發(fā)酵單胞菌中的泛酸生物合成的制作方法
【專利摘要】發(fā)酵單胞菌（Zymomonas）不能合成泛酸，并且在生長培養(yǎng)基中需要這種必需維生素。用表達(dá)2-脫氫泛解酸還原酶和天冬氨酸1-脫羧酶的操縱子轉(zhuǎn)化的發(fā)酵單胞菌菌株能夠在缺少泛酸的培養(yǎng)基中生長。這些菌株可被用于在種子培養(yǎng)物和發(fā)酵培養(yǎng)基中沒有補(bǔ)充泛酸的乙醇的生產(chǎn)。
【專利說明】發(fā)酵單胞菌中的泛酸生物合成
[0001]本申請要求2011年4月7日提交的美國臨時(shí)申請61/472664的權(quán)益，并且該臨時(shí)申請全文以引用方式并入本文。
[0002]政府權(quán)利聲明
[0003]本發(fā)明由美國政府支持，以資助號合約號DE-FC36-07G017056受到能源部資助。美國政府擁有本發(fā)明的必然權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]本發(fā)明涉及微生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。更具體地，工程化改造了發(fā)酵單胞菌(Zymomonas),用于表達(dá)酶以提供用于泛酸生物合成的途徑。
【背景技術(shù)】
[0005]通過微生物生產(chǎn)乙醇提供了一種替代化石燃料的可供選擇的能源，因此成為當(dāng)前研究的重要領(lǐng)域。細(xì)菌發(fā)酵單胞菌天然地產(chǎn)生乙醇，并且已被遺傳工程化以提高乙醇的生產(chǎn)。改進(jìn)包括競爭性途徑的除去、木糖的利用、和在包含生物質(zhì)水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中更好的表現(xiàn)(例如:US7, 741，119、US5, 514，583、US5, 712，133、W095/28476、Feldmann 等人(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.,38:354-361, Zhang 等人(1995) Science267:240-243、和US2009-0203099A1)。從木質(zhì)纖維素和纖維素生物質(zhì)產(chǎn)生的水解產(chǎn)物能夠提供用于生物催化劑發(fā)酵的可大量獲得的、低成本的碳底物來源，以生產(chǎn)所期望的產(chǎn)物。生物質(zhì)水解產(chǎn)物通常包括木糖，以及發(fā)酵的抑制劑。
[0006]就經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵生產(chǎn)而言，期望生物催化劑不需要向生長和生產(chǎn)培養(yǎng)基添加任何昂貴的營養(yǎng)物質(zhì)。具體地，期望對于種子或生產(chǎn)生物催化劑培養(yǎng)而言不需要維生素的補(bǔ)充。發(fā)酵單胞菌需要在生長培養(yǎng)基中補(bǔ)充泛酸(PA ;也叫泛酸、維生素B5、3-[(2，4- 二羥基-3，3-二甲基丁基)氨基]丙酸)，因?yàn)槠洳荒芎铣稍摖I養(yǎng)物質(zhì)(Seo等人(2005)Nat.Biotechnol.，23:63-68 ；Nipkow 等人(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.，19:237-240 和其中的參考文獻(xiàn))。PA是重要的細(xì)胞組分，因?yàn)樗禽o酶A (CoA)的合成所需要的，輔酶A是具有許多重要的細(xì)胞功能的化合物。對許多動(dòng)物而言，它是必需的營養(yǎng)物質(zhì)，而許多植物表達(dá)用于合成PA的酶。
[0007]大腸桿菌(E.coli)能夠合成PA，并且其生物合成途徑是已知的。編碼該途徑的酶的大腸桿菌(E.coli)基因已被鑒定。通過過表達(dá)天然地產(chǎn)生泛酸的微生物的該生物合成途徑中的基因，已實(shí)現(xiàn)了泛酸的提高的生產(chǎn)。W02003006664中公開了在天然地產(chǎn)生D-泛酸的芽孢桿菌(Bacillus)中提高編碼區(qū)(例如 ybbT、ywkA、yjmC、ytsj、mdh、cysK、iolj、pdhD、yuiE、dhas、adk、yusH、yqhJ、yq hK、和/或yqh_I)的表達(dá)，以提高泛酸的生產(chǎn)。此外，panE、ylbQ、panB、panD、panC、ilvB、ilvN、alsS、ilvC、ilvD、serA、serC、ywpj、和 / 或 glyA 可以是表達(dá)提高的。US6，171，845公開了在產(chǎn)生泛酸的微生物中，編碼酮泛解酸還原酶(具體地，panE)的核苷酸序列的擴(kuò)增。顯不了啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae) YRH063c開放閱讀框(ORF)通過大腸桿菌中panE-1lvC突變體的互補(bǔ)作用編碼具有酮泛解酸還原酶活性的蛋白質(zhì)。US20050089973公開了在其中存在的生物合成途徑被操縱(例如通過過表達(dá)酮泛解酸還原酶和天冬氨酸α-脫羧酶)的微生物中的泛化合物生產(chǎn)。 [0008]US2005221466公開了具有丙氨酸2，3_氨基變位酶活性(其將α -丙氨酸轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸)的細(xì)胞用于生產(chǎn)泛酸的使用。
[0009]仍然存在對構(gòu)建能夠在外部提供的PA的不存在下生長和生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵單胞菌菌株的需求。這些發(fā)酵單胞菌菌株可被用于改善使用該生物催化劑的乙醇生產(chǎn)并降低其成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了重組發(fā)酵單胞菌細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)異源的酶以提供PA生物合成途徑。
[0011]因此，本發(fā)明提供了發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌菌株，所述細(xì)菌菌株包含編碼具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽的異源核酸分子和編碼具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽的異源核酸分子。
[0012]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了制備合成泛酸的發(fā)酵單胞菌菌株的方法，所述方法包括:
[0013]a)提供發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌菌株；
[0014]b)導(dǎo)入編碼具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽的異源核酸分子；以及
[0015]c)導(dǎo)入編碼具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽的異源核酸分子；其中步驟b)和
c)可以是以順序的或同時(shí)的，并且其中所述菌株中表現(xiàn)2-脫氫泛解酸還原酶和天冬氨酸
1-脫羧酶活性。
[0016]在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括:
[0017]a)提供發(fā)酵單胞菌屬的重組細(xì)菌菌株，所述重組細(xì)菌菌株包含編碼具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽的異源核酸分子和編碼具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽的異源核酸分子；以及
[0018]b)在所述菌株產(chǎn)生乙醇的條件下，使(a)的菌株與發(fā)酵培養(yǎng)基接觸。
[0019]【專利附圖】

【附圖說明】、生物保藏和序列描述
[0020] 申請人:已經(jīng)按照國際承認(rèn)的用于專利程序目的的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的有關(guān)條款進(jìn)行了以下生物保藏:
[0021]保藏菌株信息
[0022]
【權(quán)利要求】
1.發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)屬的重組細(xì)菌菌株，包含編碼具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽的異源核酸分子和編碼具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽的異源核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽是屬于ECl.1.1.169類的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽與SEQ ID NO:4的大腸桿菌(E.coli)2-脫氫泛解酸還原酶相比具有至少十個(gè)保守的氨基酸位置，所述保守的氨基酸位置選自位置7處的G、位置9處的G、位置12處的G、位置72處的K、位置98處的N、位置99處的G、位置176處的K、位置180處的N、位置184處的N、位置210處的E、位置244處的S、位置248處的D或S、和位置256處的E。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽是屬于EC4.1.1.11類的酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽與SEQ ID N0:7的大腸桿菌天冬氨酸1-脫羧酶相比具有至少八個(gè)保守的氨基酸位置，所述保守的氨基酸位置選自位置9處的K、位置11處的H、位置22處的Y、位置24處的G、位置25處的S、位置52處的G、位置54處的R、位置57處的T、位置58處的Y、位置72處的N、位置73處的G、和位置86處的I。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽與SEQ ID NO: 7的大腸桿菌天冬氨酸1-脫羧酶相比具有位置9處的K、位置22處的Y、位置24處的G、位置57處的T、和位置58處的Y這五個(gè)保守的氨基酸位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)菌菌株，其中使所述菌株在缺少泛酸的培養(yǎng)基中生 長。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述菌株產(chǎn)生乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組細(xì)菌菌株，其中所述菌株包含使乙醇的生產(chǎn)提高的基因修飾。
10.制備合成泛酸的發(fā)酵單胞菌菌株的方法，包括: a)提供發(fā)酵單胞菌屬的細(xì)菌菌株； b)導(dǎo)入編碼具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽的異源核酸分子；以 及 c)導(dǎo)入編碼具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽的異源核酸分子；其中步驟b)和c)可以是以順序的或同時(shí)的，并且其中由步驟(a)、(b)、和(C)制備的菌株中表現(xiàn)2-脫氫泛解酸還原酶活性和天冬氨酸1-脫羧酶活性二者。
11.生產(chǎn)乙醇的方法,包括: a)提供發(fā)酵單胞菌屬的重組細(xì)菌菌株，所述重組細(xì)菌菌株包含編碼具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽的異源核酸分子和編碼具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽的異源核酸分子；以及 b)在所述菌株產(chǎn)生乙醇的條件下，使(a)的菌株與發(fā)酵培養(yǎng)基接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽是屬于ECl.1.1.169類的酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述具有2-脫氫泛解酸還原酶活性的多肽與SEQ ID N0:4的大腸桿菌2-脫氫泛解酸還原酶相比具有至少十個(gè)保守的氨基酸位置，所述保守的氨基酸位置選自位置7處的G、位置9處的G、位置12處的G、位置72處的K、位置98處的N、位置99處的G、位置176處的K、位置180處的N、位置184處的N、位置210處的E、位置244處的S、位置248處的D或S、和位置256處的E。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽是屬于EC4.1.1.11 類的酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽與SEQID NO:7的大腸桿菌天冬氨酸1-脫羧酶相比具有至少八個(gè)保守的氨基酸位置，所述保守的氨基酸位置選自位置9處的K、位置11處的H、位置22處的Y、位置24處的G、位置25處的S、位置52處的G、位置54處的R、位置57處的T、位置58處的Y、位置72處的N、位置73處的G、和位置86處的I。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述具有天冬氨酸1-脫羧酶活性的多肽與SEQID NO: 7的大腸桿菌天冬氨酸1-脫羧酶相比具有位置9處的K、位置22處的Y、位置24處的G、位置57處的T、和位置58處的Y這五個(gè)保守的氨基酸位置。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(b)之前，使(a)的細(xì)菌菌株與缺少或具有亞最佳量的泛酸的培養(yǎng)基接觸，其中產(chǎn)生種子培養(yǎng)物，以接種(b)的發(fā)酵培養(yǎng)基。
18.根據(jù)權(quán)利要求11或17所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基缺少或具有亞最佳量的泛酸。
【文檔編號】C12N9/04GK103476927SQ201280015959
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月7日
【發(fā)明者】陶巒, J-F.湯布, P.V.維坦恩 申請人:納幕爾杜邦公司