bennett (班尼特)，J.W.和 LaSure (拉素爾)，L.(編輯)，More Gene Manipulationsin Fungi (《真菌中的更多基因操作》)，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)，加州，1991)。合適的培養(yǎng)基從商業(yè)供應(yīng)商處可獲得，或者可根據(jù)公開的組成(例如，在美國模式培養(yǎng)物保藏所目錄中)來制備。適于生長和酶生產(chǎn)的溫度范圍和其他條件在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如，Bailey (貝利),J.E.,和 Ollis (奧利斯)，D.F., Biochemical EngineeringFundamentals (《生化工程基礎(chǔ)》)，McGraw-Hill Book Company (麥格勞-希爾圖書公司),紐約，1986)。
[0341]發(fā)酵可以是導(dǎo)致酶或蛋白質(zhì)的表達(dá)或分離的培養(yǎng)細(xì)胞的任何方法。所以，可以將發(fā)酵理解為包括搖瓶培養(yǎng)，或者在一種適合的培養(yǎng)基中并且在允許表達(dá)或分離該酶的條件下在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)。通過上述方法產(chǎn)生的所得酶可以從發(fā)酵培養(yǎng)基回收并且通過常規(guī)程
序純化。
[0342]發(fā)酵?？梢酝ㄟ^一種或多種(例如，若干種)能夠?qū)⑻侵苯踊蜷g接發(fā)酵為所希望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵微生物來發(fā)酵自水解的纖維素材料或包含木聚糖的材料獲得的可發(fā)酵糖?！鞍l(fā)酵”或“發(fā)酵過程”是指任何發(fā)酵過程或包括發(fā)酵步驟的任何過程。發(fā)酵過程還包括用于消費(fèi)性醇工業(yè)(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工業(yè)(例如發(fā)酵奶制品)、皮革工業(yè)、以及煙草工業(yè)的發(fā)酵過程。發(fā)酵條件取決于所希望的發(fā)酵產(chǎn)物和發(fā)酵生物體，并且可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。
[0343]在發(fā)酵步驟中，作為預(yù)處理和酶水解步驟的結(jié)果的由纖維素材料或包含木聚糖的材料釋放的糖，由發(fā)酵生物體(例如酵母)發(fā)酵為產(chǎn)物，如，乙醇。如在此描述，水解(糖化)和發(fā)酵可以是分開的或同時(shí)的。
[0344]在實(shí)踐本發(fā)明的發(fā)酵步驟中可以使用任何適合的水解的纖維素材料或包含木聚糖的材料。通常根據(jù)所希望的發(fā)酵產(chǎn)物(即，要從發(fā)酵獲得的物質(zhì))和利用的方法來選擇材料，如本領(lǐng)域中所熟知的。
[0345]術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”在此應(yīng)被理解為是指添加一種或多種發(fā)酵微生物之前的培養(yǎng)基，例如，由糖化過程產(chǎn)生的培養(yǎng)基，以及在同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵工藝(SSF)中使用的培養(yǎng)基。
[0346]“發(fā)酵微生物”是指適用于所希望的發(fā)酵過程以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的任何微生物，包括細(xì)菌和真菌生物體。發(fā)酵生物體可以是己糖和/或戊糖發(fā)酵生物體、或其組合。己糖和戊糖發(fā)酵生物體在本領(lǐng)域中都是熟知的。適合的發(fā)酵微生物能夠?qū)⑻?例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或低聚糖)直接或間接地發(fā)酵(即，轉(zhuǎn)化)為所希望的發(fā)酵產(chǎn)物。生產(chǎn)乙醇的細(xì)菌和真菌發(fā)酵生物體的實(shí)例由Lin (林)等人，2006，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》69:627-642進(jìn)行了描述。
[0347]可以發(fā)酵己糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，例如酵母。優(yōu)選的酵母包括假絲酵母屬、克魯維酵母菌屬、以及釀酒酵母屬(Saccharomyces)的菌株,例如薩納瑞西斯假絲酵母(Candida sonorensis)、馬克思克魯維酵母、以及釀酒酵母。
[0348]可以發(fā)酵處于其天然狀態(tài)的戊糖的發(fā)酵微生物的實(shí)例包括細(xì)菌和真菌生物體，例如一些酵母。優(yōu)選的發(fā)酵木糖的酵母包括假絲酵母屬的菌株，優(yōu)選是休哈塔假絲酵母(C.sheatae)或薩納瑞西斯假絲酵母(C.sonorensis);以及畢赤酵母屬的菌株,優(yōu)選是樹干畢赤酵母，例如樹干畢赤酵母CBS5773。優(yōu)選的發(fā)酵戊糖的酵母包括管囊酵母屬的菌株，優(yōu)選是嗜鞋管囊酵母(P.tannophilus)。不能發(fā)酵戍糖(例如木糖和阿拉伯糖)的生物體可以通過本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行遺傳修飾以能夠發(fā)酵戊糖。
[0349]可以將己糖和戊糖有效地發(fā)酵為乙醇的細(xì)菌的實(shí)例包括例如凝結(jié)芽孢桿菌、丙酮丁醇梭桿菌、熱纖維梭菌、弗陶菲爾門塔斯梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢桿菌屬、嗜熱厭氧糖分解菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Philippidis (菲利普斯)，1996，同上)。
[0350]其他發(fā)酵生物體包括以下各項(xiàng)的菌株:芽孢桿菌屬，例如凝結(jié)芽孢桿菌；假絲酵母屬，例如薩納瑞西斯假絲酵母、麥斯諾索巴薩假絲酵母(C.methanosorbosa)、狄敦思假絲酵母(C.diddensiae)、近平滑假絲酵母、內(nèi)德頓卓假絲酵母(C.naedodendra)、布朗克假絲酵母(C.blankii)、恩脫墨菲利亞假絲酵母(C.entomophilia)、蕓苔假絲酵母、擬熱帶假絲酵母(C.pseudotropicalis)、博伊丁假絲酵母(C.boidinii)、產(chǎn)朊假絲酵母(C.utilis)、以及休哈塔假絲酵母；梭菌屬，例如丙酮丁醇梭菌、熱纖維梭菌、以及弗陶菲爾門塔斯梭菌(C.phytofermentans);大腸桿菌屬，特別是已經(jīng)進(jìn)行遺傳修飾以改進(jìn)乙醇產(chǎn)量的大腸桿菌菌株；土芽孢桿菌屬；漢遜酵母屬，例如異常漢森酵母；克雷白氏桿菌屬，例如產(chǎn)酸克雷伯菌(K.0xytoca);克魯維酵母菌屬，例如馬克思克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)、以及脆壁克魯維酵母；裂殖酵母屬，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe);嗜熱厭氧桿菌屬，例如嗜熱厭氧糖分解桿菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum);以及發(fā)酵單胞菌屬,例如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。
[0351]在一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是酒香酵母屬(Bretannomyces)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是克勞森酒香酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是假絲酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種薩納瑞西斯假絲酵母(Candida sonorensis)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種博伊丁假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種布朗克假絲酵母(Candida blankii)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種蕓苔假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種迪丹斯假絲酵母(Candida diddensii)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種嗜蟲假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種擬熱帶假絲酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種休哈塔假絲酵母(Candidascehatae)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種產(chǎn)朊假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是棒孢酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種葡萄牙棒孢酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是一種仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是克魯維酵母菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是脆壁克魯維酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是馬克思克魯維酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是耐熱克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是管囊酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是畢赤酵母屬。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是樹干畢赤酵母。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該酵母是釀酒酵母屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是釀酒酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是糖化酵母。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酵母是葡萄汁酵母。
[0352]在一個(gè)優(yōu)選方面中，該細(xì)菌是芽孢桿菌屬。在一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是凝結(jié)芽孢桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該細(xì)菌是梭菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是丙酮丁醇梭桿菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是弗陶菲爾門塔斯梭菌(Clostridiumphytofermentan) ?在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是熱纖維梭菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是Geobacilus屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是嗜熱厭氧桿菌。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是嗜熱厭氧糖分解桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該細(xì)菌是發(fā)酵單胞菌屬。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該細(xì)菌是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。
[0353]可商購的適合乙醇生產(chǎn)的酵母包括例如，BIOFERM?AFT和XR(NABC_北美生物產(chǎn)品股份有限公司(North American Bioproducts Corporation),佐治亞州，美國)、ETHANOLRED?酵母(弗曼迪斯/樂斯福公司(Fermentis/Lesaffre),美國)、FALI?(弗萊希曼氏酵母公司(Fleischmann’ s Yeast)，美國)、FERMIOL?(DSM專業(yè)公司(DSMSpecialties))、GERTSTRAND? (格特特蘭德 AB 公司(Gert Strand AB)，瑞典)、以及 SUPERSTART?和 THERMOSACC?新鮮酵母(乙醇技術(shù)公司(Ethanol Technology),威斯康星州，美國)。
[0354]在一個(gè)優(yōu)選方面中，發(fā)酵微生物已經(jīng)進(jìn)行遺傳修飾，以提供發(fā)酵戊糖的能力，例如如利用木糖、利用阿拉伯 糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0355]通過將異源基因克隆進(jìn)不同發(fā)酵微生物已經(jīng)構(gòu)建了能夠?qū)⒓禾呛臀焯寝D(zhuǎn)化為乙醇(共發(fā)酵)的生物體(Chen (陳)和Ho (胡)，1993, Cloning and improvingthe expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomycescerevisiae (在釀酒酵母中克隆樹干畢赤酵母木糖還原酶基因并改進(jìn)其表達(dá))，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》39-40:135-147 ;胡等人，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose (會泛夠有效地共發(fā)酵葡萄糖和木糖的遺傳工程化的釀酒酵母)，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》64:1852-1859 ；Kotter (科特)和 Ciriacy (斯萊斯)，1993，Xylose fermentation by Saccharomycescerevisiae (釀酒酵母對木糖的發(fā)酵)，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》38:776-783 ；Walfridsson(沃夫迪森)等人，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiaestrains overexpressing the TKLland TALlgenes encoding the pentose phosphatepathway enzymes transketolase and transaldolase (過量表達(dá)編碼戊醣憐酸途徑酶轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶的TKLl和TALl基因的代謝木糖的釀酒酵母)，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》61:4184-4190 ;Kuyper (凱博)等人，2004，Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proofof principle (用于高效厭氧發(fā)酵木糖的釀酒酵母的最小的代謝工程研究:原理的證明)，F(xiàn)EMS Yeast Research (《FEMS 酵母研究》)4:655-664 ;BealI (比爾)等人，1991, Parametricstudies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinantEscherichia coli (由重組大腸桿菌從木糖和其他糖類生產(chǎn)乙醇的參數(shù)研究)，Biotech.Bioeng.(《生物技術(shù)與生物工程》)38:296-303 ;Ingram(英格拉姆)等人，1998,Metabolicengineering of bacteria for ethanol production(用于生產(chǎn)乙醇的細(xì)菌的代謝工程研究)，《生物技術(shù)與生物工程》58:204-214 ；Zhang(張)等人，1995,Metabolic engineeringof a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis (產(chǎn)乙酉享的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌中的戊糖代謝途徑代謝工程研究)，Science (《科學(xué)》)267:240-243 ；Deanda(戴安達(dá))等人，1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonasmobilis strain by metabolic pathway engineering(發(fā)酵阿拉伯糖生物運(yùn)動發(fā)酵單胞菌株的代謝途徑工程的發(fā)展)，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》62:4465-4470 ;W02003/062430，木糖異構(gòu)酶)。
[0356]在一個(gè)優(yōu)選方面中，該遺傳修飾的發(fā)酵微生物是薩納瑞西斯假絲酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該 遺傳修飾的發(fā)酵微生物是大腸桿菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該遺傳修飾的發(fā)酵微生物是產(chǎn)酸克雷伯菌。在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該遺傳修飾的發(fā)酵微生物是馬克思克魯維酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該遺傳修飾的發(fā)酵微生物是釀酒酵母。在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該遺傳修飾的發(fā)酵微生物是運(yùn)動發(fā)酵單胞菌。
[0357]在本領(lǐng)域中熟知的是，上述生物體還能用于生產(chǎn)其他物質(zhì)，如在此所描述。
[0358]典型地向降解的纖維素材料或包含木聚糖的材料或水解產(chǎn)物中添加發(fā)酵微生物，并且進(jìn)行約8至約96小時(shí)，例如約24至約60小時(shí)發(fā)酵。溫度典型地在約26°C至約60°C之間，例如約32°C或50°C，并且典型地在約pH3至約pH8之間，例如pH4_5、6、或7。
[0359]在一個(gè)方面中，向降解的纖維素材料或包含木聚糖的材料中施用酵母和/或另一種微生物并且發(fā)酵進(jìn)行約12至約96小時(shí)，例如典型地是24-60小時(shí)。在另一個(gè)方面中，溫度優(yōu)選在約20°C至約60°C之間，例如約25°C至約50°C、約32°C至約50°C、或約32°C至約50°C，并且pH通常是從約pH3至約pH7，例如約pH4至約pH7。然而，一些發(fā)酵生物體(例如，細(xì)菌)具有較高的發(fā)酵最適溫度。優(yōu)選地以以下量施用酵母或另一種微生物，大約IO5至1012，優(yōu)選是從大約IO7至101(1，尤其是大約2 X IO8活細(xì)胞計(jì)數(shù)/ml的發(fā)酵液。關(guān)于使用酵母用于發(fā)酵的另外的指導(dǎo)可以發(fā)現(xiàn)于例如“The Alcohol Textbook(乙醇教科書)”(編輯K.Jacques (雅克),T.P.Lyons (里昂)和 D.R.Kelsall (凱爾瑟爾)，NottinghamUniversity Press (諾丁漢大學(xué)出版社)，英國1999)中，將其通過引用而特此結(jié)合。
[0360]可以將一種發(fā)酵刺激劑與在此描述的任何的工藝組合使用以進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵過程，并且特別是改進(jìn)發(fā)酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇產(chǎn)量?！鞍l(fā)酵刺激劑”是指發(fā)酵微生物(特別是酵母)生長刺激劑。優(yōu)選的發(fā)酵生長刺激劑包括維生素和礦物質(zhì)。維生素的實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、對氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、以及維生素A、維生素B、維生素C、維生素D、以及維生素E。參見例如，Alfenore (奧芬諾拉)等人，Improving ethanol production and viabilityof Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed—batchprocess (在補(bǔ)料分批工藝過程中通過維生素補(bǔ)料策略改進(jìn)乙醇生產(chǎn)和釀酒酵母的生存力)，Springer-Verlag(施普林格出版社)(2002),將其通過引用而特此結(jié)合。礦物質(zhì)的實(shí)例包括那些能提供含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu營養(yǎng)素的礦物質(zhì)和礦物鹽。
[0361]發(fā)酵產(chǎn)物:發(fā)酵產(chǎn)物可以是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可以是，不限于:醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、異丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、乙二醇、1，3-丙二醇[丙二醇(propylene glycol) ]、丁二醇、甘油、山梨糖醇、以及木糖醇)；鏈烷烴(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、環(huán)烷烴(例如，環(huán)戊烷、環(huán)己烷、環(huán)庚烷、以及環(huán)辛烷)、鏈烯烴(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、以及蘇氨酸)；氣體(例如，甲烷、氫氣(H2)、二氧化碳(CO2)、以及一氧化碳(CO));異戊二烯；酮(例如，丙酮)；有機(jī)酸(例如，乙酸、乙酮酸、己二酸、抗壞血酸、檸檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羥基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸)；以及聚酮化合物。發(fā)酵產(chǎn)物還可以是作為高價(jià)值產(chǎn)品的蛋白質(zhì)。
[0362]在一個(gè)優(yōu)選方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種醇。將理解的是，術(shù)語“醇”涵蓋包含一個(gè)或多個(gè)羥基部分的物質(zhì)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是正丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是異丁醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是乙醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是甲醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是阿拉伯糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是丁二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是乙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是甘油(glycerin)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是丙三醇(glycerol)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是1，3-丙二醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是山梨糖醇。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，醇是木糖醇。參見例如，Gong(宮)等人，1999, Ethanol production from renewable resources (由可再生資源生產(chǎn)乙醇)，在《生化工程/生物技術(shù)進(jìn)展》中，斯卡皮爾，T.，編輯，施普林格出版社柏林海德堡，德國，65:207-241 ;Silveira(西爾維拉)和Jonas (喬納斯)，2002，Thebiotechnological pr oduction of sorbitol (山梨糖醇的生物技術(shù)生產(chǎn))，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》59:400-408 ;Nigam(尼加姆)和辛格，1995, Processes for fermentativeproduction of xylitol - a sugar substitute (木糖醇-一種糖替代物的發(fā)酵生產(chǎn)工藝)，Process Biochemistry (《加工生物化學(xué)》)30 (2): 117-124 ;Ezeji (埃塞吉)等人,2003,Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOlandin situ recovery by gas stripping (由拜氏梭菌BAlOl生產(chǎn)丙酮，丁醇和乙醇并通過氣提進(jìn)行原位回收)，World Journal of Microbiology and Biotechnology (《微生物與生物技術(shù)世界雜志》)19 (6): 595-603。
[0363]在另一個(gè)優(yōu)選方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種鏈烷烴。該鏈烷烴可以是直鏈的或支鏈的鏈烷烴。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是戊烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是己烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是庚烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是辛烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是壬烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是癸烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是十一烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烷烴是十二烷。
[0364]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種環(huán)烷烴。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該環(huán)烷烴是環(huán)戊烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該環(huán)烷烴是環(huán)己烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該環(huán)烷烴是環(huán)庚烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該環(huán)烷烴是環(huán)辛烷。
[0365]在另一個(gè)的優(yōu)選方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種鏈烯烴。該鏈烯烴可以是直鏈的或支鏈的鏈烯烴。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烯烴是戊烯。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烯烴是己烯。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烯烴是庚烯。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該鏈烯烴是辛烯。
[0366]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種氨基酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氨基酸是天冬氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氨基酸是谷氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氨基酸是甘氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氨基酸是賴氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氨基酸是絲氨酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氨基酸是蘇氨酸。參見例如，Richard (理查德)，A.,和 Margaritis (馬加里蒂斯)，A., 2004, Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid)production andother microbial biopolymers (聚(谷氨酸)生產(chǎn)和其他微生物的生物聚合物的分批發(fā)酵動力學(xué)的經(jīng)驗(yàn)性建模)，Biotechnology and Bioengineering(《生物技術(shù)與生物工程》)87(4): 501-515。
[0367]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種氣體。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氣體是甲烷。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氣體是H2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氣體是CO2。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該氣體是CO。參見例如,Kataoka (片R )等人，1997, Studieson hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producinganaerobic bacteria(對產(chǎn)氫厭氧細(xì)菌的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的產(chǎn)氫研究)，Water Scienceand Technology (《水科學(xué)與技術(shù)》)36 (6-7): 41-47 ;以及 Gunaseelan (古納森蘭)，1997,Biomass and Bioe nerg(生物質(zhì)與生物能源)13 (1-2):83-114, Anaerobic digestion ofbiomass for methane production:A review(用于生產(chǎn)甲燒的生物質(zhì)的厭氧消化:評論)。
[0368]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是異戊二烯。
[0369]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種酮。將理解的是，術(shù)語“酮”涵蓋包含一個(gè)或多個(gè)酮部分的物質(zhì)。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該酮是丙酮。參見例如，Qureshi (庫雷希)和Blaschek (布拉斯科)，2003,同上。
[0370]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是一種有機(jī)酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是乙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是乙酮酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是己二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是抗壞血酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是檸檬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是2，5- 二酮-D-葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是甲酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是富馬酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是葡糖二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是葡糖酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是葡糖醛酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是戊二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是3-羥基丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是衣康酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是乳酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是蘋果酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是丙二酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是草酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是丙酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是琥珀酸。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面中，該有機(jī)酸是木糖酸。參見例如，Chen (陳)和 Lee (李)，1997，Membrane-mediated extractive fermentation forlactic acid production from cellulosic biomass (用于從纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸的膜介導(dǎo)的萃取發(fā)酵)，《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》63-65:435-448。[0371]在另一個(gè)優(yōu)選的方面中，該發(fā)酵產(chǎn)物是聚酮化合物。
[0372]回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何方法可任選地從發(fā)酵培養(yǎng)基回收一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物，這些方法包括但不限于，色譜法、電泳程序、溶解度差異(differentialsolubility)、蒸餾、或萃取。例如，通過蒸餾的常規(guī)方法將醇與發(fā)酵的纖維素材料或包含木聚糖的材料分離并純化。可以獲得純度高達(dá)約96vol.%的乙醇，可以將其用作例如燃料乙醇、飲用乙醇(即可飲用的中性烈酒)、或工業(yè)乙醇。
[0373]信號肽
[0374]本發(fā)明還涉及一種編碼信號肽的分離的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸I到22或由其組成。該多核苷酸可以進(jìn)一步包括一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)可操作地連接到該信號肽。該蛋白質(zhì)優(yōu)選地對于該信號肽來說是異源的。在一個(gè)方面中，編碼該信號肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1的核苷酸I到66。
[0375]本發(fā)明還涉及包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞。
[0376]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括(a)對包含被可操作地連接至編碼該蛋白質(zhì)的基因的這樣一種多核苷酸的重組宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；并且可任選地(b)回收該蛋白質(zhì)。
[0377]該蛋白質(zhì)對于宿主細(xì)胞來說可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在此不意圖是指一種特定長度 的編碼產(chǎn)物，并且因此涵蓋肽、寡肽及多肽。術(shù)語“蛋白質(zhì)”還涵蓋組合形成編碼的產(chǎn)物的兩個(gè)或更多個(gè)多肽。這些蛋白質(zhì)還包括雜合多肽和融合多肽。
[0378]優(yōu)選地，該蛋白質(zhì)是一種激素、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)告子。例如，該蛋白質(zhì)可以是一種水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶，例如α-半乳糖苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0379]該基因可以從任何原核、真核或其他來源獲得。
[0380]本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)例進(jìn)行描述，這些實(shí)例不應(yīng)被解釋成限制本發(fā)明的范圍。
[0381]實(shí)例
[0382]株系
[0383]將膠囊青霉株系ΙΒΤ4903用作具有木聚糖酶活性的多肽的來源。將米曲霉ΜΤ3568株系用于編碼具有木聚糖酶活性的多肽的膠囊青霉基因的表達(dá)。米曲霉ΜΤ3568是米曲霉JaL355的amdS (乙酰胺酶)破壞的基因衍生物(W02002/40694)，其中通過破壞米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因修復(fù)pyrG營養(yǎng)缺陷體。
[0384]培養(yǎng)基和溶液
[0385]YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基由1%酵母提取物、2%蛋白胨、以及去離子水中的2%葡萄糖組成。
[0386]PDA板由馬鈴薯浸出液組成，該馬鈴薯浸出液是通過將300g切片的馬鈴薯(洗滌但未削皮)在水中煮沸30分鐘，并且然后將該培養(yǎng)液傾析或?yàn)V過粗濾布而制成。然后添加蒸餾水，直到懸浮液的總體積為I升，隨后添加20g的右旋糖和20g的瓊脂粉。該培養(yǎng)基通過在15psi下高壓殺菌15分鐘來進(jìn)行滅菌(《細(xì)菌學(xué)分析手冊》，第8版，修訂A，1998)。
[0387]LB板由IOg的細(xì)菌用胰蛋白胨(Bacto-Tryptone)、5g的酵母提取物、IOg的氯化鈉、15g的細(xì)菌用瓊脂及補(bǔ)足到I升的去離子水組成。
[0388]LB培養(yǎng)基由IOg的細(xì)菌用胰蛋白胨、5g的酵母提取物、IOg的氯化鈉，以及補(bǔ)足到I升的去離子水組成。
[0389]COVE蔗糖板由342g的蔗糖、20g的瓊脂粉、20ml的COVE鹽溶液及補(bǔ)足到I升的去離子水組成。該培養(yǎng)基通過在15psi下高壓殺菌15分鐘來進(jìn)行滅菌(《細(xì)菌學(xué)分析手冊》，第8版，修訂A，1998)。將培養(yǎng)基冷卻至60°C并且然后添加無菌的乙酰胺和CsCl至濃度為IOmM和15mM，隨后以50 μ l/500ml的培養(yǎng)基添加叮RITON? X-1OO0
[0390]COVE 鹽溶液由 26g 的 MgSO4.7H20、26g 的 KCl、26g 的 KH2P04、50ml 的 COVE 痕量金屬溶液及補(bǔ)足到I升的去離子水組成。
[0391]COVE 痕量金屬溶液由 0.04g 的 Na2B4O7.10H20、0.4g 的 CuSO4.5H20、1.2g 的FeSO4.7Η20、0.7g 的 MnSO4.H20,0.8g 的 Na2MoO4.2H20、10g 的 ZnSO4.7H20 及補(bǔ)足到 I 升的去離子水組成。
[0392]Dap-4C 培養(yǎng)基由 20g 的右旋糖、IOg 的麥芽糖、Ilg 的 MgSO4.7H20、lg 的 ΚΗ2Ρ04、2g 的檸檬酸、5.2g 的 K3PO4.Η20、0.5g 的酵母提取物(Difco)、Iml 的 D0WFAX?63N10 (陶氏化學(xué)公司(Dow Chemical Company),米德蘭市,密歇根州，美國)、0.5ml的KU6痕量金屬溶液、2.5g的CaCO3及補(bǔ)足到I升的去離子水組成。該培養(yǎng)基通過在15psi下高壓殺菌15分鐘來進(jìn)行滅菌(《細(xì)菌學(xué)分析手冊》，第8版，修訂A，1998)。在使用之前，每150ml的培養(yǎng)基添加3.5ml的無菌的50% (NH4)2HPO4和5ml的無菌的20%乳酸。
[0393]KU6 痕量金屬溶液由 0.13g 的 NiCl2,2.5g 的 CuSO4.5H20、13.9g 的 FeSO4.7H20、8.45g的MnSO4.H20、6.8g的ZnCl2、3g的檸檬酸及補(bǔ)足到I升的去離子水組成。
[0394]實(shí)例1:膠囊青霉株系IBT4903的DNA序列信息的來源
[0395]在中國北京的北京基因組研究所(BGI)由分離自膠囊青霉株系IBT4903的基因組DNA通過億明達(dá)(Illumina)DNA測序產(chǎn)生基因組序列信息。使用Pedant-Pro?序列分析套件(Pedant-Pro?Sequence Analysis Suite)(百瑪士資訊公司(Biomax Informatics AG),馬丁雷德，德國)分析基因組的初步裝配。將由軟件構(gòu)建的基因模型用作檢測基因組中的GHlO同系物的起始點(diǎn)。使用多個(gè)作為向?qū)У囊阎腉HlO蛋白質(zhì)序列構(gòu)建更精確的基因模型。
[0396]實(shí)例2:膠囊青霉株系IBT4903基因組DNA提取
[0397]通過使膠囊青霉株系IBT4903在PDA板上，在26 °C下生長7天使其進(jìn)行繁殖。使用從PDA板收獲的孢子接種在帶擋板的搖瓶中的25ml的YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基里并且在26°C下孵育72小時(shí)，同時(shí)以85rpm攪拌。
[0398]根據(jù)DNEASY? Plant Maxi試劑盒(凱杰丹麥公司(QIAGEN Danmark),哥本哈根，丹麥)的修改的方案分離基因組DNA。通過在14，OOOx g下離心2分鐘收獲來自上面的培養(yǎng)物的真菌材料。除去上清液并且將球粒(0.5g)用石英砂在液氮中冷凍并且將其在預(yù)冷的研缽中研磨為細(xì)粉。將粉末轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，隨后添加5ml預(yù)熱至65°C的APl緩沖液(凱杰丹麥公司，哥本哈根，丹麥)和10 μ I的RNase A母液(100mg/ml),隨后進(jìn)行劇烈潤流。在用常規(guī)反相(regular inverting)的試管在65°C下孵育10分鐘后,通過溫和混合向裂解液中添加1.8ml的AP2緩沖液(凱杰丹麥公司，哥本哈根，丹麥)，隨后在冰上孵育10分鐘。然后將裂解液在室溫下、在3000xg下離心5分鐘，并且將上清液傾析進(jìn)放置于50ml收集管中的QIASHREDDER?大核酸純化柱(maxi spin column)(凱杰丹麥公司，哥本哈根，丹麥)中，隨后將其在室溫下、在3000xg下離心5分鐘。將貫流(flow-through)轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的50ml試管中并且添加1.5體積的AP3/E緩沖液(凱杰丹麥公司，哥本哈根，丹麥)，隨后進(jìn)行渦流。將十五毫升的樣品轉(zhuǎn)移至放置于50ml收集管中的DNEASY?大核酸純化柱中并且在室溫下、在3000xg下離心5分鐘。將貫流丟棄并且向放置于50ml收集管中的DNEASY?大核酸純化柱中添加12ml的AW緩沖液(凱杰丹麥公司，哥本哈根，丹麥)并且在室溫下、在3000xg下離心10分鐘。在丟棄貫流后，重復(fù)離心以處置剩余的醇。將DNEASY?大核酸純化柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的50ml試管中并且添加0.5ml預(yù)熱至70°C的AE緩沖液(凱杰丹麥公司，哥本哈根，丹麥)。在室溫下孵育5分鐘后，通過在室溫下、在3000xg下離心5分鐘對樣品進(jìn)行洗脫。通過另外0.5ml的AE緩沖液重復(fù)洗脫并且將洗脫物合并。通過在260nm下的UV測量收獲的DNA的濃度。
[0399]實(shí)例3:包含編碼具有木聚糖酶活性的家族GHlO多肽的膠囊青霉株系IBT4903基因組序列的米曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建
[0400]設(shè)計(jì)下面所示的兩種合成寡核苷酸引物來通過PCR擴(kuò)增來自在實(shí)例2中制備的基因組DNA的膠囊青霉株系IBT4903基因(P244K1)。使用IN-FUS10N?克隆試劑盒(克羅泰克實(shí)驗(yàn)有限公司(Clontech Laboratories, Inc.),山景,加州，美國)將該片段直接克隆進(jìn)表達(dá)載體 pDaul09 中(W02005/042735)。
[0401]引物F-P244K1: [0402]5，-ACACAACTGGGGATCCACC ATGGTGTTCCTATCTGCACGTAC GC
-3’ (SEQ ID NO:3)
[0403]引物R-P244K1:
[0404]5? -CCCTCTAGATCTCGAG GGCTATCTTCCCGTCAGACAGCT -3’ (SEQ IDNO: 4)
[0405]粗體字母代表基因序列。加下劃線的序列與pDaul09的插入位點(diǎn)是同源的。
[0406]使用PHUS?ΟΝ?高保真PCR 試劑盒(PHUSION? High-Fidelity PCR Kit)(飛酶公司(FINNZYMES Oy)，艾斯堡，芬蘭)用于擴(kuò)增。PCR反應(yīng)由5μ1的5X HF緩沖液(飛酶公司，艾斯堡，芬蘭)、0.5μ I的dNTPs(10mM)、0.5μ I的PHUSION? DNA聚合酶(0.2單位/μ I)(飛酶公司，艾斯堡，芬蘭)、1 μ I的引物？42441(1(51^)、1111的引物R-P244Kl(5yM)、0.5μ I的膠囊青霉基因組DNA (lOOng/μ I)、以及16.5 μ I的去離子水組成，總體積為25μ1。使用PTC-200DNA引擎(MJ研究公司(MJ Research Inc.)，南舊金山，加州，美國)進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)镮個(gè)循環(huán)，在95°C下持續(xù)2分鐘；35個(gè)循環(huán)，各自為在98°C下持續(xù)10秒鐘，在60°C下持續(xù)30秒鐘，并且在72°C下持續(xù)2.5分鐘；以及I個(gè)循環(huán)，在72°C下持續(xù)10分鐘。然后將樣品保持在12°C，直至從PCR儀中移出。[0407]使用40mM Tris堿、20mM乙酸鈉、ImM EDTA 二鈉(TAE)緩沖液，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，其中從凝膠切下1513bp產(chǎn)物帶，并且根據(jù)廠商說明書，使用ILLUSTRA? GFX? PCR DNA和凝膠帶純化試劑盒(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(GEHealthcare Life Sciences)，布隆德比，丹麥)進(jìn)行純化。然后使用IN-FUS10N?克隆試劑盒，將片段克隆到Bam HI和Xho I消化的pDaul09中，生成質(zhì)粒ρΡ244Κ1。將Ρ244Κ1基因克隆進(jìn)Bam H1-Xho I消化的pDaul09中導(dǎo)致膠囊青霉P244K1基因在NA2_tpi雙啟動子的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。NA2_tpi啟動子是來自編碼黑曲霉中性α-淀粉酶的基因的修飾的啟動子，其中已經(jīng)用來自編碼構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的未翻譯的前導(dǎo)子替換了未翻譯的前導(dǎo)子。
[0408] 根據(jù)產(chǎn)生P244K1GH10構(gòu)建體的IN-FUS10N?克隆試劑盒的說明書進(jìn)行克隆方案。根據(jù)廠商的方案將處理的質(zhì)粒和插入片段轉(zhuǎn)化進(jìn)ONE SHOT? TOPlOF'化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(英杰公司(Invitrogen),卡爾斯巴德,加州，美國)中，并且將其涂板在補(bǔ)充有
0.1mg的氨比西林/ml的LB板上。在37°C下孵育過夜后，觀察到菌落在LB氨比西林板上選擇下生長。將用P244K1GH10構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的四個(gè)菌落在補(bǔ)充有0.1mg的氨比西林/ml的LB培
養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并且根據(jù)廠商的方案，使用QIAPREP?質(zhì)粒小提試劑盒(Spin Miniprep
Kit)(凱杰公司(QIAGEN Inc.)，巴倫西亞，加州，美國)分離質(zhì)粒。
[0409]用載體引物和P244K1基因特異性引物對分離的質(zhì)粒進(jìn)行測序以便確定不含PCR錯(cuò)誤的代表性質(zhì)粒表達(dá)克隆。
[0410]實(shí)例4:編碼具有木聚糖酶活性的P244K1GH10多肽的膠囊青霉IBT4903基因組序列的表征
[0411]用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3700型全自動DNA測序儀(Applied BiosystemsModel3700Automated DNA Sequencer)，使用版本3.1BIG-DYE?終止子化學(xué)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems, Inc.),福斯特城,加州，美國)和引物步移策略進(jìn)行膠囊青霉IBT4903P244K1GH10基因組克隆的DNA測序。仔細(xì)檢查核苷酸序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量，并且借助PHRED/PHRAP軟件(華盛頓大學(xué)，西雅圖，華盛頓州，美國)將所有序列互相比較。
[0412]膠囊青霉P244K1GH10木聚糖酶編碼序列的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2中。編碼序列是1438bp，包括被70bp (核苷酸57至126)、57bp (核苷酸 284 至 340)、53bp (核苷酸 474 至 526)、以及 55bp (核苷酸 641 至 695)四個(gè)內(nèi)含子中斷的終止密碼子。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)是400個(gè)氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen(尼爾森)等人，1997,Protein Engineering(《蛋白質(zhì)工程》)10:1-6)預(yù)測出22個(gè)殘基的信號肽。預(yù)測的成熟蛋白包含378個(gè)氨基酸，預(yù)測的分子量為40.3kDa并且等電點(diǎn)為4.54。
[0413]使用尼德曼和翁施算法(尼德曼和翁施，1970,《分子生物學(xué)雜志》.48:443-453)確定氨基酸序列的比較性成對地總體比對，使用空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5以及EBL0SUM62矩陣。比對顯示編碼GHlO木聚糖酶(成熟多肽)的膠囊青霉基因組DNA的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自青霉屬(GENESEQP AYB51189)的GHlO木聚糖酶的推導(dǎo)的氨基酸序列具有79.6%的序列一致性(排除空位)。
[0414]實(shí)例5:膠囊青霉GHlO木聚糖酶P244K1的表達(dá)[0415]用質(zhì)粒ρΡ244Κ1轉(zhuǎn)化根據(jù)歐洲專利EP0238023，第14_15頁的方法制備的米曲霉MT3568原生質(zhì)體。
[0416]在使轉(zhuǎn)化體在PDA板上形成孢子之前，在COVE蔗糖選擇板上通過單個(gè)的分生孢子純化轉(zhuǎn)化體。在30°C下，在YP+2%葡萄糖培養(yǎng)基中，分析來自Iml的96深孔固定培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的膠囊青霉GHlO木聚糖酶。在E-Page8% SDS-PAGE48孔凝膠((英杰公司，卡爾斯巴德，加州，美國)上通過考馬斯亮藍(lán)染色確認(rèn)表達(dá)。選擇一個(gè)轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一步的工作并且將其指定為米曲霉34.1。
[0417]用于較大規(guī)模的生產(chǎn)，將米曲霉34.1孢子分散到PDA板上并且在37°C下孵育5天。用5ml的0.01%TWEEN? 20將融合的孢子板洗滌兩次，以使收集的孢子的數(shù)目最大化。然后使用孢子懸浮液接種包含100mL的Dap-4C培養(yǎng)基的二十五個(gè)500ml燒瓶。將培養(yǎng)株在30°C下進(jìn)行孵育，同時(shí)以IOOrpm進(jìn)行恒定振蕩。在接種后第四天，通過經(jīng)由MF75 SUPOR? MachV0.2 μ m PES 瓶頂過濾器(bottle top MF75 SUPOR? MachV0.2 μ mPES filter)(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific),羅斯基勒,丹麥)過濾收集每種培養(yǎng)液。米曲霉34.1的培養(yǎng)液產(chǎn)生大約52kDa的一個(gè)帶，如使用E_Page8% SDS-PAGE48孔凝膠通過SDS-PAGE所確定的。通過肽測序證實(shí)這個(gè)帶與膠囊青霉GHlO多肽的一致性。
[0418]實(shí)例6:用于生產(chǎn)膠囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)的替代性方法
[0419]基于被鑒定為SEQ ID NO:1的核苷酸序列，可以從多個(gè)銷售商，例如基因藝術(shù)公司(Gene Art)(基因藝術(shù)公司生物園(GENEART公司BioPark)，約瑟夫-恩格特街11號(Josef-Engert-Str.11)，93053，雷根斯堡，德國)或 DNA2.0 公司(DNA2.0，1430 奧布賴恩大道(14300’Brien Drive)，套房E，門洛帕克，加州94025，美國)獲得合成基因。合成基因可以被設(shè)計(jì)成結(jié)合另外 的DNA序列，例如限制酶切位點(diǎn)或同源重組區(qū)，以協(xié)助克隆到表達(dá)載體中。
[0420]使用上面描述的兩種合成寡核苷酸引物F-P244K1和F-P244K1，可以使用一個(gè)簡單的PCR反應(yīng)來擴(kuò)增來自SEQ ID NO:1的合成基因的全長開放讀碼框。然后可以將該基因克隆進(jìn)表達(dá)載體(如在此描述的)中，并且在宿主細(xì)胞(如在此描述的)，例如米曲霉中進(jìn)行表達(dá)。
[0421]實(shí)例7:膠囊青霉GHlO木聚糖酶P244K1的純化
[0422]將1000ml體積的過濾的米曲霉34.1液(實(shí)例5)調(diào)節(jié)至pH7.0并且使用0.22 μ mPES過濾器(賽默飛世爾科技，羅斯基勒，丹麥)進(jìn)行過濾。以1.SM的濃度向?yàn)V液中添加硫酸銨。將濾液裝載在60ml用1.8M硫酸銨(pH7.0)平衡的苯基SEPHAR0SE?6快流柱(Phenyl SEPHAR0SE?6Fast Flow column)(高載量(high sub))(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GEHealthcare)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)上。在施加之后，用3柱體積的平衡緩沖液、隨后是7柱體積的0.9M硫酸銨以15ml/分鐘的流速洗滌該柱(蛋白質(zhì)與該柱保持結(jié)合)。用5柱體積的50mM HEPES (pH7.0)以15ml/分鐘的流速洗脫GHlO木聚糖酶。收集IOml的部分并且通過SDS-PAGE進(jìn)行分析(實(shí)例5)。將這些部分合并并且將其施加至在25mMHEPES(pH7.0)中平衡的SEPHADEX?G-25 (中(medium))柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)上。收集、合并這些部分，并且將其施加至60ml在50mM HEPES (pH7.0)中平衡的SOURCEtmI5Q柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)上。施加之后，用5柱體積的平衡緩沖液洗滌該柱并且用超過20柱體積從O-1OOOmM的線性梯度氯化鈉洗脫結(jié)合的GHlO木聚糖酶。收集IOml的部分并且通過SDS-PAGE進(jìn)行分析(實(shí)例5)，并且將具有GHlO木聚糖酶的部分合并，至終體積為90ml。通過A28(l/A26(l吸光度確定蛋白濃度。
[0423]實(shí)例8:預(yù)處理的玉米芯水解測定
[0424]在120°C下，以15%總干重固體(TS)用Na0H(0.08g/g干重芯)將玉米芯預(yù)處理60分鐘。用水洗滌所得材料，直到它為pH8.2，從而形成經(jīng)洗滌的堿性預(yù)處理的玉米芯(APCC)。通過添加6M HCl將APCC的pH調(diào)節(jié)至5.0并且用水進(jìn)行廣泛混合，在CosmosICMG40 濕多效用研磨機(jī)(Cosmos ICMG40wet mult1-utility grinder) (EssEmm 公司，泰米爾納德邦，印度)中碾磨APCC，并且在121°C下高壓滅菌45分鐘來制備研磨過篩的堿性預(yù)處理的玉米芯(GS-APCC)，最終的TS為3.33%。使用2.2ml深孔板(愛思進(jìn)公司(Axygen)，聯(lián)合市(Union City)，加州，美國)在1.0的總反應(yīng)體積中水解GS-APCC。
[0425]用IOmg的GS-APCC總固體/ml的50mM包含ImM硫酸錳以及不同酶組合物的乙酸鈉(PH5.0)進(jìn)行水解(表示為mg蛋白質(zhì)/克的纖維素)。制備酶組合物并且然后將其以從50μ I至200μ I的范圍的體積同時(shí)添加至所有的孔中，在每個(gè)反應(yīng)中的終體積為1ml。然后使用 ALPS-300?板式熱封機(jī)(ALPS-300?plate heat sealer)(阿博基因公司(Abgene),埃普索姆，英國)將板密封，充分混合，并且在特定溫度下孵育72小時(shí)。一式三份地重復(fù)所有報(bào)道的實(shí)驗(yàn)。
[0426]水解后，使用0.45 μ m MULTISCREEN? 96 孔過濾板(MULTISCREEN?
96-well filter plate)(密理博公司(Millipore),貝德福德，馬薩諸塞州，美國)過濾樣品并且如下所述的分 析濾液的含糖量。當(dāng)不立即使用時(shí)，將過濾的等分部分冷凍于-20°C下。使用在65°C下，用0.05% w/w苯甲酸-0.005M H2SO4以0.6ml/分鐘的流速洗脫的4.6x250mm AMINEX? HPX-87H柱(伯樂實(shí)驗(yàn)室公司，赫拉克勒斯，加州，美國)測量稀釋于0.005M H2SO4中的樣品的糖濃度，并且通過整合來自由純糖樣品校準(zhǔn)的屈光指數(shù)檢測(CHEMSTATION_?, AGILENT? 1100HPLC，安捷倫科技公司(AgilentTechnologies)，圣克拉拉，加州，美國)的葡萄糖、纖維二糖、以及木糖的信號進(jìn)行定量。使用所得的葡萄糖等效物計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的纖維素轉(zhuǎn)化的百分比。使用所得的木糖等效物計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的低聚木糖轉(zhuǎn)化的百分比。
[0427]單獨(dú)地測量葡萄糖、纖維二糖、以及木糖。對于適當(dāng)?shù)南♂屢蜃?，調(diào)節(jié)測量的糖濃度。使用軟件MICROSOFT EXCEL?軟件(微軟公司，里奇蘭，華盛頓州，美國)處理所有的HPLC數(shù)據(jù)。
[0428]使用以下等式計(jì)算纖維素向葡萄糖的轉(zhuǎn)化程度:％葡萄糖轉(zhuǎn)化=(葡萄糖濃度/限制消化中的葡萄糖濃度)X 100。為了計(jì)算％轉(zhuǎn)化，基于纖維素酶對照(50-100mg的里氏木霉纖維素酶/克纖維素)設(shè)定100%轉(zhuǎn)化點(diǎn)，并且將所有的值除以該數(shù)并且然后乘以100。取三份數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值并且計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。
[0429]使用以下等式計(jì)算低聚木糖向木糖的轉(zhuǎn)化程度:％木糖轉(zhuǎn)化=(木糖濃度/限制消化中的木糖濃度)X 100。為了計(jì)算％轉(zhuǎn)化，基于纖維素酶對照(補(bǔ)充有煙曲霉木聚糖酶(xyl3 ；W02006/078256)和埃默森籃狀菌β -木糖苷酶[參見實(shí)例9]的50_100mg的里氏木霉纖維素酶/克纖維素)設(shè)定100%轉(zhuǎn)化點(diǎn)，并且將所有的值除以該數(shù)并且然后乘以100。取三份數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值并且計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。[0430]實(shí)例9:酶組合物的制備
[0431]煙曲霉纖維二糖水解酶I的制備。如在W02011/057140中所描述，在米曲霉中重組地制備煙曲霉GH7A纖維二糖水解酶I (SEQ ID NO: 5[DNA序列]以及SEQ ID NO:6[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將煙曲霉GH7A纖維二糖水解酶I液過濾、濃縮并且使用配備有IOkDa聚醚砜膜(頗爾濾清器公司(Pall Filtron)，諾斯伯勒，馬薩諸塞州，美國)的切向流濃縮器(頗爾濾清器公司，諾斯伯勒，馬薩諸塞州，美國)、與20mM Tris-HCl (pH8.0)進(jìn)行緩沖液交換。使用在20mM Tris-HCl (pH8)中平衡的Q SEPHAROSE?柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)純化煙曲霉GH7A纖維二糖水解酶I的脫鹽液。使用O至IM的線性梯度NaCl洗脫該蛋白質(zhì)。收集部分并且使用8-16%CRITERION?'無染色(Stain-free)
SDS-PAGE (伯樂實(shí)驗(yàn)室公司，赫拉克勒斯，加州，美國)、基于SDS-PAGE合并包含纖維二糖水解酶I的部分。
[0432]煙曲霉纖維二糖水解酶II的制備。如在W02011/057140中所描述，在米曲霉中重組地制備煙曲霉GH6A纖維二糖水解酶II (SEQ ID NO:7[DNA序列]以及SEQ ID N0:8[推導(dǎo)的氨基酸序列])。根據(jù)廠商的說明書，將煙曲霉GH6A纖維二糖水解酶II的過濾液過濾并且使用400ml SEPHADEX?G-25柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，英國)緩沖液交換進(jìn)20mMTris (pH8.0)中。將這些部分合并并且調(diào)節(jié)至1.2M硫酸銨_20mM Tris (pH8.0)。將纖維二糖水解酶II裝載在用1.2M硫酸銨在20mM Tris (pH8.0)中平衡的苯基SEPHAR0SE?6快流柱(高載量)(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)上，并且用不具有硫酸銨的20mM Tris (pH8 .0)洗脫。將這些部分合并。
[0433]具有增強(qiáng)纖維素分解活性的青霉屬(埃默森(emerSonii))GH61A多肽的制備。根據(jù)TO2011/041397重組地制備并純化青霉屬(埃默森)GH61A多肽(SEQ ID N0:9[DNA序列]以及SEQ ID NO: 10[推導(dǎo)的氨基酸序列])。
[0434]里氏木霉GH5內(nèi)切葡聚糖酶II的制備。根據(jù)W02011/057140重組地制備里氏木霉GH5內(nèi)切葡聚糖酶II (SEQ ID NO: 11 [DNA序列]以及SEQ ID NO: 12 [推導(dǎo)的氨基酸序列])。將里氏木霉GH5內(nèi)切葡聚糖酶II液過濾、脫鹽并且使用配備有IOkDa聚醚砜膜的切向流濃縮器緩沖液交換進(jìn)20mM Tris (pH8.0)中。
[0435]煙曲霉6Η3Αβ-葡糖苷酶的制備。根據(jù)W02005/047499，將米曲霉用作宿主，重組地制備(U569)(SEQ ID N0:13[DNA序列]以及SEQ ID NO: 14[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將該液過濾并且用20%乙酸鈉調(diào)節(jié)至pH8.0，這使得該溶液混濁。為了除去混濁，將該溶液在20000x g下離心20分鐘，并且通過0.2 μ m過濾單位(耐潔公司(Nalgene),羅切斯特，紐約，美國)過濾上清液。用去離子水稀釋該濾液，以達(dá)到與50mM Tris/HCl(pH8.0)相同的
傳導(dǎo)性。將調(diào)節(jié)過的酶溶液施加至在50mM Tris-HCl (pH8.0)中平衡的Q SEPHAROSE?-
快流柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)上并且使用O至500mM的線性梯度氯化鈉進(jìn)行洗脫。將部分合并并且用1% (w/v)活性炭進(jìn)行處理，以除去β_葡糖苷酶池(pool)的顏色。通過將懸浮液經(jīng)由0.2μπι過濾單位(耐潔公司，羅切斯特，紐約，美國)過濾除去炭。用20%乙酸將濾液調(diào)節(jié)至ρΗ5.0并且用去離子水稀釋10倍。將調(diào)節(jié)的濾液施加至在IOmM琥珀酸(ρΗ5.0)中平衡的SP SEPHAROSE?<快流柱(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國)上并且使用O至500mM的線性梯度氯化鈉洗脫β-葡糖苷酶。
[0436]埃默森籃狀菌6Η3β-木糖苷酶的制備。如在W02011/057140中所描述，在米曲霉中重組地制備埃默森籃狀菌GH3 0-木糖苷酶(SEQ ID N0:15[DNA序列]以及SEQ IDNO: 16 [推導(dǎo)的氨基酸序列])。將埃默森籃狀菌GH3 β -木糖苷酶脫鹽并且使用配備有IOkDa聚醚砜膜的切向流濃縮器緩沖液交換進(jìn)50mM乙酸鈉(pH5.0)中。
[0437]使用微板BCA?蛋白測定試劑盒(Microplate BCA?Protein Assay Kit)(賽默飛世爾科技(Thermo Fischer Scientific),沃爾瑟姆(Waltham),馬薩諸塞州，美國)確定上述每種單組分的蛋白濃度，在該試劑盒中將牛血清白蛋白用作蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。將如上述制備的每種單組分合并，以產(chǎn)生由以下各項(xiàng)組成的酶組合物:37%煙曲霉Cel7A纖維二糖水解酶1、25%煙曲霉Cel6A纖維二糖水解酶I1、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的15%埃默森青霉(Penicillium emersonii)GH61A多肽、10%里氏木霉GH5內(nèi)切葡聚糖酶11、5%木聚糖酶、5%煙曲霉β-葡糖苷酶、以及3%埃默森籃狀菌β-木糖苷酶。在此將該酶組合物指定為“不具有木聚糖酶的酶組合物”。
[0438]實(shí)例10:膠囊青霉GHlO木聚糖酶(Ρ244Κ1)對在50_60°C下由酶組合物水解GS-APCC的作用
[0439]在50°C、55°C、以及60°C下評估膠囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)對使用不具有木聚糖酶的酶組合 物(實(shí)例9)水解GS-APCC的作用。將不具有木聚糖酶的酶組合物用作對照。將具有膠囊青霉GHlO木聚糖酶的酶組合物以1.425mg總蛋白/g纖維素添加至GS-APCC水解反應(yīng)中，而將不具有木聚糖酶的酶組合物以1.5mg總蛋白/g纖維素添加至GS-APCC水解反應(yīng)中。
[0440]如在實(shí)施例8中所描述進(jìn)行該測定。將與GS_APCC(1%總固體)的Iml反應(yīng)在包含ImM硫酸錳的50mM乙酸鈉(pH5.0)中進(jìn)行72小時(shí)。所有反應(yīng)一式三份地進(jìn)行并且在水解開始時(shí)涉及單個(gè)的混合。
[0441]如在圖1中所示，在50°C、55°C、以及60°C下，與不具有木聚糖酶的酶組合物相比，包括膠囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)的酶組合物在1.425和1.5mg總蛋白/克纖維素下顯著地增加纖維素水解為葡萄糖(因?yàn)槟z囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的程度高于不具有木聚糖酶的酶組合物)。
[0442]如在圖2中所示，在50°C、55°C、以及60°C下，與不具有木聚糖酶的酶組合物相比，包括膠囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)的酶組合物在1.425和1.5mg總蛋白/克纖維素下顯著地增加低聚木糖水解為木糖(因?yàn)槟z囊青霉GHlO木聚糖酶(P244K1)將低聚木糖轉(zhuǎn)化為木糖的程度高于不具有木聚糖酶的酶組合物)。
[0443]本發(fā)明進(jìn)一步通過以下編號的段落進(jìn)行說明。
[0444][I] 一種具有木聚糖酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:(a)與SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽；(b)由在至少高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(?)的全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一種多肽；(c)由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；(d)在一個(gè)或多個(gè)(例如若干個(gè))位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體；以及(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(C)、或(d)的多肽的一個(gè)片段。[0445][2]如段落I所述的多肽，該多肽與SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0446][3]如段落I所述的多肽，該多肽由在高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)⑴或(ii)的全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼。 [0447][4]如段落I所述的多肽，該多肽由以下多核苷酸編碼，該多核苷酸與SEQ IDNO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%、至少81 %、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0448][5]如段落1-4中任一項(xiàng)所述的多肽，該多肽包括SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:2的成熟多肽或由其組成。
[0449][6]如段落5所述的多肽，其中該成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸23至400。
[0450][7]如段落I所述的多肽，該多肽是在一個(gè)或多個(gè)位置處包含一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2的成熟多肽的變體。
[0451][8]如段落I所述的多肽，該多肽是SEQ ID NO:2的一個(gè)片段，其中該片段具有木聚糖酶活性。
[0452][9] 一種包括一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，該催化結(jié)構(gòu)域選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:(a)與SEQ ID NO: 2的氨基酸23至342具有至少80%序列一致性的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；(b)由在至少非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列；或其全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；(c)由與SEQ ID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域；(d)在一個(gè)或多個(gè)位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO: 2的氨基酸23至342的變體；以及(e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片段。
[0453][10]如段落9所述的多肽，該多肽進(jìn)一步包括一個(gè)碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0454][11] 一種包括可操作地連接至一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:(a)與SEQ ID N0:2的氨基酸366至400具有至少80%序列一致性的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(b)由在至少非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435或其全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(c)由與SEQ ID NO:1的核苷酸1331至1435具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(d)在一個(gè)或多個(gè)位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQ ID NO:2的氨基酸366至400的變體；以及(e)具有碳水化合物結(jié)合活性的(a)、(b)、(C)、或(d)的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片段。
[0455][12]如段落11所述的多肽，其中該催化結(jié)構(gòu)域獲得自水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶或轉(zhuǎn)移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。
[0456][13] 一種組合物，該組合物包括如段落1-12中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0457][14] 一種分離的多核苷酸,該多核苷酸編碼如段落1-12中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0458][15] 一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體,該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括如段落14所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)多肽在一個(gè)表達(dá)宿主內(nèi)產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0459][16] 一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括如段落14所述的多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)控制序列。
[0460][17] 一種產(chǎn)生如段落1-12中任一項(xiàng)所述的多肽的方法，該方法包括:在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞處于其野生型形式時(shí)產(chǎn)生該多肽。
[0461][18]如段落17所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該多肽。
[0462][19] 一種產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，該方法包括:在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如段落16所述的宿主細(xì)胞。 [0463][20]如段落19所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該多肽。
[0464][21]用編碼如段落1-12中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
[0465][22] 一種產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，該方法包括:在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如段落21所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。
[0466][23]如段落22所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該多肽。
[0467][24] 一種產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，該方法包括使編碼如段落1-12中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸失活，這導(dǎo)致突變體比該親本細(xì)胞產(chǎn)生的多肽少。
[0468][25] 一種通過如段落24所述的方法產(chǎn)生的突變體細(xì)胞。
[0469][26]如段落25所述的突變體細(xì)胞，該突變體細(xì)胞進(jìn)一步包括一個(gè)編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。
[0470][27] 一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括:在有益于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)如段落25或26所述的突變體細(xì)胞。
[0471][28]如段落27所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該蛋白質(zhì)。
[0472][29] 一種包括如段落14所述的多核苷酸的子序列的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中可任選地，該dsRNA是一個(gè)siRNA或miRNA分子。
[0473][30]如段落29所述的雙鏈抑制性RNA (dsRNA)分子，該分子長約15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)或更多個(gè)雙核苷酸。
[0474][31] 一種抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中的表達(dá)的方法，該方法包括向該細(xì)胞給予或在該細(xì)胞中表達(dá)如段落29或30所述的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子。
[0475][32] 一種通過如段落31所述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
[0476][33]如段落32所述的細(xì)胞，該細(xì)胞進(jìn)一步包括一個(gè)編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。
[0477][34] 一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括:在有益于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)如段落32或33所述的細(xì)胞。
[0478][35]如段落34所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該蛋白質(zhì)。
[0479][36] —種編碼信號肽的分離的多核苷酸,該信號肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸I至22或由其組成。
[0480][37] 一種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體,該核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包括一個(gè)編碼可操作地連接至如段落36所述的多核苷酸的蛋白質(zhì)的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸來說是異源的。
[0481][38] 一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括一個(gè)編碼可操作地連接至如段落36所述的多核苷酸的蛋白質(zhì)的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸來說是異源的。
[0482][39] 一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括:在有益于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括一個(gè)編碼可操作地連接至如段落36所述的多核苷酸的蛋白質(zhì)的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸來說是異源的。
[0483][40]如段落39所述的方法，該方法進(jìn)一步包括回收該蛋白質(zhì)。
[0484][41] 一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或包含木聚糖的材料的工藝，該工藝包括:在如段落1-12中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料或包含木聚糖的材料。 [0485][42]如段落41所述的工藝，其中對該纖維素材料或包含木聚糖的材料進(jìn)行預(yù)處理。
[0486][43]如段落41或42所述的工藝，其中該酶組合物包括一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:纖維素酶、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽、半纖維素酶、酯酶、擴(kuò)張蛋白、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素。
[0487][44]如段落43所述的工藝，其中該纖維素酶是一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二塘水解酶、以及葡糖苷酶。
[0488][45]如段落43所述的工藝，其中該半纖維素酶是一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
[0489][46]如段落41-45中任一項(xiàng)所述的工藝，該工藝進(jìn)一步包括回收降解的纖維素材料或包含木聚糖酶的材料。
[0490][47]如段落46所述的工藝，其中該降解的纖維素材料或包含木聚糖的材料是一種糖。
[0491][48]如段落47所述的工藝，其中該糖選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、以及阿拉伯糖。
[0492][49] 一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，該工藝包括:(a)在如段落1_12中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物糖化纖維素材料或包含木聚糖的材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵糖化的纖維素材料或包含木聚糖的材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且(C)從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0493][50]如段落49所述的工藝，其中對該纖維素材料或包含木聚糖的材料進(jìn)行預(yù)處理。[0494][51]如段落49或50所述的工藝，其中該酶組合物包括選自下組的一種或多種酶，該組由以下各項(xiàng)組成:纖維素酶、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽、半纖維素酶、酯酶、擴(kuò)張蛋白、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素。
[0495][52]如段落51所述的工藝，其中該纖維素酶是一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二塘水解酶、以及葡糖苷酶。
[0496][53]如段落51所述的工藝，其中該半纖維素酶是一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
[0497][54]如段落49-53中任一項(xiàng)所述的工藝，其中在同時(shí)的糖化和發(fā)酵中同時(shí)進(jìn)行步驟(a)和(b)。
[0498][55]如段落49-54中任一項(xiàng)所述的工藝，其中該發(fā)酵產(chǎn)物是一種醇、鏈烷烴、環(huán)烷烴、鏈烯烴、氨基酸、氣體、異戊二烯、酮、有機(jī)酸、或聚酮化合物。
[0499][56] 一種發(fā)酵纖維素材料或包含木聚糖的材料的方法，該方法包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料，其中該纖維素材料或包含木聚糖的材料在如段落1-12中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一種酶組合物糖化。
[0500][57]如段落56所述的工藝，其中發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料產(chǎn)生一種發(fā)酵產(chǎn)物。
[0501][58]如段落57所述的工藝，該工藝進(jìn)一步包括從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
[0502][59]如段落57或58所述的工藝，其中該發(fā)酵產(chǎn)物是一種醇、鏈烷烴、環(huán)烷烴、鏈烯烴、氨基酸、氣體、異戊二烯、酮、有機(jī)酸、或聚酮化合物。
[0503][60]如段落56-59中任一項(xiàng)所述的工藝,其中在糖化之前,對該纖維素材料或包含木聚糖的材料進(jìn)行預(yù)處理。
[0504][61]如段落56-60中任一項(xiàng)所述的工藝，其中該酶組合物包括一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:纖維素酶、具有增強(qiáng)纖維素分解活性的多肽、半纖維素酶、酯酶、擴(kuò)張蛋白、漆酶、木質(zhì)素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、以及膨脹素。
[0505][62]如段落61所述的工藝，其中該纖維素酶是一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二塘水解酶、以及葡糖苷酶。
[0506][63]如段落61所述的工藝，其中該半纖維素酶是一種或多種選自下組的酶，該組由以下各項(xiàng)組成:木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
[0507][64] 一種全發(fā)酵液配制品或細(xì)胞培養(yǎng)組合物，包括如段落1-12中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0508]在此描述并且要求的本發(fā)明不限于在此披露的具體方面的范圍，因?yàn)檫@些方面意圖作為本發(fā)明若干方面的說明。預(yù)期任何等效方面都處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除在此所示和描述的那些之外，本發(fā)明的不同修改對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說從前述描述將變得清楚。這類修改也旨在落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包括定義的本披露為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種具有木聚糖酶活性的分離的多肽，該多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成: (a)與SEQID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一種多肽； (b)由在至少高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)SEQID NO:1的成熟多肽編碼序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一種多肽； (c)由與SEQ ID NO:1的成熟多肽編碼序列或其cDNA序列具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽； (d)在一個(gè)或多個(gè)(例如，幾個(gè))位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQIDNO: 2的成熟多肽的變體；以及 (e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(C)、或(d)的多肽的一個(gè)片段。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，該多肽包括SEQID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其組成。
3.一種包括一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，該催化結(jié)構(gòu)域選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:(a)與SEQID NO:2的氨基酸23至342具有至少80%序列一致性的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域； (b)由在至少非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列；或其全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域； (c)由與SEQID NO:1的核苷酸67至1261或其cDNA序列具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域； (d)在一個(gè)或多個(gè)位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQID NO:2的氨基酸23至342的變體；以及 (e)具有木聚糖酶活性的(a)、(b)、(C)、或(d)的催化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片段。
4.一種包括可操作地連接至一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分離的多肽，其中該結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成: (a)與SEQID NO:2的氨基酸366至400具有至少80%序列一致性的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (b)由在至少非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQID NO:1的核苷酸1331至1435或其全長互補(bǔ)體雜交的一種多核苷酸編碼的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (c)由與SEQID NO:1的核苷酸1331至1435具有至少80%序列一致性的一種多核苷酸編碼的一個(gè)碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域； (d)在一個(gè)或多個(gè)位置處包括一個(gè)取代、缺失、和/或插入的SEQID NO:2的氨基酸366至400的變體；以及 (e)具有碳水化合物結(jié)合活性的(a)、(b)、(c)、或(d)的碳水化物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)片段。
5.—種分離的多核苷酸,該多核苷酸編碼如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽。
6.—種產(chǎn)生如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽的方法,該方法包括: (a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)一種細(xì)胞，該細(xì)胞處于其野生型形式時(shí)產(chǎn)生該多肽；并且可任選地， (b)回收該多肽。
7.—種產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，該方法包括:(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列的如權(quán)利要求5所述的多核苷酸,該一個(gè)或多個(gè)控制序列指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生；并且可任選地， (b)回收該多肽。
8.用編碼如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞。
9.一種產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法，該方法包括: (a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；并且可任選地， (b)回收該多肽。
10.一種產(chǎn)生親本細(xì)胞的突變體的方法，該方法包括使編碼如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸失活，這導(dǎo)致該突變體比該親本細(xì)胞產(chǎn)生的多肽少。
11.一種編碼信號肽的分離的多核苷酸，該信號肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸I至22或由其組成。
12.—種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，該方法包括: (a)在有益于產(chǎn)生該 蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)一種重組宿主細(xì)胞，該重組宿主細(xì)胞包括一個(gè)編碼可操作地連接至如權(quán)利要求11所述的多核苷酸的蛋白質(zhì)的基因，其中該基因?qū)τ诰幋a該信號肽的多核苷酸來說是異源的；并且可任選地， (b)回收該蛋白質(zhì)。
13.一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料或包含木聚糖的材料的工藝，該工藝包括:在如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物處理該纖維素材料或包含木聚糖的材料。
14.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，該工藝包括: (a)在如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下，用一種酶組合物糖化一種纖維素材料或包含木聚糖的材料； (b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵該糖化的纖維素材料或包含木聚糖的材料，以產(chǎn)生該發(fā)酵產(chǎn)物；并且 (C)從發(fā)酵中回收該發(fā)酵產(chǎn)物。
15.一種發(fā)酵纖維素材料或包含木聚糖的材料的工藝，該工藝包括:用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵該纖維素材料或包含木聚糖的材料，其中該纖維素材料或包含木聚糖的材料在如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽的存在下被一種酶組合物糖化。
16.一種全發(fā)酵液配制品或細(xì)胞培養(yǎng)組合物，包括如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽。
【文檔編號】C12N15/82GK103958675SQ201280059072
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月19日
【發(fā)明者】N.斯波德斯伯格, T.沙加西 申請人:諾維信公司, 諾維信股份有限公司