G形夾用于改進的等位基因特異性pcr的用途
【專利摘要】本發(fā)明包括利用等位基因特異性寡核苷酸的等位基因特異性擴增方法，所述等位基因特異性寡核苷酸與靶序列的多于一種變體至少部分互補，但具有與靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸，并且摻入至少一個“G形夾”核苷酸。
【專利說明】G形夾用于改進的等位基因特異性PCR的用途
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及核酸擴增領域且具體地涉及等位基因特異性擴增領域。
[0002]發(fā)明背景
核酸的等位基因特異性擴增允許靶序列的同時擴散和分析。在懷疑靶核酸在其序列中具有一個或多個具有變異(多態(tài)性)的亞群時，通常使用等位基因特異性擴增。DNA多態(tài)性用于DNA概況分析(法醫(yī)取證、親權認定、用于器官移植的組織分型)、遺傳作圖以及罕見突變的檢測，所述罕見突變例如在具有正常DNA的細胞背景中的癌細胞中出現(xiàn)的那些。
[0003]在成功的等位基因特異性擴增中，靶核酸的所需變體被擴增，而其他變體則未被擴增，至少未擴增到可檢測水平。一般的等位基因特異性擴增測定涉及聚合酶鏈反應(PCR)，其中至少一條引物與具有可疑多態(tài)性的區(qū)域互補。等位基因特異性引物的設計使得引物延伸僅在存在多態(tài)性的某一變體時才發(fā)生。以其最簡單的形式，等位基因特異性引物具有與靶中的多態(tài)性核苷酸的所需變體互補的3’末端核苷酸。通常在引物3’末端處的單個錯配足以排除靶序列的不需要變體的擴增。然而，擴增的特異性在不同3’末端序列中變化極大:一些錯配有效阻斷通過聚合酶的延伸，而其他則不會，參見美國專利號5，639，611。
[0004]等位基因鑒別的成功取決于DNA聚合酶延伸錯配引物的無能性(inability)。DNA聚合酶的這種無能性可以通過調(diào)整反應條件來進行調(diào)節(jié)以達到最大選擇性。然而，對于許多多態(tài)性序列而言，等位基因特異性PCR低選擇性仍是個問題。
[0005]增加特異性的一種方法涉及改造具有一個或多個內(nèi)部錯配核苷酸的擴增引物。這種方法在一些系統(tǒng)中證明是成功的，參見美國專利5，137，806。
[0006]增加特異性的另一種方法涉及引物的化學修飾。例如，發(fā)現(xiàn)引物中的一些核苷酸的脫氧核糖的某些2’ -C和4’ -C修飾增強通過聚合酶的等位基因鑒別，參見Gaster，J.和Marx, A.(2005) Chem.Eur.J.11:1861-1870。在另一項研究中，發(fā)現(xiàn)等位基因鑒別通過在引物的核苷酸之一中使用非天然嘧啶堿基得到增強，特別是在嘧啶環(huán)的6位置中具有多個取代基的假異胞苷(pseudoisocytidine),參見美國專利號7，408, 051。
[0007]在實時等位 基因特異性PCR的背景下，測定的選擇性可以測量為匹配和錯配模板之間的閾值循環(huán)數(shù)目(Ct)中的差異。更大的差異指示錯配模板擴增中的更大延遲和因此等位基因之間的更大區(qū)別。經(jīng)修飾的脫氧核糖已顯示導致在1-14個循環(huán)的Ct差異。假異胞苷的使用導致錯配模板的擴增中7個循環(huán)的延遲。這種鑒別程度對于許多應用(其中樣品含有均競爭擴增的模板的幾種變體)而言是不足夠的。通常錯配模板以比匹配模板大得多的量存在。例如，在組織樣品中，僅小部分細胞可以是惡性的且攜帶由等位基因特異性擴增測定靶向的突變(“匹配模板”)。在正常細胞中存在的模板可能以更低的效率被擴增，但極大數(shù)目的正常細胞將克服擴增中的任何延遲且消除突變型模板的任何優(yōu)勢。為了在野生型模板的存在下檢測罕見突變，等位基因特異性擴增測定的特異性需要得到改進。
[0008]已提出了增強引物的等位基因特異性的許多方法。然而，對于許多臨床上相關的核酸靶，PCR特異性的缺乏仍是問題。因此，設計等位基因特異性引物的新方法是必需的。[0009]G形夾(G-clamp)是圖1中所示的三環(huán)氨基乙氧基-吩噁嗪-2’-脫氧胞苷，其是胞喃唳類似物。當摻入寡核苷酸內(nèi)時，G形夾同時識別螺旋內(nèi)的互補鳥嘌呤的Watson-Crick面和Hoogsteen面。因此，當與互補DNA和RNA鏈雜交時，含G形夾寡核苷酸充分增強螺旋熱穩(wěn)定性和錯配區(qū)別。這些增強的親和力和特異性的性質(zhì)在基于核酸的診斷學和通過反義方法的RNA序列特異性靶向領域中是有利的。G形夾和相關嘧啶衍生物的進一步特征公開于美國專利號6，414，127、美國專利號6，951，931、美國專利號7，511，125和美國專利號RE39, 324 中。
[0010]發(fā)明概述
在第一個方面，本發(fā)明涉及靶序列變體的等位基因特異性擴增的方法，該靶以幾種變體序列的形式存在，該方法包括(a)使第一和第二寡核苷酸與靶序列的至少一種變體雜交；其中第一寡核苷酸與靶序列的一種或多種變體至少部分互補，并且第二寡核苷酸與靶序列的一種或多種變體至少部分互補，并且具有與靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸；(b)用核酸聚合酶延伸第二寡核苷酸，其中當?shù)诙押塑账崤c和至少一個選擇性核苷酸互補的靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠有效延伸第二寡核苷酸，并且當?shù)诙押塑账崤c和至少一個選擇性核苷酸不互補的靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低。
[0011]在第二個方面，本發(fā)明涉及用于靶序列的等位基因特異性擴增的試劑盒，該靶以幾種變體序列的形式存在，該試劑盒包含:Ca)第一寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補JP(b)第二寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補，并具有與靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸。
[0012]在第三個方面，本發(fā)明涉及用于進行靶序列的等位基因特異性擴增的寡核苷酸，該靶以幾種變體序列的形式存在，該寡核苷酸包含:(a)與所述靶序列的一種或多種變體的部分至少部分互補的序列；(b)與靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；(C)至少一個“G形夾”核苷酸。
[0013]在第四個方面，本發(fā)明涉及用于靶序列的等位基因特異性擴增的反應混合物，該靶以幾種變體序列的形式存在，該混合物包含:Ca)第一寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補JP(b)第二寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補，但具有與靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸。
[0014]附圖簡述
圖1顯示了脫氧鳥嘌呤和脫氧胞苷之間(A)以及脫氧鳥嘌呤和G形夾之間(B)的氫鍵相互作用。
[0015]圖2 (A-C)顯示了野生型人EGFR基因(SEQ ID NO:1)的編碼序列。
[0016]發(fā)明詳述 定義
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。在描述和請求保護本發(fā)明中，將使用下述定義。
[0017]術語“核酸”指核苷酸(例如核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等)聚合物，并且包含脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA雜交物、寡核苷酸、多核苷酸、適體、肽核酸(PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等，其包含以線性(linear)或分支(branched)方式共價連接在一起的核苷酸。核酸一般是單鏈或雙鏈的，并且一般含有磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，包括可以具有替代骨架的核酸類似物，包括例如磷酰胺(Beaucage 等人(1993)Tetrahedron 49 (10): 1925);硫代憐酸酯(Mag 等人(1991 )NucleicAcids Res.19:1437 ;和美國專利號 5，644，048)、二硫代磷酸酯(Briu 等人(1989) J.Am.Chem.Soc.1ll: 2321 )、O-甲基亞憐酸胺連接(參見 Eckstein, Oligonucleotides andAnalogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992))、和妝核酸骨架和連接(參見Egholm (1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895)。其他類似物核酸包括具有帶正電荷骨架的類似物核酸(Denpcy 等人(1995) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92: 6097)；非離子骨架的類似物核酸(美國專利號5，386，023，5，637，684，5，602，240，5，216，141和4，469，863)和非核糖骨架的類似物核酸，包括在美國專利號5，235，033和5，034，506中描述的類似物核酸。含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義內(nèi)(參見Jenkins等人(1995)Chem.Soc.Rev.第 169-176 頁)，并且類似物還在例如 Rawls，C & E News Jun.2，1997，第35頁中描述。可以完成磷酸核糖骨架的這些修飾，以促進另外部分例如標記的添加，或改變此類分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。
[0018]除了一般在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基(例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外，核苷酸類似物也可以包括非天然存在的雜環(huán)堿基，例如在Seela等人(1999) Helv.Chim.Acta 82:1640中所述的那些。在核苷酸類似物中使用的某些堿基充當解鏈溫度(Tm)改性劑。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等)、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等，參見例如美國專利號5，990，303。其他代表性雜環(huán)堿基包括例如次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤；以下堿基的8-氮雜衍生物:2_氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；以下堿基的7-脫氮-8-氮雜衍生物:腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤；6_氮雜胞苷；5_氟胞苷；5_氯胞苷；5-碘胞苷；5_溴胞苷；5_甲基胞苷；5_丙炔基胞苷；5_溴乙烯基尿嘧啶；5_氟尿嘧啶；5_氯尿嘧啶；5_碘尿嘧啶；5_溴尿嘧 啶；5_三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5_丙炔基尿嘧啶等。
[0019]“核苷”指包含與糖部分(核糖或脫氧核糖)、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物(例如碳環(huán))共價連接的堿基或堿性基團(包含至少一個同素環(huán)、至少一個雜環(huán)、至少一個芳基，等等(and/or the like))的核酸組分。例如，當核苷包括糖部分時,堿基一般連接至該糖部分的I’-位置。如上所述，堿基可以是天然存在的堿基或非天然存在的堿基。示例性核苷包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、雙脫氧核糖核苷和碳環(huán)核苷。
[0020]“核苷酸”指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，其具有共價連接至核苷糖部分的5’位置的一個、兩個、三個或更多個磷酸基。
[0021]“嘌呤核苷酸”指包含嘌呤堿基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指包含嘧啶堿基的核苷酸。
[0022]“G形夾”核苷酸指胞嘧啶類似物，9-(氨基乙氧基)-吩噁嗪_2’ -脫氧胞苷，并且公開于US 6,414, 127中。[0023]“寡核苷酸”指包括至少兩個，但一般為5-50個核苷酸且更一般為15-35個核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的確切大小通常取決于多種因素，包括寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過本領域已知的任何合適方法進行制備，包括例如合適序列的克隆和限制性消化，或通過諸如下述方法的直接化學合成:Narang等人(1979) Meth.Enzymol.68:90-99 的憐酸三酯法；Brown 等人(1979) Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯法；Beaucage 等人(1981 )Tetrahedron Lett.22:1859-1862 的二乙基亞憐酸胺法；Matteucci等人(1981) J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191的三酯法；自動合成法；美國專利號4，458，066的固體載體法或本領域已知的任何其他化學方法。
[0024]“引物核酸”或“引物”是可以與模板核酸雜交且允許使用核苷酸摻入生物催化劑的鏈延伸或延長的寡核苷酸。盡管有時利用其他引物長度，但引物一般范圍為15-35個核苷酸。短引物核酸一般利用更冷的溫度，以與模板核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交復合物。與模板核酸的子序列至少部分互補的引物核酸一般足以與模板核酸雜交以發(fā)生延伸。然而，延伸的成功通常需要在引物的3’端處更大的互補性(即與模板的更少錯配)。需要時，引物核酸可以通過摻入標記進行標記，所述標記可通過放射學、光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學技術檢測。
[0025]“延伸的引物”指一個或多個另外的核苷酸已加入其中的引物?！耙镅由臁笔橇硗獾暮塑账嵬ㄟ^其加入引物中的酶的作用。
[0026]“模板核酸”、“模板”或“靶”指引物核酸在合適條件下可以與之雜交且延伸的核酸。在核酸擴增的背景下，“靶”優(yōu)選是雙鏈核酸的區(qū)域，由與至少兩條引物序列至少部分互補的序列及間插序列組成。靶還可以是單鏈核酸，由與一條引物至少部分互補的序列和與第二條引物部分相同的序列組成。模板核酸可以作為分離的核酸片段存在或可以是大核酸片段的部分。靶核酸可以衍生自或分離自基本上任何來源，例如培養(yǎng)的微生物、未培養(yǎng)的微生物、復雜的生物混合物、組織、血清、古老的或保存的組織或樣品、環(huán)境分離物等。進一步地，模板核酸任選包括或來源于cDNA、RNA、基因組DNA、克隆的基因組DNA、基因組DNA文庫、酶促斷裂的DNA或RNA、化學斷裂的DNA或RNA、物理斷裂的DNA或RNA等。模板核酸還可以使用本領域已知的技術化·學合成。
[0027]如本文使用的，“基因”指與生物功能相關的DNA的任何區(qū)段。因此，基因包括編碼序列并任選包括編碼序列表達所需的調(diào)節(jié)序列。
[0028]當另外的核苷酸例如通過核苷酸摻入生物催化劑在核酸的3’端處摻入核酸內(nèi)時，核酸被“延伸”或“延長”。
[0029]“部分”或“基團”指某些事物例如分子分裂成的部分之一(例如官能團、取代基等)。例如，核苷酸一般包含堿基基團(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或類似物)、糖部分、和一個或多個磷酸基。
[0030]“等位基因特異性引物”是這樣的引物，其可以與模板核酸的幾種變體雜交，但當與模板核酸的僅一些變體雜交時，則允許通過聚合酶的延長。對于模板核酸的其他變體，引物-模板雜交物可能不延伸或由聚合酶以更低效率延伸。
[0031]當另外的核苷酸例如通過核苷酸摻入生物催化劑在核酸的3’端處摻入核酸內(nèi)時，核酸被“延伸”或“延長”。
[0032]如果擴增測定獲得一種產(chǎn)物超過其他可能產(chǎn)物的優(yōu)勢(即大多數(shù)但小于100%)，則它是“選擇性的”或“等位基因選擇性的”。只要靶序列的不需要(錯配)變體的擴增是可檢測的，測定就描述為“等位基因選擇性的”。如果可能產(chǎn)物之一唯一形成，則使用關于擴增測定的術語“特異性的”或“等位基因特異性的”。將其中不需要的靶的擴增是無法檢測的測定稱為“等位基因特異性的”。然而，應當理解隨著檢測方法變得更靈敏，先前已知為等位基因特異性的一些測定變成等位基因選擇性的，即靶的不需要變體的一些擴增變得可檢測。因此，在本發(fā)明的背景下，術語“等位基因特異性的”意在包含嚴格地等位基因特異性的以及等位基因選擇性的擴增。
[0033]“基因型”指細胞或個體或者細胞或個體的組的全部或部分遺傳組成。例如，基因型包括存在于給定基因座上或分布在基因組中的特定突變和/或等位基因(例如多態(tài)性，例如單核苷酸多態(tài)性(SNP)等)。
[0034]“核酸聚合酶”指催化核苷酸摻入核酸內(nèi)的酶。示例性核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒末端轉(zhuǎn)移酶等。
[0035]“熱穩(wěn)定酶”指當將其置于高溫下所選的時間段時是穩(wěn)定的(即抵抗斷裂或變性)且保留足夠催化活性的酶。例如，當將其置于高溫下雙鏈核酸變性所需的時間時，熱穩(wěn)定聚合酶保留實現(xiàn)隨后的引物延伸反應的足夠活性。核酸變性所需的加熱條件是本領域眾所周知的且在美國專利號4，683，202和4，683，195中例示。如本文使用的，熱穩(wěn)定聚合酶一般適合于在溫度循環(huán)反應例如聚合酶鏈反應(“PCR”)中使用。熱穩(wěn)定核酸聚合酶的實例包括水生棲熱菌(Thermus aquaticus) Taq DNA聚合酶、棲熱菌屬物種(Thermus sp.) Z05聚合酶、黃棲熱菌(Thermus fIavus)聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶例如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
[0036]“經(jīng)修飾的”酶指包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一個單體不同于參考序列，例如酶的天然或野生型形式或酶的另一種修飾形式。示例性修飾包括單體插入、缺失和取代。經(jīng)修飾的酶還包括具 有來源于兩個或更多個親本的可鑒定組分序列(例如結構或功能結構域等)的嵌合酶。在經(jīng)修飾的酶的定義內(nèi)還包括的是包含參考序列的化學修飾的那些。經(jīng)修飾的聚合酶的實例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA 聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、Λ Z05聚合酶、Λ Z05_Gold聚合酶、AZ05R 聚合酶、E615G Taq DNA 聚合酶、E678G TMA-25 聚合酶、E678G TMA-30 聚合酶等。
[0037]術語“5’至3’核酸酶活性”或“5’-3’核酸酶活性”指一般與核酸鏈合成相關的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5’端去除，例如大腸桿菌DNA聚合酶I具有這種活性，而Klenow片段則沒有。
[0038]“基本上缺乏5’ -3’核酸酶活性”的聚合酶指具有Taq DNA聚合酶的50%或更低的(例如〈25%、〈20%、〈15%、〈10%) 5’-3’核酸酶活性的聚合酶。測量5’-3’核酸酶活性的方法和用于測量的條件是本領域眾所周知的，參見例如美國專利號5，466，591?；旧先狈?’到3’核酸酶活性的DNA聚合酶的實例包括大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N末端235個氨基酸的水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(例如如美國專利號5，616，494中描述的且在本領域中通常被稱為“Stoffel片段”)。其他實例包括具有足夠缺失(例如N末端缺失)、突變或修飾以消除或失活負責5’ -3’核酸酶活性的結構域的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，參見例如美國專利號5，795，762。[0039]術語“3’至5’核酸酶活性”或“3’-5’核酸酶活性”或“校正活性”指核酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的3’端去除。例如，大腸桿菌DNA聚合酶III具有這種活性，而水生棲熱菌(Taq) DNA聚合酶則沒有。
[0040]“保真度”或“復制保真度”是核酸聚合酶在模板依賴性聚合過程中摻入正確核苷酸的能力。在復制保真度的背景下，在新生核苷酸鏈上的“正確核苷酸”是經(jīng)由Watson-Crick堿基配對與模板核苷酸配對的核苷酸。特定聚合酶的復制保真度產(chǎn)生于摻入正確核苷酸和經(jīng)由聚合酶的3’-5’核酸酶活性從新生核苷酸鏈的3’末端去除不正確核苷酸的組合。測量核苷酸聚合酶的保真度的多種方法在Tindall等人(1988) "Fidelityof DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase"， Biochemistry,27:6008-6013中綜述。一般，具有3’-5’核酸酶(校正)能力的聚合酶比無校正活性的聚合酶具有更高的保真度。
[0041]“標記”指(共價或非共價)連接至分子且能夠提供關于分子的信息的部分。示例性標記包括突光標記、比色法標記、化學發(fā)光標記、生物發(fā)光標記、放射性標記、質(zhì)量修飾基團、抗體、抗原、生物素、半抗原和酶(包括過氧化物酶、磷酸酶等)。
[0042]在核酸擴增反應的背景下，“熱啟動”指其中至少一種關鍵試劑從反應混合物中被扣留(或如果存在于反應混合物中，則試劑保持無活性)，直至溫度足夠升高以提供一種或多種引物的必需雜交特異性的方案?！盁釂用浮笔悄軌蛟跓釂臃桨钢谐洚敗翱哿簟被驘o活性試劑的酶，一般為核酸聚合酶。
[0043]"Watson-Crick堿基配對”或簡寫的“堿基配對”指在雙鏈核酸分子內(nèi)的“常規(guī)的”氫鍵成鍵。Watson-Crick堿基配對是腺嘌呤和胸腺嘧啶之間、鳥嘌呤和胞嘧啶之間、腺嘌呤和尿嘧啶之間、以及這些堿基的類似物之間的氫鍵成鍵。
[0044]“選擇性核苷酸”是對引物賦予等位基因選擇性的等位基因特異性引物中的核苷酸。選擇性核苷酸與靶核 酸的所需變體中的相應核苷酸互補，但不與靶核酸的不需要變體中的核苷酸互補。在引物中，多于一個核苷酸可以與靶核酸的所需變體中的核苷酸互補，但不與靶核酸的不需要變體中的相應核苷酸互補。然而，選擇性核苷酸位于引物內(nèi)影響引物特異性的位置處。選擇性核苷酸允許靶核酸的有效或無效擴增，這取決于它在靶核酸中是否發(fā)現(xiàn)互補配偶體。引物可以含有多于一個選擇性核苷酸。
[0045]表達“其中當所述第二寡核苷酸與和至少一個選擇性核苷酸互補的靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠有效延伸所述第二寡核苷酸，并且當所述第二寡核苷酸與和至少一個選擇性核苷酸不互補的靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低”意指第二寡核苷酸通過聚合酶的延伸在選擇性核苷酸與靶形成堿基對時比所述選擇性核苷酸不與靶形成堿基對時更有效。
[0046]如上所述，在一個方面，本發(fā)明涉及等位基因特異性擴增的方法，其包括(a)提供可能含有靶序列的至少一種變體的樣品；(b)提供第一寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補；(C)提供第二寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補，具有與靶序列的僅一種變體互補的選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸；(d)提供適合于所述第一和第二寡核苷酸與靶序列的至少一種變體雜交的條件；(e)提供適合于通過核酸聚合酶的寡核苷酸延伸的條件；其中當所述第二寡核苷酸與對其它具有所述互補選擇性核苷酸的靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠延伸所述第二寡核苷酸，并且當所述第二寡核苷酸與對其它具有非互補選擇性核苷酸的靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低。
[0047]與靶序列的一種或多種變體至少部分互補，并具有與靶序列的僅一種變體互補的選擇性核苷酸的第二寡核苷酸被稱為“選擇性寡核苷酸”、“選擇性引物”或“等位基因選擇性引物”。本發(fā)明的選擇性寡核苷酸包含10-50、更優(yōu)選15-35個核苷酸，它們的大多數(shù)與靶序列的多于一種變體中的序列互補。寡核苷酸的選擇性核苷酸與待擴增的靶序列變體互補，并且不與其他變體互補。在一個實施方案中，選擇性核苷酸是3’末端核苷酸。本發(fā)明的選擇性寡核苷酸包括一個或多個“G形夾”核苷酸。在一些實施方案中，“G形夾”核苷酸在3’末端核苷酸處出現(xiàn)。在其他實施方案中，“G形夾”核苷酸在3’末端核苷酸上游的1-5個核苷酸處出現(xiàn)。在其他實施方案中，經(jīng)修飾的堿基核苷酸是3’末端核苷酸。在一些實施方案中，“G形夾”核苷酸在3’末端處和在寡核苷酸內(nèi)的其他地方的至少再一個位置處出現(xiàn)。
[0048]本發(fā)明的等位基因特異性引物可以摻入本領域已知的引物設計的多個方面。例如，引物可以采取稱為“蝎形(scorpion)”且在Whitcombe等人(1999) "Detection ofPCR products using self-probing ampI icons and fluorescence", Nature Biotech.17:804-807中所述的單分子引物-探針組合的形式。根據(jù)本發(fā)明設計的蝎形引物摻入蝎形的一般元件，即探針部分、莖環(huán)部分和引物部分。進一步地，在根據(jù)本發(fā)明設計的蝎形中，弓丨物部分具有與變體位置互補的3’端。在根據(jù)本發(fā)明設計的蝎形中的引物部分含有如本文描述的一個或多個“G形夾”核苷酸。
[0049]在本發(fā)明的一些實施方案中，擴增涉及聚合酶鏈反應，即模板變性、寡核苷酸引物與模板退火(雜交)、和通過核酸聚合酶的引物延伸的重復循環(huán)。在一些實施方案中，退火和延伸在相同的溫度步驟中發(fā)生。
[0050]在一些實施方案中，擴增反應涉及熱啟動方案。在等位基因特異性擴增的背景下，等位基因特異性引物關于錯配靶的選擇性可以通過使用熱啟動方案得到增強。許多熱啟動方案是本領域已知的，例如·蠟的使用，將關鍵試劑與反應混合物的剩余部分分離(美國專利號5，411，876)，通過抗體可逆失活的核酸聚合酶的使用(美國專利號5，338，671)，通過設計為特異性結合其活性位點的寡核苷酸可逆失活的核酸聚合酶，或具有可逆化學修飾的核酸聚合酶的使用，如例如美國專利號5，677，152和5，773，528中描述的。
[0051]在本發(fā)明的一些實施方案中，等位基因特異性擴增測定是實時PCR測定。在實時PCR測定中,擴增的測量標準是“達到閾值的循環(huán)(cycles to threshold)”或Ct值。更早的Ct值反映閾值水平的快速實現(xiàn)且因此更有效的擴增。更晚的Ct值可以反映效率低的或受抑制的擴增。在等位基因特異性實時PCR測定的背景下，匹配和錯配模板之間的Ct值中的差異是等位基因之間的鑒別或測定選擇性的測量標準。
[0052]等位基因特異性擴增測定可以采用本領域已知的任何合適的核酸聚合酶。對于等位基因特異性PCR測定，可以使用任何熱穩(wěn)定的核酸聚合酶。有時希望使用無校正(3’ -5’ -外切核酸酶)活性的酶，例如如Taq DNA聚合酶。還可能希望使用基本上或完全缺乏5’ -3’核酸酶活性的酶，例如美國專利號5，795，762中所述的。此類酶的一個實例是Λ Z05聚合酶。有時可能希望具有“熱啟動”能力的酶，例如美國專利號5，677，152和5，773，528中所述的可逆修飾的酶。熱啟動酶的一個實例是AZ05-Gold聚合酶。
[0053]擴增產(chǎn)物的檢測可以通過本領域已知的任何方法完成。這些方法包括標記引物和探針以及多種核酸結合染料的使用。檢測方法可以對于靶序列的一種變體是特異性的，或可以對于祀序列的所有變體或甚至對于所有雙鏈DNA是非特異性的(generic)。當不需要的靶變體的擴增是最低限度的且預期會落入方法的檢測限之下時，可以使用非特異性檢測方法。
[0054]擴增產(chǎn)物可以在擴增已完成后例如通過未標記產(chǎn)物的凝膠電泳和用核酸結合染料染色凝膠進行檢測?；蛘?，由于在合成過程中的摻入或由于是標記引物的延伸產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物可以攜帶放射性或化學標記。在電泳后或電泳過程中，標記的擴增產(chǎn)物可以用本領域已知的合適放射學或化學工具進行檢測。在電泳后，產(chǎn)物還可以用通過本領域已知的方法的任何一種標記的靶特異性探針進行檢測。標記探針還可以無需電泳即在“斑點印跡”測定等中應用于靶。
[0055]在其他實施方案中，擴增產(chǎn)物的存在可以在同質(zhì)測定(homogeneous assay)中進行檢測，所述同質(zhì)測定即這樣的測定，其中在擴增循環(huán)過程中或至少在同一未打開的管中檢測新生產(chǎn)物，并且不需要擴增后處理。同質(zhì)擴增測定已例如在美國專利號5，210，015中得到描述。使用核酸嵌入染料的同質(zhì)擴增測定已例如在美國專利號5，871，908和
6,569, 627中得到描述。同質(zhì)測定還可以采用由兩種相互作用的熒光團標記的熒光探針，例如“分子信標”探針(Tyagi等人(1996) Nat.Biotechnol.,14:303-308)或熒光標記的核酸酶探針(Livak等人(1995) PCR Meth.Appl.，4:357-362)。在這些技術的某些變化中，擴增產(chǎn)物還可以由于其區(qū)別性的解鏈溫度進行鑒定，參見美國專利號5，871，908和6，569，627。擴增產(chǎn)物還可以使用稱為“蝎形”的單分子引物_探針組合進行檢測。Whitcombe 等人(1999 )〃Detection of PCR products using self-probing amp I icons andfluorescence",Tfeiare Biotech.17:804-807。蝎形寡核苷酸的引物部分可以是根據(jù)本發(fā)明設計的等位基因特異性引物。
[0056]在另一個方面，本發(fā)明提供了用于特異性或選擇性擴增靶序列的所選變體的反應混合物，其包含第一寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補；第二寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補，但具有與靶序列的僅一種變體互補的選擇性核苷酸，其中所述第二寡核苷酸包括至少一個“G形夾”核苷酸和已知以多于一種序列變體存在的靶核酸。在一些實施方案中，反應混合物進一步包含核酸擴增通常所需的試劑和溶液，包括核酸聚合酶、核酸前體即核苷三磷酸、以及適合于支持核酸聚合酶活性的有機和無機離子。
[0057]在另一個方面，本發(fā)明提供了用于進行根據(jù)本發(fā)明的等位基因特異性擴增的試劑盒。試劑盒通常包括測定特異性組分以及進行DNA擴增測定通常所需的組分。作為測定特異性組分，本發(fā)明的等位基因特異性擴增試劑盒一般包括第一寡核苷酸，其與靶序列的一種或多種變體至少部分互補；和第二寡核苷酸，其與靶序列的多于一種變體至少部分互補，具有與祀序列的僅一種變體互補的選擇性核苷酸，并且還具有至少一個“G形夾”核苷酸；和任選的對照核酸序列，其包含一些與試劑盒中裝有的寡核苷酸至少部分互補的對照靶序列的至少一種變體。在一些實施方案中，可以裝有對照核酸序列的多于一種變體。在某些實施方案中，在試劑盒中裝有的對照核酸序列的幾種變體中，至少一種變體與等位基因選擇性寡核苷酸的選擇性核苷酸互補。作為核酸擴增通常所需的組分，本發(fā)明的試劑盒一般包括下述中的一種或多種:核酸聚合酶、核酸前體例如核苷三磷酸(脫氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸)、任選的用于使核酸的焦磷酸解降到最低的焦磷酸酶、用于保護不受擴增反應的攜帶污染(carry-over contamination)的尿嘧唳N-糖基化酶(UNG)、擴增反應和檢測所需的預制試劑和緩沖液、和用于進行本發(fā)明的等位基因特異性擴增的一套說明書。
[0058]在另外一個方面，本發(fā)明提供了用于等位基因特異性PCR的寡核苷酸。用于本發(fā)明的等位基因特異性PCR的一般寡核苷酸包含10-50、更優(yōu)選15-35個核苷酸，它們的大多數(shù)與靶序列的多于一種變體中的序列互補。然而，寡核苷酸的選擇性核苷酸與靶序列的一種變體互補，并且與其他變體不互補。進一步地，本發(fā)明的寡核苷酸包括一個或多個“G形夾”核苷酸。在一些實施方案中，“G形夾”核苷酸在3’末端核苷酸處出現(xiàn)。在其他實施方案中，“G形夾”核苷酸在3’末端核苷酸上游的1-5個或例如1、2或3個核苷酸處出現(xiàn)。在一些實施方案中，“G形夾”核苷酸在3’末端處以及在寡核苷酸內(nèi)的其他地方出現(xiàn)。
[0059]提供下述實施例和附圖以幫助本發(fā)明的理解，本發(fā)明的真實范圍在附加的權利要求中闡述。
實施例
[0060]實施例1
用于檢測人EGFR基因中的突變L858R的引物這個突變產(chǎn)生于野生型EGFR基因(SEQ ID NO:1)中的核苷酸變化2573 T_>G。用于檢測野生型和突變型EGFR基因(SEQ ID NO: 2)的引物和探針顯示于表1中。每個擴增引物對中的一條引物在3’末端處與突變型變體匹配且與野生型變體錯配。剩余引物和探針對于突變型和野生型靶是共同的。
[0061]表1
【權利要求】
1.靶序列變體的等位基因特異性擴增的方法，所述靶以幾種變體序列的形式存在，所述方法包括: Ca)使第一和第二寡核苷酸與所述靶序列的至少一種變體雜交；其中所述第一寡核苷酸與所述靶序列的一種或多種變體至少部分互補，并且所述第二寡核苷酸與所述靶序列的一種或多種變體至少部分互補，并且具有與所述靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸； (b)用核酸聚合酶延伸所述第二寡核苷酸，其中當所述第二寡核苷酸與和所述至少一個選擇性核苷酸互補的所述靶序列變體雜交時，所述聚合酶能夠有效延伸所述第二寡核苷酸，并且當所述第二寡核苷酸與和所述至少一個選擇性核苷酸不互補的所述靶序列變體雜交時，則延伸效率明顯更低。
2.權利要求1的方法，其中所述至少一個選擇性核苷酸在3’末端核苷酸處。
3.權利要求1的方法，其中所述“G形夾”核苷酸在3’末端核苷酸處或在3’末端核苷酸附近的1-5個核苷酸的位置處。
4.權利要求1的方法，其進一步包括檢測步驟(b)中的引物延伸產(chǎn)物的步驟(C)。
5.權利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶選自TaqDNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔΖ05 DNA聚合酶和AZ05-Gold DNA聚合酶。
6.權利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶具有3’-5’核酸酶活性。
7.權利要求6的方法，其中所述核酸聚合酶選自PfuDNA聚合酶和海棲熱袍菌(Thermatoga MaritimaX
8.權利要求1的方法，其中步驟(a)中的序列的所述變體是人PIK3CA或EGFR基因的突變。
9.權利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸選自SEQID NO: 5、6、7和12。
10.試劑盒，其用于靶序列的等位基因特異性擴增，所述靶以幾種變體序列的形式存在，所述試劑盒包含: Ca)第一寡核苷酸，其與所述靶序列的一種或多種變體至少部分互補；和 (b)第二寡核苷酸，其與所述靶序列的一種或多種變體至少部分互補，具有與所述靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸。
11.權利要求10的試劑盒，其進一步包含核酸聚合酶、核苷三磷酸、適合于通過所述核酸聚合酶的核酸延伸的緩沖液和用于進行等位基因特異性擴增的一套說明書。
12.寡核苷酸，其用于進行靶序列的等位基因特異性擴增，所述靶以幾種變體序列的形式存在，所述寡核苷酸包含: Ca)與所述靶序列的一種或多種變體的部分至少部分互補的序列； (b)與所述靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸； (c)至少一個“G形夾”核苷酸。
13.權利要求12的寡核苷酸，其包含選自SEQID NO: 5、6、7和12的序列。
14.反應混合物，其用于靶序列的等位基因特異性擴增，所述靶以幾種變體序列的形式存在，所述混合物包含: Ca)第一寡核苷酸，其與所述靶序列的一種或多種變體至少部分互補；和(b)第二寡核苷酸，其與所述靶序列的一種或多種變體至少部分互補，但具有與所述靶序列的僅一種變體互補的至少一個選擇性核苷酸；其中所述第二寡核苷酸摻入至少一個“G形夾”核苷酸。
15.權利要求14的反應混合物，其進一步包含核酸聚合酶、核苷三磷酸和適合于通過所述核酸聚合酶的核酸延伸的緩沖液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103797132SQ201280045391
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年9月12日 優(yōu)先權日:2011年9月23日
【發(fā)明者】V.博德普迪, N.舍恩布倫納, A.湛 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司