熒光壽命表觀遺傳學(xué)測定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于測量熒光壽命(FLT)來測定酶活性的方法。特別地，本發(fā)明涉及對能夠修飾肽底物結(jié)構(gòu)之酶的測定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脫甲基化、乙?；⒚撘阴；蛎搧啺被拿浮?br> 【專利說明】熒光壽命表觀遺傳學(xué)測定
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基于測量突光壽命(flurescence lifetime, FLT)來測定酶活性的方法。特別地，本發(fā)明涉及對能夠修飾肽底物結(jié)構(gòu)之酶的測定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脫甲基化、乙?；?、脫乙?；蛎搧啺被?deimination)的酶。
【背景技術(shù)】
[0002]催化其他生物分子之結(jié)構(gòu)修飾的酶是藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶標(biāo)。例如，催化蛋白質(zhì)之翻譯后修飾的酶(特別是修飾組蛋白結(jié)構(gòu)的酶)，由于其與人類疾病(例如神經(jīng)變性和癌癥)相關(guān)而成為有前景的藥物靶標(biāo)。
[0003]構(gòu)成組蛋白之氨基酸的翻譯后修飾在“表觀遺傳學(xué)(epigenetics) ”領(lǐng)域中特別重要，“表觀遺傳學(xué)”是由除基本DNA序列改變之外的機(jī)制引起的表型(外觀)或基因表達(dá)之可遺傳性改變的研究。遺傳物質(zhì)需要保護(hù)、包裝以及用于調(diào)節(jié)過程(例如轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和修復(fù))的方法。在真核生物中，這些作用在很大程度上通過將基因組DNA裝配成核小體的組蛋白來實(shí)施。核小體與許多相關(guān)蛋白質(zhì)包裝在一起以形成染色質(zhì)纖維。每個核小體由幾乎纏繞圓柱形蛋白質(zhì)核心兩次的DNA組成，所述蛋白質(zhì)核心含有每種組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)的兩個拷貝。組蛋白的N端尾區(qū)從其中存在結(jié)構(gòu)性球狀結(jié)構(gòu)域的核小體核心中伸出。
[0004]為了使組蛋白能夠調(diào)節(jié)多種過程，通過多種翻譯后修飾來改變組蛋白。雖然組蛋白修飾在整個序列中均發(fā)生，但是組蛋白的非結(jié)構(gòu)性N端(組蛋白尾區(qū))被特別高度地修飾。這些修飾包括乙酰化、甲基化、脫亞氨化、泛素化、磷酸化和蘇素化(sumoylation)。乙?；沁@些修飾中研究得最深入的。例如，通過組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferase,HAT)乙酰化組蛋白H3尾區(qū)的K14和K9賴氨酸通常與轉(zhuǎn)錄能力相關(guān)。
[0005]組蛋白乙?；{(diào)節(jié)多個細(xì)胞過程，并且特定的乙?；Ｊ疆a(chǎn)生不同的結(jié)果，例如，新合成的組蛋白上的乙?；Ｊ綄τ谄渫ㄟ^組蛋白分子伴侶裝配成核小體來說是非常重要的。另外，染色質(zhì)壓縮和折疊的程度可受組蛋白H4第16位賴氨酸之乙酰化的調(diào)節(jié)。最后，組蛋白乙?；瘜τ诨蜣D(zhuǎn)錄來說是至關(guān)重要的。組蛋白的賴氨酸乙?；ǔＩ婕耙暂^高的轉(zhuǎn)錄速率打開染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0006]組蛋白乙?；芙M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)活性和脫乙酰酶活性的調(diào)節(jié)，這對于多種組蛋白以及對于單個組蛋白上的特定位點(diǎn)具有不同偏好(參見Shahbazian和Grunstein (2007)Annual review of Biochemistry,第 76 卷:75-100)。
[0007]除乙?；?，組蛋白(特別是H3和H4)的甲基化對于染色質(zhì)功能(例如基因表達(dá)、DNA復(fù)制和染色體分離)的調(diào)節(jié)也很重要。組蛋白H3的甲基化通常與染色質(zhì)凝聚相關(guān)，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制。
[0008]組蛋白僅在精氨酸和賴氨酸殘基上被甲基化。精氨酸可以被單甲基化或二甲基化，其中后者為對稱或不對稱構(gòu)型。催化該過程的酶分為兩種類型，其中I型酶催化Ne-單甲基精氨酸殘基和不對稱Ne，Ne-二甲基精氨酸殘基的形成，而II型酶催化Ne-單甲基精氨酸殘基和對稱Ne，Ne-二甲基精氨酸殘基的形成。與精氨酸甲基化類似，ε-氮上的賴氨酸甲基化也可作為單甲基化、二甲基化或三甲基化形式而發(fā)生。
[0009]組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)負(fù)責(zé)組蛋白H3和H4的甲基化并且利用稱為SET(Supressor of variegation,Enhancer of zeste,Trithorax)結(jié)構(gòu)域的催化活性位點(diǎn)。SET結(jié)構(gòu)域是參與調(diào)芐基因活性的130個氨基酸的序列。已證明該結(jié)構(gòu)域與組蛋白尾區(qū)結(jié)合并引起組蛋白的甲基化。也可通過使用組蛋白賴氨酸脫甲基酶(PKDM)脫甲基化來操縱組蛋白H3和H4。這種最近鑒定的酶類中的一個家族具有稱為Jumonji結(jié)構(gòu)域(JmjC)的催化活性位點(diǎn)。當(dāng)JmjC利用多個輔因子使甲基水解時，發(fā)生脫甲基化，從而移除甲基。JmjC能夠使單甲基化、二甲基化和三甲基化底物脫甲基化。
[0010]有越來越多的證據(jù)將組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferase,HMT)和乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)與不同病理狀況(從惡性腫瘤到神經(jīng)病)聯(lián)系起來。因此，鑒定這些酶的抑制劑可提供藥物發(fā)現(xiàn)的出發(fā)點(diǎn)。
[0011]肽基精氨酸脫亞氨酶(peptidyl arginine deiminase, PAD)是將底物蛋白質(zhì)上的精氨酸殘基在翻譯后轉(zhuǎn)化為非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸瓜氨酸的鈣依賴性酶的家族。PAD催化的瓜氨酸化(伴隨有帶正電亞氨基的喪失)將強(qiáng)堿性精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為中性氨基酸。認(rèn)為由瓜氨酸化引起的堿性電荷喪失破壞了底物蛋白質(zhì)內(nèi)的電荷分布并改變了所述蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的能力。通過PAD類酶使組蛋白H2A、H3和H4脫亞氨化抵消了精氨酸甲基化。特別地，PAD4同工型能夠催化組蛋白H2A、H3和H4上精氨酸殘基的瓜氨酸化(Thompson，P.R.和 Fast, ff.，ACS Chem Biol.2006，1，433-441)。因此，PAD 組的酶可在“組蛋白密碼(histone code) ”的修飾中發(fā)揮關(guān)鍵作用并因而影響基因轉(zhuǎn)錄。
[0012]PAD酶和瓜氨酸化蛋白質(zhì)還與多種人類疾病(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、阿爾茲海默病)相關(guān)并且(更最近地)與癌癥相關(guān)(Vossaar, E.R.等，Citrullinationof synovial proteins in mouse models of rheumatoid arthritis(2003).ArthritisRheum,第 48 卷:2489-2500 ;Musse, A.A.等，Peptidyl arginine deiminase2(PAD2)over expression in transgenic mice leads to myelin loss in the centralnervous system(2008), Dis Model Mech.第 I 卷:229-240 ；Ishigami, A.等，Abnormalaccumulation of citrullinated proteins catalysed by peptidyl arginine deiminasein hippocampal extracts from patients with Alzheimer' s disease(2005)J NeurosciRes.第 80 卷；120-128 和 Chang X.等.Expression of peptidyl arginine deiminasetype4(PAD4)in various tumours(2006)Mol Carinog.第 45 卷:183-196)。
[0013]因此，持續(xù)需要用于修飾其他生物分子之結(jié)構(gòu)的這類酶(特別是以上所總結(jié)的催化組蛋白修飾的酶類)的穩(wěn)健(robust)且靈敏的測定。特別地，持續(xù)需要用于此類酶的穩(wěn)健、靈敏的測定，其可容易地應(yīng)用于高通量篩選形式，能夠高效地篩選酶抑制劑。
[0014]已報道了用于鑒定調(diào)節(jié)組蛋白修飾酶之活性的化合物的多種基于放射性的酶測定。例如，已開發(fā)了用于通過測量甲基從常規(guī)標(biāo)記的輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)向組蛋白衍生肽底物上賴氨酸之ε-氨基殘基的轉(zhuǎn)移來監(jiān)測組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶之活性的測定。然而，因?yàn)榻M蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶可進(jìn)行賴氨酸的單、二或三甲基化，所以測量放射性甲基的并入不提供最終反應(yīng)產(chǎn)物之性質(zhì)的信息。關(guān)于使用放射性測定和后續(xù)的放射性核素處理也具有重大危害。
[0015]已采用了質(zhì)譜(MS)來研究組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。使用、MS允許同時表征由某些組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的不同甲基-賴氨酸形式，即單、二或三甲基化賴氨酸。然而，該技術(shù)不適合于高通量篩選應(yīng)用。
[0016]基于組蛋白H3衍生底物的體外酶修飾已開發(fā)了用于組蛋白乙?；蚣谆姆欠派湫詼y定。在這樣的測定中，使用標(biāo)記抗體進(jìn)行甲基化反應(yīng)產(chǎn)物的檢測。此類測定的實(shí)例是由 Perkin Elmer? 開發(fā)的 Lance Ultra? 測定和 AlphaLISA? 測定。
[0017]W02007/076302描述了用于肽基精氨酸脫亞氨酶活性的調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。所述測定基于突光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)。
[0018]發(fā)明概述
[0019]本發(fā)明提供了基于測量熒光壽命(FLT)的酶(特別是能夠修飾肽底物結(jié)構(gòu)的酶)活性測定，所述酶包括例如催化肽底物甲基化、脫甲基化、乙?；⒚撘阴；蛎搧啺被拿?。
[0020]在本發(fā)明的第一方面中，提供了測定受試樣品中修飾酶(modifying enzyme)之活性的方法，其包括:
[0021](a)使受試樣品與突光受調(diào)節(jié)之酶底物(fluorescent-modulated enzymesubstrate)相接觸，所述酶底物包含與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合的接頭分子，其中底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經(jīng)修飾底物，由于修飾而使得所述經(jīng)修飾底物的接頭分子對第二種酶的切割敏感或者保護(hù)其免于被第二種酶切割，其中通過第二種酶切割底物或經(jīng)修飾底物將含有熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之底物的一部分與含有熒光部分之底物的一部分分開；以及
[0022](b)通過檢測由 第二種酶作用于經(jīng)修飾底物和/或底物上引起的熒光部分之熒光壽命的變化來檢測經(jīng)修飾底物的形成，其中經(jīng)修飾底物的形成為修飾酶的活性提供了指
/Jn ο
[0023]在一些具體的實(shí)施方案中，所述方法可用于測定選自以下的修飾酶的活性:蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶、脫亞氨酶、蛋白質(zhì)脫甲基酶和蛋白質(zhì)脫乙酰酶。更特別地，提供了用于以下酶類中每一種的測定:組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)、組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)、組蛋白脫甲基酶(特別是組蛋白-賴氨酸脫甲基酶(KDM)和組蛋白-精氨酸脫甲基酶)、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。
[0024]在本發(fā)明的第二方面中，提供了篩選修飾酶之抑制劑的方法，所述方法包括在受試化合物存在下使用根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法測定所述修飾酶的活性，其中在受試化合物存在下酶活性的降低將受試化合物鑒定為所述修飾酶的抑制劑。
[0025]在一些具體實(shí)施方案中，所述方法可用于篩選選自以下的修飾酶的抑制劑:蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶、脫亞氨酶、蛋白質(zhì)脫甲基酶和蛋白質(zhì)脫乙酰酶。更特別地，本文中提供了用于篩選以下酶類的抑制劑的方法:組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)、組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)、組蛋白脫甲基酶(特別是組蛋白-賴氨酸脫甲基酶(KDM)和組蛋白-精氨酸脫甲基酶)、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。
[0026]在本發(fā)明的第三方面中，提供了熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其包含與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合的接頭分子，其中所述底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經(jīng)修飾底物，由于修飾使得所述經(jīng)修飾底物的接頭分子對第二種酶的切割敏感或者保護(hù)其免于被第二種酶切割，其中通過第二種酶切割底物或經(jīng)修飾底物將含有熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之底物的一部分與含有熒光部分之底物的一部分分開。
[0027]在本發(fā)明的第四方面中，提供了這樣的試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明第三方面的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶能夠切割熒光受調(diào)節(jié)之酶底物或通過修飾酶作用于底物而形成的底物之經(jīng)修飾形式，其中切割底物或經(jīng)修飾底物將含有熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之底物的一部分與含有熒光部分之底物的一部分分開。
[0028]附圖簡述
[0029]圖1.示意性地舉例說明了用于測定脫亞氨酶類之酶的熒光壽命方法的一個實(shí)例。所述方法的這個具體實(shí)例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0030]圖2.示出為了測定PAD4脫亞氨酶活性而合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0031]圖3.示出在PAD4測定緩沖液中肽I~3隨時間的熒光壽命測量數(shù)據(jù)。
[0032]圖4.舉例說明了肽I~3及其瓜氨酸化類似物的胰蛋白酶切割。將每種肽與不同濃度的胰蛋白酶(圖例中示出)一起孵育并隨時間監(jiān)測熒光壽命:(A)肽I ; (B)肽2 ; (C)肽3。(D)在與5nM胰蛋白酶孵育后瓜氨酸化形式的肽I~3的熒光壽命。瓜氨酸化類似物包括以瓜氨酸替換精氨酸的肽序列I~3。
[0033]圖5.測定緩沖液中PAD4肽底物與相應(yīng)瓜氨酸化產(chǎn)物的1:1混合物的RP-HPLC譜:(A)肽I ;⑶肽2 ; (C)肽3。注意:Arg =包含精氨酸的肽；Cit =包含瓜氨酸的肽。
[0034]圖6.以規(guī)律的間隔從包含肽I作為底物的PAD4測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘； (B) t = 30 分鐘；(C) t = 60 分鐘。
[0035]圖7.以規(guī)律的間隔從包含肽2作為底物的PAD4測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 30 分鐘；(C) t = 60 分鐘。
[0036]圖8.以規(guī)律的間隔從包含肽3作為底物的PAD4測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 30 分鐘；(C) t = 60 分鐘。
[0037]圖9.肽I作為底物之PAD4測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽主峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) t = O 分鐘，tE = 14.3 分鐘；(B) t = 60 分鐘，tE = 14.6 分鐘。
[0038]圖10.肽3作為底物之PAD4測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽主峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) t = O 分鐘，tK = 13.8 分鐘；(B) t = 60 分鐘，tK = 13.9 分鐘。
[0039]圖11.在與胰蛋白酶孵育之前和之后PAD4測定混合物熒光壽命的比較。包括無酶對照(減去PAD4)用于比較。
[0040]圖12.肽I作為底物的PAD4測定時間過程。㈧添加IOnM胰蛋白酶之前的熒光壽命；(B)與IOnM胰蛋白酶在室溫下孵育10分鐘之后的熒光壽命。
[0041]圖13.示意性地舉例說明了用于測定蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)和蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)的熒光壽命方法的實(shí)例。所述方法的這些實(shí)例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0042]圖14.示出為了測定G9a甲基轉(zhuǎn)移酶活性所合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0043]圖15.評價了基于G9a熒光壽命的蛋白酶保護(hù)測定中作為底物的肽4~9。
[0044]圖16.肽4和9作為底物的G9a熒光壽命(FLT)蛋白酶保護(hù)測定。㈧在添加Endo-LysC蛋白酶之前作為G9a濃度之函數(shù)的FLT。(B)在與Endo-LysC孵育10分鐘后作為G9a濃度之函數(shù)的FLT。(C)在與Endo-LysC孵育60分鐘后作為G9a濃度之函數(shù)的FLT。(D)和(E)如同(B)和(C)，但是為了清楚起見擴(kuò)展X軸并且包括未切割肽對照以證明蛋白酶保護(hù)的程度。
[0045]圖17.在以下間隔從包含肽4作為底物的G9a測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 6 小時。
[0046]圖18.在以下間隔從包含肽9作為底物的G9a測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 6 小時。
[0047]圖19.肽4作為底物之G9a測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) t = O 分鐘，tE = 21.4 分鐘；(B) t = 6 小時，tE = 24.3 分鐘。
[0048]圖20.肽9作為底物之G9a測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) t = O 分鐘，tE = 19.6 分鐘；(B) t = 6 小時，tE = 19.5 分鐘。
[0049]圖21.使用作為底物之肽4和不同濃度之G9a的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之后。
[0050]圖22.使用作為底物之肽9和不同濃度之G9a的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之后。
[0051]圖23.對于使用肽4和9作為底物進(jìn)行的FLT G9a蛋白酶保護(hù)測定的作為SAM濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0052]圖24.對于使用肽4和9作為底物進(jìn)行的FLT G9a蛋白酶保護(hù)測定的作為抑制劑濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0053]圖25.示意性地舉例說明了用于測定蛋白質(zhì)賴氨酸脫甲基酶(PKDM)和蛋白質(zhì)精氨酸脫甲基酶(PRDM)的熒光壽命方法的實(shí)例。所述方法的這些具體實(shí)例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0054]圖26.示出了用于測定作用于賴氨酸-36的JHDMlA賴氨酸脫甲基酶的基于H3N端尾區(qū)序列的熒光壽命底物。
[0055]圖27.示意性地舉例說明了用于測定組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的熒光壽命方法的實(shí)例。所述方法的這一具體實(shí)例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0056]圖28.示出了用于測定使賴氨酸-14乙?；瓾AT酶的基于H3N端尾區(qū)序列的建議的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0057]圖29.示意性地舉例說明了用于測定組蛋白脫乙酰酶的熒光壽命方法的實(shí)例。所述方法的這一具體實(shí)例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0058]圖30.不出了用于通過FLT 蛋白酶保護(hù)法(FLT protease protection approach)測定HDAC的所建議的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。Xaa =任意氨基酸。
[0059]圖31.以規(guī)律的間隔從包含肽I作為底物的PAD2測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 30 分鐘；(C) t = 120 分鐘。
[0060]圖32.肽I作為底物之PAD2測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽主峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) t = O 分鐘，tE = 14.4 分鐘；(B) t = 120 分鐘，tE = 14.7 分鐘。[0061]圖33.在與胰蛋白酶孵育之后PAD2測定混合物的熒光壽命測量。包括僅有肽的對照用于比較。
[0062]圖34.肽I作為底物的PAD2測定時間過程。
[0063]圖35.在與Endo-LysC孵育后肽10作為底物的JHDMlA測定混合物的熒光壽命測量。包括僅有肽的對照用于比較。
[0064]圖36.以規(guī)律的間隔從包含肽12作為底物之Set7/9測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC譜的疊加。(a) t = O小時；(b) t = 2小時；(c) t = 6小時。
[0065]圖37.肽12作為底物之Set7/9測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽主峰的電噴霧質(zhì)譜。(A)t = O小時，tK = 18.3分鐘；(B)t = 6小時，tK = 18.4分鐘。
[0066]圖38.在與Endo-LysC孵育后Set7/9測定混合物的熒光壽命測量。包括僅有肽的對照用于比較。
[0067]圖39.使用作為底物之肽12和不同濃度之Set7/9的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之后。
[0068]圖40.使用作為底物之肽13和不同濃度之Set7/9的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之后。
[0069]圖41.對于使用肽13作為底物進(jìn)行的FLT Set7/9蛋白酶保護(hù)測定的作為SAM濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0070]圖42.對于使用肽13作為底物進(jìn)行的FLT Set7/9蛋白酶保護(hù)測定的作為SAH抑制劑濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0071]圖43.對于使用肽13作為底物進(jìn)行的FLT Set7/9蛋白酶保護(hù)測定的V -因子。
[0072]圖44.示出了為了測定Set7/9甲基轉(zhuǎn)移酶活性所合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0073]圖45.通過不同濃度的Endo-ArgC切割肽15的相對于時間的平均壽命。
[0074]圖46.以規(guī)律的間隔從包含肽15作為底物之PRMT5測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜的疊加。(a) t = O 小時；(b) t = 3.5 小時；(c) t = 17.5 小時。
[0075]圖47.包含肽15作為底物之PRMT5測定的RP-HPLC分析中的9AA標(biāo)記肽主峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) t = O小時，tE = 20.0分鐘；(B) t = 17.5小時，tE = 20.3分鐘。
[0076]圖48.在與Endo-ArgC孵育后PRMT5測定混合物的熒光壽命測量。包括僅有肽的對照用于比較。
[0077]圖49.使用作為底物之肽15和不同濃度之PRMT5的測定時間過程。㈧在用
1.25nM Endo-ArgC 切割之前；(B)在用 1.25nM Endo-ArgC 切割之后。
[0078]圖50.示出了為了測定PRMT5甲基轉(zhuǎn)移酶活性所合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0079]圖51.對于使用肽15作為底物進(jìn)行的PRMT5FLT蛋白酶保護(hù)測定的作為西奈芬凈(sinefungin)抑制劑濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0080]圖52.用Endo-LysC切割肽16的相對于時間的平均壽命。
[0081]圖53.示出了為了測定PCAF乙酰轉(zhuǎn)移酶活性所合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0082]圖54.用Endo-LysC切割肽17的相對于時間的平均壽命。
[0083]圖55.在(A) O分鐘、(B) 30分鐘、(C) 60分鐘、(D) 90分鐘間隔從包含肽17作為底物的PCAF測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC譜。
[0084]圖56.肽17作為底物之pCAF測定的RP-HPLC分析中的峰的電噴霧質(zhì)譜。(A) tE=16.1 分鐘；(B) tE = 16.7 分鐘。
[0085]圖57.使用作為底物之肽17和不同濃度之PCAF的測定時間過程。㈧在用25nMEndo-LysC切割之前；(B)在用25nM Endo-LysC切割之后。
[0086]圖58.測定用于使用肽17作為底物的PCAF FLT蛋白酶保護(hù)測定的AcCoA的Km (app)。
[0087]圖59.示出了為了測定HDACl脫乙酰酶活性所合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0088]圖60.脫乙酰化的產(chǎn)物肽。
[0089]圖61.用不同濃度的胰蛋白酶切割肽18⑷和肽19⑶的相對于時間的平均壽
命O
[0090]圖62.以規(guī)律的間隔從包含肽18作為底物之HDACl測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC譜的疊加。
[0091]圖63.在室溫下孵育2小時后肽18之HDACl測定的RP-HPLC分析中的峰的電噴霧質(zhì)譜。㈧tK = 19.1分鐘；⑶tK = 21.2分鐘。
[0092]圖64.使用作為底物之肽18和不同濃度之HDACl的測定時間過程。㈧在用IOnM胰蛋白酶切割之前；(B)在用IOnM胰蛋白酶切割之后。
[0093]圖65.確定使用肽18作為底物的HDAC1FLT蛋白酶保護(hù)測定的底物KM。
[0094]圖66.使用肽18作為 底物進(jìn)行的HDAC1FLT蛋白酶保護(hù)測定的作為TSA抑制劑濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0095]圖67.對于使用肽18作為底物進(jìn)行的HDAC1FLT蛋白酶保護(hù)測定的V -因子。
[0096]圖68.示出了為了測定EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶活性所合成的熒光受調(diào)節(jié)之肽底物。
[0097]圖69.用不同濃度的Endo-LysC切割肽20的相對于時間的平均壽命。
[0098]圖70.使用作為底物之肽20和不同濃度之EZH2復(fù)合體的測定時間過程。
[0099]圖71.確定用于使用肽20作為底物的EZH2FLT蛋白酶保護(hù)測定的SAM的KM(app)。
[0100]圖72.使用肽20作為底物進(jìn)行的EZH2FLT蛋白酶保護(hù)測定的作為SAH抑制劑濃度之函數(shù)的平均壽命。
[0101]圖73.確定PAD4FLT蛋白酶保護(hù)測定中肽I的底物KM。
[0102]圖74.對于使用肽I作為底物進(jìn)行的PAD4FLT蛋白酶保護(hù)測定的V -因子。
[0103]圖75.對于使用肽9作為底物進(jìn)行的G9a FLT蛋白酶保護(hù)測定的V -因子。
[0104]發(fā)明詳述
[0105]本文中提供了用于測定酶(本文中是指修飾酶)活性的方法，其基于檢測與修飾酶底物相連接之熒光部分的熒光壽命的變化。
[0106]所述方法包括:首先使已知包含或懷疑包含修飾酶的受試樣品與底物相接觸，所述底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經(jīng)修飾底物。底物和通過修飾酶作用于底物而形成的經(jīng)修飾底物的結(jié)構(gòu)不同，使得底物和經(jīng)修飾底物的一種或另一種(但不是兩種)在位于熒光部分與壽命調(diào)節(jié)劑部分之間的切割位點(diǎn)上可被第二種酶切割，而另一種在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間的任何位置處都被保護(hù)而免于被第二種酶切割。因此可通過測定第二種酶對經(jīng)修飾底物和/或形成經(jīng)修飾底物之底物的作用來確定通過修飾酶作用于底物而形成經(jīng)修飾底物形成。
[0107]本文使用的術(shù)語“受試樣品”簡單地指待測試修飾酶之活性的任何樣品。這可以例如是合適液體介質(zhì)中酶的純樣品或半純樣品，例如酶緩沖液；或者它可以指待測試酶活性的生物樣品，例如，患者材料的臨床樣品。
[0108]使底物和通過修飾酶作用于底物而形成的經(jīng)修飾底物與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合。在熒光部分連接位點(diǎn)與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分連接位點(diǎn)之間的切割位點(diǎn)上通過第二種酶切割底物或經(jīng)修飾底物將底物分成至少兩部分；包括包含熒光部分的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的第二部分，使得調(diào)節(jié)劑部分不再調(diào)節(jié)熒光部分的熒光壽命。因此，測定的最終示值讀數(shù)(read out)是基于測量熒光部分的熒光壽命，其為第二種酶對經(jīng)修飾底物(或底物)的作用提供了指示，進(jìn)而為通過修飾酶作用于底物而形成經(jīng)修飾底物提供指示。
[0109]術(shù)語“修飾酶”指能夠修飾底物以形成經(jīng)修飾底物的任何酶，所述經(jīng)修飾底物的結(jié)構(gòu)不同使得底物和經(jīng)修飾底物的一種或另一種(但不是兩種)在位于熒光部分與壽命調(diào)節(jié)劑部分之間的切割位點(diǎn)上可通過第二種酶的作用而被切割，而另一種在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間的任何位置處都被保護(hù)而免于被第二種酶切割。修飾酶通常是能夠修飾肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶，例如催化蛋白質(zhì)或肽翻譯后修飾的酶。在本文中詳細(xì)描述的一些具體實(shí)施方案中，修飾酶可選自蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶、脫亞氨酶、蛋白質(zhì)脫甲基酶和蛋白質(zhì)脫乙酰酶。更具體地，本文中所述的測定方法在一般情況下可用于測定催化組蛋白翻譯后修飾之酶的活性，這樣的酶是表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域中的重要靶標(biāo)。因此，在一些具體實(shí)施方案中，修飾酶可屬于以下酶類之一:組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)、組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)、組蛋白脫甲基酶(特別是組蛋白-賴氨酸脫甲基酶(KDM)和組蛋白-精氨酸脫甲基酶)、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。
[0110]底物包含與熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分二者綴合的接頭分子。配置熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分使得熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分可調(diào)節(jié)熒光部分的熒光壽命。因此，底物在本文中可稱為“熒光受調(diào)節(jié)之底物”或“熒光受調(diào)節(jié)之酶底物”，這些術(shù)語可互換使用。
[0111]本文使用的術(shù)語“熒光部分”是指與熒光受調(diào)節(jié)之酶底物綴合的熒光標(biāo)記。
[0112]因?yàn)楸疚闹兴龅臏y定使用基于熒光部分之熒光壽命變化的示值讀數(shù)，所以為了提高測定的動態(tài)范圍，選擇表現(xiàn)出長熒光壽命(在不存在任何壽命調(diào)節(jié)的情況下)的熒光部分可以是有利的，所述長熒光壽命通常大于IOns并且優(yōu)選在IOns至25ns的范圍內(nèi)。在本文的上下文中，“熒光壽命”定義為熒光團(tuán)從激發(fā)態(tài)衰減至基態(tài)所耗費(fèi)的平均時間。但是，使用表現(xiàn)出較短熒光壽命的熒光部分也明確地涵蓋在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0113]優(yōu)選的熒光部分包括但不限于:9_氨基吖啶及其衍生物，如W02007/049057所述(通過引用并入本文)；吖啶酮衍生物和喹吖啶酮衍生物，包括吖啶酮和喹吖啶酮化合物；以及使有技能的讀者導(dǎo)向的US7，727，739B2、W002/099432和W003/089663 (通過引用并入本文)中所述的另一些突光部分；B丫唳和B丫聢織| (acridinium)部分；得自于AssayMetricsLimited的Puretime?系列染料；如W002/081509 (通過引用并入本文)所述的p惡嗪(例如MR121、JA242、JA243)和羅丹明衍生物(例如JA165、JA167、JA169)。另一些實(shí)例(如W002/056670 所述)包括但不限于 Cy5、Cy5.5 和 Cy7 (Amersham) ；IRD41 和 IRD700 (Licor)；NIR-1 和 IC5_0Su(Dojindo) ；Alexa fluor660&Alexa fluor680(Molecular Probes)；LaJolla Blue (Diatron) ;FAR_Blue、FAR-Green One&FAR-Green Two (Innosense)；ADS790-NS 和 ADS821-NS (American Dye Source);親青綠(indocyanine green) (ICG)及其類似物(美國專利N0.5, 968, 479)；卩引哚三碳菁(indotricarbocyanine) (ITC,W098/47538);熒光量子點(diǎn)(硫化鋅包裹的硒化鎘納米晶體-QuantumDot Corp.)和螯合鑭系化合物(熒光鑭系金屬包括銪和鋱)。該列表旨在舉例說明而不是限制。
[0114]本文使用的術(shù)語“熒光壽命調(diào)節(jié)劑”意指當(dāng)與熒光部分一起存在于熒光受調(diào)節(jié)之酶底物中時能夠改變熒光部分之熒光壽命的化合物、綴合物或部分。這種熒光調(diào)節(jié)的機(jī)制可以是但不限于:能量轉(zhuǎn)移、電子轉(zhuǎn)移或分子相互作用或其組合。優(yōu)選的熒光壽命調(diào)節(jié)劑包括但不限于:吲哚基部分及其衍生物，包括氨基酸色氨酸側(cè)鏈中存在的吲哚基部分；酚部分及其衍生物，包括氨基酸酪氨酸側(cè)鏈中存在的酚部分；咪唑部分及其衍生物，包括氨基酸組氨酸側(cè)鏈中存在的咪唑部分；芐基部分及其衍生物，包括氨基酸苯丙氨酸的芐基側(cè)鏈；苯氧基部分；萘基部分及其衍生物；萘基丙氨酸部分；咔唑部分和吩噻嗪部分。該列表旨在舉例說明而不是限制。
[0115]選擇熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)部分使得與熒光壽命調(diào)節(jié)劑不存在時相比，在熒光壽命調(diào)節(jié)劑存在下熒光部分的熒光壽命降低。與熒光壽命調(diào)節(jié)劑不存在時相比，優(yōu)選在熒光壽命調(diào)節(jié)劑存在下熒光部分的熒光壽命改變，并且更優(yōu)選降低至少0.1ns，至少0.5ns,更優(yōu)選至少2ns,更更優(yōu)選至少5ns,或至少10ns。調(diào)節(jié)作用取決于突光受調(diào)節(jié)之酶底物中熒光部分與調(diào)節(jié)劑的鄰近和空間定向。沒有明確需要熒光壽命調(diào)節(jié)劑的吸收光譜與熒光部分的發(fā)射光譜重疊。相比之下，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過程不僅需要供體部分與受體部分之間鄰近，還需要受體部分的吸收光譜與供體部分的發(fā)射光譜之間的光譜重疊。
[0116]顯著的調(diào)節(jié)作用(例如，熒光部分的熒光壽命改變5ns或更大)是酶測定動態(tài)范圍的重要決定因素。在這一點(diǎn)上，調(diào)節(jié)程度(即當(dāng)調(diào)節(jié)劑存在時熒光部分熒光壽命改變的幅度)可比熒光部分熒光壽命的絕對長度更為重要。因此，如果選擇熒光部分/調(diào)節(jié)劑的組合使得調(diào)節(jié)劑部分使熒光部分的熒光壽命縮短非常大的程度，(例如，由于調(diào)節(jié)而產(chǎn)生至少2ns的差異)，則熒光部分之熒光壽命的絕對長度可能不是至關(guān)重要的。因此，如果當(dāng)調(diào)節(jié)不存在下表現(xiàn)出相對“短的”突光壽命的熒光部分(例如，小于10ns，或小于5ns)和調(diào)節(jié)劑二者均與接頭綴合時所選擇的調(diào)節(jié)劑引起熒光壽命顯著降低(例如，2ns或更多)，則所述熒光部分仍然可被用于熒 光受調(diào)節(jié)之底物。
[0117]但是，因?yàn)橛蔁晒饣衔镂膸?、自發(fā)熒光或內(nèi)濾效應(yīng)產(chǎn)生的熒光測定中的背景干擾通常具有約5ns或更小的短壽命，所以使用熒光壽命長(> IOns)的熒光團(tuán)可具有優(yōu)點(diǎn)。的確，與基于突光強(qiáng)度的方法(例如但不限于FRET和突光偏振)相比,基于突光部分之壽命來區(qū)分這種背景干擾與化合物干擾的能力在該領(lǐng)域中可看作是該技術(shù)的一個關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)。與通常不可能區(qū)分的熒光壽命短的熒光團(tuán)相比，熒光壽命長的熒光團(tuán)有助于背景熒光與化合物干擾的這種區(qū)分。
[0118]選擇用于包含在熒光受調(diào)節(jié)之底物中的熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)部分的合適組合使得熒光部分的熒光壽命在熒光壽命調(diào)節(jié)劑存在下降低。當(dāng)選擇適當(dāng)組合時，強(qiáng)調(diào)對于熒光壽命調(diào)節(jié)劑的吸收光譜與熒光部分的發(fā)射光譜重疊沒有明確需要。如果對于具體的酶測定合適，則熒光受調(diào)節(jié)之底物可包含多于一種的熒光部分和/或多于一種的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分。
[0119]用于包含在熒光受調(diào)節(jié)之酶底物中的熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的優(yōu)選組合包括但不限于:熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分(特別是色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈)、熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調(diào)節(jié)劑部分萘基丙氨酸或其衍生物、熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調(diào)節(jié)劑部分咔唑部分或其衍生物、以及熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調(diào)節(jié)劑部分吩噻嗪或其衍生物。另一些合適的組合包括熒光部分吖啶酮或其衍生物和調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分(特別是色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈)，并且還包括熒光部分喹吖啶酮或其衍生物和調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分(特別是色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈)。已表明基于吖啶酮的熒光團(tuán)的熒光壽命受色氨酸殘基之吲哚基側(cè)鏈的調(diào)節(jié)(W003/089663 ；Hassiepien,U 等.Screening.第 4 卷，2009,11 ;Doering，K.等.J Biomol.Screen.,2009,14，I)。所列組合中的任何一種可包含在本文中所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物(包括以下定義的基于結(jié)構(gòu)的特定底物)中的任何一種中。為了避免疑問，明確地指出前述章節(jié)中所述的熒光部分/調(diào)節(jié)劑部分的組合可對應(yīng)于下文中使用的結(jié)構(gòu)定義中的部分Fl和M。
[0120]熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的接頭分子組分用來使熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分以適當(dāng)構(gòu)造定位以實(shí)現(xiàn)熒光部分之熒光壽命的有效調(diào)節(jié)。接頭分子也可以是修飾酶修飾熒光受調(diào)節(jié)之酶底物以形成經(jīng)修飾底物的位點(diǎn)。
[0121]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，底物的接頭分子組分是可通過修飾酶作用進(jìn)行修飾以形成經(jīng)修飾肽的肽接頭。在其中底物的接頭分子組分是肽接頭的一些實(shí)施方案中，由修飾酶作用產(chǎn)生的經(jīng)修飾形式可稱為“經(jīng)修飾肽接頭”。肽接頭可包含通過修飾酶之作用而修飾的至少一個氨基酸殘基。如以下詳細(xì)描述的，可通過修飾酶催化的肽修飾類型包括但不限于甲基化、脫甲基化、乙?；?、脫乙?；兔搧啺被?。
[0122]通過修飾酶之作用而修飾的肽接頭內(nèi)的氨基酸殘基一般存在于形成第二種酶(通常是蛋白酶)之識別位點(diǎn)的氨基酸序列環(huán)境中。定位第二種酶的識別位點(diǎn)使得切割發(fā)生在熒光部分和肽接頭之連接位點(diǎn)與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分和肽接頭之連接位點(diǎn)之間，使得在(底物或經(jīng)修飾底物中的)切割位點(diǎn)處肽接頭的切割將熒光受調(diào)節(jié)之酶底物(或經(jīng)修飾底物)分成包含熒光部分的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的第二部分。該分離的結(jié)果是，熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分不再調(diào)節(jié)熒光部分的熒光壽命，從而可觀察到熒光部分的熒光壽命提聞。
[0123]包含肽接頭的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物通常符合以下一般結(jié)構(gòu):
[0124]Fl-Xnl-N-Xn2-M 或結(jié)構(gòu) M-Xnl-N-Xn2-Fl，其中 Fl 和 M 的定向相反。
[0125]其中Xnl表示一個或更多個第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與Xnl (或與Xn2,如果Fl和M的定向相反)綴合的熒光部分，N表示通過修飾酶之作用而修飾的氨基酸殘基，Xn2表示一個或更多個第二氨基酸序列，并且M表示與Xn2 (或與Xnl，如果Fl和M的定向相反)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。在用修飾酶處理之后，底物被轉(zhuǎn)化為由以下一般結(jié)構(gòu)表示的經(jīng)修飾底物:
[0126]Fl-Xnl-Nmod-Xn2-M 或 M-Xnl-Nnwd-Xn2-Fl
[0127]其中Nnwd表示殘基N的經(jīng)修飾衍生物。
[0128]熒光部分Fl與Xnl “綴合”，同時熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分M與Xn2 “綴合”，或者如果Fl與M相對于殘基N的位置相反則反之亦然?；疽笫荈l和M在底物切割后被分開。因此，術(shù)語“綴合”意指Fl可在由Xnl表示的氨基酸序列的任何部分內(nèi)與底物的肽接頭相連接，并且M可在由Xn2表示的氨基酸序列的任何部分內(nèi)與底物的肽接頭相連接，或者反之亦然。雖然包括這樣的結(jié)構(gòu)，但是并不旨在將底物結(jié)構(gòu)限制于其中Fl和M與肽接頭的C端和N端、殘基相連接的實(shí)施方案。Fl和M也可與Xnl或Xn2內(nèi)的內(nèi)部氨基酸殘基相連接。也可通過Xn2(當(dāng)位置相反時為Xnl)中的氨基酸殘基側(cè)鏈提供熒光壽命調(diào)節(jié)劑M，其可以是肽接頭的內(nèi)部殘基或C端殘基或N端殘基。例如，可通過合并到Xnl或Xn2中的色氨酸、酪氨酸、組氨酸或苯丙氨酸殘基的吲哚基、酚、咪唑和芐基側(cè)鏈來提供M。這種Fl和M定位的定義/解釋應(yīng)適用于以下詳細(xì)描述的底物的所有具體實(shí)施方案。
[0129]選擇Xnl和Xn2使得最終結(jié)構(gòu)Xnl-N-Xn2為修飾酶修飾殘基N提供適當(dāng)?shù)男蛄协h(huán)境。如果修飾酶的活性具有高度序列依賴性，則其可適用于Xnl-N-Xn2的整個氨基酸序列，從而模擬修飾酶之天然底物的一部分的氨基酸序列。例如，如果修飾酶的天然底物是組蛋白，則Xnl-N-Xn2可模擬通過修飾酶之作用而修飾的氨基酸殘基周圍的組蛋白的短肽片段的序列。
[0130]另外，重要的是，序列Xnl-N-Xn2或經(jīng)修飾形式Xnl-Nnwd-Xn2 (但不是二者)形成底物以在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間被第二種酶切割。在基于使用肽接頭的一些實(shí)施方案中，所述第二種酶通常是蛋白酶。本領(lǐng)域中可使用底物特異性不同的多種蛋白酶。因此，可選擇蛋白酶以匹配修飾酶催化的修飾的性質(zhì)。對于正確操作測定至關(guān)重要的是，接頭由不被第二種酶切割的形式轉(zhuǎn)化為被第二種酶切割的形式(或反之亦然)僅取決于修飾酶的活性。因此，必須確保接頭在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間不包含允許第二種酶以不依賴于對殘基N之修飾的方式切割接頭的任何位點(diǎn)，以確保Fl與M通過接頭切割的分開關(guān)鍵取決于殘基N的修飾。不排除第二種酶可在底物或經(jīng)修飾底物中其他地方的第二切割位點(diǎn)切割，其中在第二位點(diǎn)處的底物切割不依賴于底物的修飾。如果該第二位點(diǎn)處的切害I]王導(dǎo)致熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分分開，則可允許在不依賴于底物修飾的第二位點(diǎn)處切割。例如，圖2所示的底物在位于發(fā)揮熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分作用的色氨酸殘基(色氨酸的吲哚基側(cè)鏈)與肽C端之間的賴氨酸殘基處對胰蛋白酶的切割敏感。
[0131]由Xnl-N-Xn2表示的氨基酸殘基一起構(gòu)成底物的肽接頭組分。肽接頭首先可由通過常規(guī)肽鍵連接的氨基酸殘基形成。氨基酸殘基自身可以是天然氨基酸殘基或非天然氨基酸殘基或其混合物。顯而易見地，要求是由N表示的氨基酸殘基可通過修飾酶的作用而修飾，但是也允許另一些氨基酸殘基的修飾，前提是底物仍然對殘基N處的修飾敏感。還可允許包含一個或更多個非肽鍵，前提是底物或經(jīng)修飾底物中的肽接頭仍然可被第二種酶(例如，蛋白酶)切割。
[0132]另一個重要的要求是，在熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的整體結(jié)構(gòu)中使熒光部分Fl和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分M維持為適當(dāng)?shù)目臻g構(gòu)型以實(shí)現(xiàn)部分M對部分Fl之熒光壽命的有效調(diào)節(jié)。通常，F(xiàn)l和M 二者通過直接共價連接與肽接頭(Xnl-N-Xn2)相連接。W02007/049057 (通過引用并入本文)中描述了用于使突光部分與肽直接共價連接的合適方法。BioconjugateTechniques, G.T.Hermanson, Academic Press (1996)(其通過引用并入本文)中描述了將熒光部分與蛋白質(zhì)和肽相連接的另一些方法。
[0133]在其中通過合并到Xnl或Xn2中的色氨酸、酪氨酸、組氨酸或苯丙氨酸殘基的吲哚基、酚、咪唑和芐基側(cè)鏈提供熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的實(shí)施方案中，發(fā)揮充當(dāng)調(diào)節(jié)劑M之側(cè)鏈作用的氨基酸殘基自身可形成由Xn2 (或Xnl，在其中Fl與M的位置相反的實(shí)施方案中)表示的氨基酸序列的一部分。因此充當(dāng)熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的氨基酸殘基可通過共價肽鍵與肽接頭的其余部分相連接。
[0134]本文中所述測定平臺的具體優(yōu)點(diǎn)在于，由Xnl-N-Xn2表示的肽接頭的氨基酸序列可適合于多種不同的目的修飾酶，而基于FLT檢測之測定的一般原則仍然為所有測定所共用。
[0135]可采用常規(guī)檢測方法來測量熒光壽命和熒光強(qiáng)度。這些方法包括使用光電倍增管(photomultiplier tube)作為檢測裝置的儀器。使用這些方法可以有數(shù)種途徑；例如:
[0136]i)基于時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)的方法(參見Principles of FluorescenceSpectroscopy,(第 4章)J R Lakowicz 編，第二版，1999, Kluwer/Academic Press)；
[0137]ii)基于頻域/相位調(diào)制的方法(參見Principles of FluorescenceSpectroscopy,(第 5 章)J R Lakowicz 編，第二版，1999, Kluwer/Academic Press);以及
[0138]iii)基于時閘(time gating)的方法(參見 Sanders 等,(1995)AnalyticalBiochemistry,227(2)，302-308)。
[0139]用于測量突光壽命的合適裝置是Edinburgh Instruments FLS920突光計(jì)和采用時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法的Edinburgh Instruments NanoTaurus?突光壽命讀板器(Edinburgh Instruments, UK),以及還有利用時閘的 IOM Nanoscan。
[0140]可通過電荷稱合裝置(charge coupled device,CO))成像儀(例如掃描成像儀或面積型成像儀)進(jìn)行熒光密度/熒光壽命的測量，以使多孔板中的所有孔成像。
[0141]通過熒光部分熒光壽命的變化來報道測定方法的示值讀數(shù)。在某些實(shí)施方案中，測定可基于測量平均熒光壽命，它是存在的所有熒光物質(zhì)(即熒光受調(diào)節(jié)之底物，和通過修飾酶作用于底物而形成的經(jīng)修飾底物，加上當(dāng)熒光受調(diào)節(jié)之底物或經(jīng)修飾底物被第二種酶(例如，蛋白酶)切割后所產(chǎn)生的熒光產(chǎn)物)的熒光壽命的組合。
[0142]應(yīng)理解，經(jīng)修飾底物(通過熒光受調(diào)節(jié)之底物的修飾酶作用形成)中熒光部分的熒光壽命長度與衍生其的熒光受調(diào)節(jié)之底物中熒光部分的熒光壽命長度基本上相同，原因是由修飾酶催化的修飾(例如，甲基化、乙?；?、脫甲基化、脫乙?；?、脫亞氨化)一般不顯著改變熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的定向，并因此不顯著改變熒光壽命調(diào)節(jié)的程度。在熒光受調(diào)節(jié)之底物和經(jīng)修飾底物二者中的熒光部分的熒光壽命都受調(diào)節(jié)。僅當(dāng)熒光受調(diào)節(jié)之底物或經(jīng)修飾底物發(fā)生切割，使與熒光部分綴合的底物部分與與熒光壽命調(diào)節(jié)劑綴合的底物部分分開，破壞調(diào)節(jié)后，才可檢測到熒光壽命的變化。與熒光部分綴合的底物的切割部分表現(xiàn)出的熒光壽命比熒光受調(diào)節(jié)之底物更長。
[0143]因此，平均熒光壽命測量根據(jù)由于調(diào)節(jié)而表現(xiàn)出“縮短”熒光壽命的熒光物質(zhì)(熒光受調(diào)節(jié)之底物加上經(jīng)修飾底物)與表現(xiàn)出較長(未經(jīng)調(diào)節(jié))熒光壽命的熒光物質(zhì)(與熒光部分綴合的被切割的底物部分)的相對比例改變而改變。用第二種酶處理后存在的“短”與“長”壽命熒光物質(zhì)的相對比例與添加第二種酶時存在的“可切割的”熒光受調(diào)節(jié)之底物(或經(jīng)修飾底物)直接相關(guān)。因此，它也與修飾酶的活性直接相關(guān)。當(dāng)提及熒光壽命測量時，術(shù)語“長”和“短”是相對術(shù)語，指在不調(diào)節(jié)時和在熒光壽命調(diào)節(jié)劑存在下受調(diào)節(jié)時相同熒光部分的熒光壽命，并且不表示具體的絕對值。
[0144]在時間過程測定中，可觀察到與未經(jīng)修飾底物相比，平均熒光壽命對應(yīng)于100%未經(jīng)修飾底物的t = O測量值隨時間提高或降低，這取決于經(jīng)修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護(hù)而免于被其切割。在終點(diǎn)測定中，與未經(jīng)修飾底物相比，終點(diǎn)的平均壽命測量值可高于或低于對應(yīng)于100%未經(jīng)修飾底物的基線測量值，這取決于經(jīng)修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護(hù)而免于被其切割。[0145]作為測量平均壽命的替代方法，測定也可基于對特定組分之特征性熒光壽命的測量。例如，可選擇僅測量存在的“長”熒光壽命組分的量。因?yàn)殚L熒光壽命是其中熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分分開之切割產(chǎn)物的特征，所以該測量可以與存在的經(jīng)切割底物的量(以濃度為單位)直接相關(guān)。在時間過程測定中，可觀察到存在的長壽命特征性組分(即與熒光部分綴合的切割產(chǎn)物)的絕對量相對于100%未經(jīng)修飾底物的t = O測量值隨時間提高或降低，這取決于經(jīng)修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護(hù)而免于被其切割。在終點(diǎn)測定中，存在的長壽命特征性組分(即與熒光部分綴合的切割產(chǎn)物)的絕對量可高于或低于對應(yīng)于100%未經(jīng)修飾底物的基線測量值，這取決于與未經(jīng)修飾底物相比經(jīng)修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護(hù)而免于被其切割。
[0146]熒光壽命測量提供了超越僅基于定量熒光強(qiáng)度之常規(guī)熒光技術(shù)的顯著優(yōu)勢。熒光壽命由相同光譜解析的強(qiáng)度信號確定，但是也另外地在時間域(temporal domain)中解析。該固有的熒光性質(zhì)不取決于探針濃度和體積，并且不受自發(fā)熒光、光散射和內(nèi)濾效應(yīng)以及光漂白所影響。因此，該方法的固有性質(zhì)應(yīng)導(dǎo)致靈敏度更好的、更穩(wěn)健的測定并且使來自熒光化合物庫的背景干擾能夠盡可能小，導(dǎo)致藥物篩選應(yīng)用中的假陽性更少。
[0147]現(xiàn)在經(jīng)更詳細(xì)地描述測定的一些非限制性實(shí)施方案:
[0148](A)基于蛋白酶保護(hù)的測定
[0149]測定的第一組實(shí)施方案基于使用這樣的底物，其包含與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合的肽接頭分子，所述肽通過修飾酶的作用而修飾形成經(jīng)修飾肽，其中_中的肽能夠被第二種酶(即，蛋白酶)切割，并且修飾酶對肽的修飾保護(hù)經(jīng)修飾肽在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間免于被第二種酶(例如，蛋白酶)切割。在這樣的實(shí)施方案中，底逾在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間對第二種酶(蛋白酶)的切割敏感，底物的切割使得熒光部分的熒光壽命提高，但是通過修飾酶作用于底物而形成的經(jīng)修飾底物在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間免于被第二種酶(蛋白酶)切割。因此，與未經(jīng)修飾肽相比，蛋白酶處理后熒光部分之熒光壽命的時間依賴性降低表明形成了經(jīng)修飾 肽(通過修飾酶作用于底物而形成)。
[0150]該測定的一些非限制性實(shí)施方案如下:
[0151](I)甲基轉(zhuǎn)移酶測定
[0152]在一個實(shí)施方案中，本文中所述測定方法可適用于測定甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0153]用于甲基轉(zhuǎn)移酶測定的底物包含肽接頭，并且可具有一般結(jié)構(gòu):
[0154]F1-X1-N1-X2-M (I)
[0155]其中Xl表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與Xl綴合的熒光部分，NI表示通過甲基轉(zhuǎn)移酶之作用而甲基化的氨基酸殘基，X2表示第二氨基酸序列并且M表示與X2綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。在用甲基轉(zhuǎn)移酶處理之后，底物轉(zhuǎn)化為由以下一般結(jié)構(gòu)表示的經(jīng)修飾(甲基化)底物:
[0156]Fl-Xl-Nl (Me)-X2-M (II)
[0157]其中NI (Me)表示殘基N上的甲基化。
[0158]應(yīng)理解,Fl和M實(shí)際上可以以任一定向存在。殘基NI通常是賴氨酸(在用于賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的測定的情況下)或精氨酸(在用于精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的測定的情況下)。
[0159]選擇氨基酸序列Xl和X2 二者以將殘基NI放置在甲基化的適當(dāng)序列環(huán)境中，并且為蛋白酶切割提供識別位點(diǎn)(未甲基化結(jié)構(gòu)(I)中)，而且還提供熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)的最佳定向以實(shí)現(xiàn)Fl突光壽命的有效調(diào)節(jié)。Xl和X2的序列可基于用于待測定甲基轉(zhuǎn)移酶之天然底物的序列。
[0160]應(yīng)理解，雖然為了有效調(diào)節(jié)熒光壽命，需要將熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)以適當(dāng)間隔定位，但是沒有必要使熒光部分(Fl)或熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)存在于肽接頭的末端(N端或C端)。因此，F(xiàn)l可與Xl中的氨基酸殘基相連接并且M可與X2中的氨基酸殘基相連接，或反之亦然。如果熒光壽命調(diào)節(jié)劑M自身由氨基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側(cè)鏈提供，則充當(dāng)調(diào)節(jié)劑M的氨基酸殘基自身可形成由X2表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列Xl和X2可包含天然或非天然氨基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0161]在基于精氨酸甲基化之測定的情況下，由N表示的精氨酸殘基根據(jù)所討論精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的活性可被單甲基化或二甲基化，后者為對稱構(gòu)型或不對稱構(gòu)型。甲基化的精確程度和二甲基化形式的構(gòu)型對于測定的性能并不重要，因此在精氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)可代表單甲基化、二甲基化形式中的任何一種。
[0162]在基于賴氨酸甲基化之測定的情況下，由N表示的賴氨酸殘基根據(jù)所討論賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的活性可被單、二或三甲基化。甲基化的精確程度和二甲基化或三甲基化形式的構(gòu)型對于測定的性能并不重要，因此在賴氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)可代表單、二或三甲基化形式中的任何一種。
[0163]在結(jié)構(gòu)⑴的底物中，熒光部分Fl (其優(yōu)選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的熒光部分)的熒光壽命受底物中熒光壽命調(diào)節(jié)劑M(M優(yōu)選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在鄰近殘基NI (例如，賴氨酸或精氨酸)處切割的蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(I)的底物將引起蛋白質(zhì)水解并且移除調(diào)節(jié)劑M對熒光壽命的調(diào)節(jié)。殘基NI (例如，賴氨酸或精氨酸)被適當(dāng)?shù)募谆D(zhuǎn)移酶甲基化后，用蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(II)的經(jīng)修飾肽不引起殘基NI后的切割并且熒光部分(Fl)的壽命仍受調(diào)節(jié)。在底物(I)持續(xù)轉(zhuǎn)化為經(jīng)修飾底物(II)的情況下，如在時間過程測定中，熒光部分(Fl)的熒光壽命將作為時間(以及甲基轉(zhuǎn)移酶的濃度)的函數(shù)而降低。熒光壽命相對于100%未經(jīng)修飾底物(I)的基線測量值的變化(降低)表明發(fā)生了底物(I)向經(jīng)修飾底物(II)的一些轉(zhuǎn)化。該變化的幅度可因此用于評價由甲基轉(zhuǎn)移酶之作用引起的底物(I)向經(jīng)修飾底物
(II)的轉(zhuǎn)化。
[0164]因此，本文中提供了一種測定蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶之活性的方法，其包括:
[0165](a)在允許熒光受調(diào)節(jié)之酶底物酶促轉(zhuǎn)化為通式(II)的經(jīng)修飾底物的條件下使受試樣品與通式(I)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物相接觸
[0166]F1-X1-N1-X2-M (I)
[0167]其中Xl表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與Xl綴合的熒光部分，NI表示通過甲基轉(zhuǎn)移酶之作用而甲基化的氨基酸殘基，X2表示第二氨基酸序列，并且M表示與X2綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑
[0168]F1-X1-N1 (Me)-X2-M (II)
[0169]其中N(Me)表示通過蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶之作用而對殘基N的甲基化；
[0170](b)使步驟(a)的產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基NI處切割通式(I)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(II)的經(jīng)修飾底物；以及
[0171](c)檢測熒光部分Fl之熒光壽命的變化，從而測定蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0172]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用于篩選蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。
[0173]附圖13中示意性地示出了通過熒光壽命蛋白質(zhì)保護(hù)途徑測定蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的方法的一個具體實(shí)施例，所述蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶將一個或更多個甲基轉(zhuǎn)移至肽/蛋白質(zhì)底物中的賴氨酸或精氨酸殘基。該實(shí)施例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。然而，應(yīng)理解，這些具體的熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分僅通過示例示出，并且可替換為本文中所述的替代性熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分。
[0174]上述的一般方法可適用于任何目的甲基轉(zhuǎn)移酶，包括在賴氨酸上甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶(統(tǒng)稱為PKMT)和在精氨酸上甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶(統(tǒng)稱為PRMT) 二者。在一些具體的實(shí)施方案中，測定可用于確定在賴氨酸或精氨酸上甲基化組蛋白之組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。所述方法可用于任何組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，包括屬于酶類EC2.1.1.43的所有組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶?？墒褂迷摲椒ㄟM(jìn)行測定的具體PKMT酶包括例如G9a、Set7/9、GLP 和 EZH2。
[0175]蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)中的甲基轉(zhuǎn)移到精氨酸殘基的胍基氮。PRMT基于它們催化對稱二甲基化還是非對稱二甲基化可劃分為兩種類型。H3特異性精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1/PRMT4屬于I型蛋白質(zhì)N-甲基轉(zhuǎn)移酶家族。合適的PRMT酶還包括例如PRMT1、PRMT3和PRMT5。所述測定方法可用于確定任何組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(包括屬于酶類EC2.1.1.125的任何組蛋白-精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶)的活性。
[0176]基于使用9-氨基吖啶(9AA)作為熒光部分和色氨酸(W)作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的用于代表性PKMT酶G9a的示例性底物包括以下:
[0177]肽4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0178]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0179]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0180]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0181]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
[0182]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2。
[0183]K9表示PKMT酶G9a作用的甲基化位點(diǎn)賴氨酸殘基并且模擬組蛋白H3內(nèi)發(fā)生賴氨酸甲基化形成G9a之天然底物的序列環(huán)境。
[0184]基于使用9-氨基吖啶(9AA)作為熒光部分和色氨酸(W)作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的用于代表性PKMT酶Set7/9的示例性底物包括以下:
[οι 85]肽 12:wartk4qtark (9AA) stggkaprkqlak-conh2
[0186]肽13:wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0187]K4表示PKMT酶Set7/9作用之甲基化位點(diǎn)的賴氨酸殘基并且模擬組蛋白H3內(nèi)發(fā)生賴氨酸甲基化形成Set7/9之天然底物的序列環(huán)境。
[0188]基于使用9-氨基吖啶(9AA)作為熒光部分和色氨酸(W)作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的用于代表性PRMT酶PRMT5的示例性底物包括以下:
[0189]肽14:WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0190]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0191]R3表示PRMT酶PRMT5作用之甲基化位點(diǎn)的精氨酸殘基并且模擬組蛋白H4內(nèi)發(fā)生精氨酸甲基化形成PRMT5之天然底物的序列環(huán)境。肽15是在N端被乙?；?Ac)。
[0192]基于使用9-氨基吖啶(9AA)作為熒光部分和色氨酸(W)作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分的用于代表性PRMT酶EZH2的示例性底物包括以下:
[0193]肽20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2
[0194]K27表示PRMT酶EZH2作用之甲基化位點(diǎn)的賴氨酸殘基并且模擬組蛋白H3內(nèi)發(fā)生賴氨酸甲基化形成EZH2之天然底物的序列環(huán)境。
[0195]可根據(jù)所附實(shí)施例舉例說明的一般原則制備適用于測定其他PKMT和PRMT酶的肽底物。
[0196]適用于上述一般方法的蛋白酶包括但不限于在賴氨酸之后切割的Endo-LysC(用于基于賴氨酸甲基化的測定)和在精氨酸 之后切割的Endo-ArgC(用于基于精氨酸甲基化的測定)。
_7] (2)乙酰轉(zhuǎn)移酶測定
[0198]在一個實(shí)施方案中，本文中所述測定方法可適用于測定乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0199]用于該測定的底物包含肽接頭，并且具有一般結(jié)構(gòu)(III):
[0200]F1-X3-N2-X4-M (III)
[0201]其中X3表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X3綴合的熒光部分，N2表示通過乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而乙?；陌被釟埢琗4表示第二氨基酸序列并且M表示與X4綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。在用乙酰轉(zhuǎn)移酶處理之后，底物轉(zhuǎn)化為由以下一般結(jié)構(gòu)表示的經(jīng)修飾(乙酰化)底物:
[0202]Fl-X3-N2(Ac)-X4_M (IV)
[0203]其中N2 (Ac)表示殘基N2的乙?；?。
[0204]應(yīng)理解，F(xiàn)l和M實(shí)際上可以以任一定向存在。殘基N2通常是賴氨酸(在用于賴氨酸乙?；钢疁y定的情況下)。
[0205]選擇氨基酸序列X3和X4 二者以使殘基N2放置在乙?；倪m當(dāng)序列環(huán)境中，并且通過蛋白酶進(jìn)行切割(未乙酰化的結(jié)構(gòu)(III))，而且還提供熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)的最佳定向以實(shí)現(xiàn)Fl突光壽命的有效調(diào)節(jié)。X3和X4的序列可基于待測定乙酸轉(zhuǎn)移酶的天然底物的序列。應(yīng)理解，雖然為了有效調(diào)節(jié)熒光壽命，需要將熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)以適當(dāng)間隔定位，但是沒有必要使熒光部分(Fl)或熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)存在于肽接頭的末端(N端或C端)。因此，F(xiàn)l可與X3中的氨基酸殘基相連接并且M可與X4中的氨基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果熒光壽命調(diào)節(jié)劑M自身由氨基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側(cè)鏈提供，則充當(dāng)調(diào)節(jié)劑M的氨基酸殘基自身可形成由X4表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X3和X4可包含天然或非天然氨基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0206]在結(jié)構(gòu)(III)的底物中，熒光部分Fl (優(yōu)選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的熒光部分)的熒光壽命受底物中熒光壽命調(diào)節(jié)劑M(M優(yōu)選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在殘基N2(例如，賴氨酸)之后切割的蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(III)的底物將引起蛋白質(zhì)水解并且移除調(diào)節(jié)劑M對熒光壽命的調(diào)節(jié)。殘基N2(例如，賴氨酸)被適當(dāng)?shù)囊阴＾D(zhuǎn)移酶乙?；?，用蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(IV)的經(jīng)修飾肽不引起殘基N2之后的切割并且熒光部分(Fl)的壽命仍受調(diào)節(jié)。在底物(III)持續(xù)轉(zhuǎn)化為經(jīng)修飾底物(IV)的情況下，如在時間過程測定中，熒光部分(Fl)的熒光壽命將作為時間(以及乙酰轉(zhuǎn)移酶的濃度)的函數(shù)而降低。熒光壽命相對于100%未經(jīng)修飾底物(III)的基線測量值的變化(降低)表明發(fā)生了底物(III)向經(jīng)修飾底物(IV)的一些轉(zhuǎn)化。該變化的幅度可因此用于評價由乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而引起的底物(III)向經(jīng)修飾底物(IV)的轉(zhuǎn)化。
[0207]因此，本文中提供了一種測定蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶之活性的方法，其包括:
[0208](a)在允許熒光受調(diào)節(jié)之酶底物酶促轉(zhuǎn)化為通式(IV)的經(jīng)修飾底物的條件下使受試樣品與通式(III)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物相接觸，
[0209]F1-X3-N2-X4-M (III)
[0210]其中X3表不第一氨基酸序列，F(xiàn)l表不與X3綴合的突光部分，N2表
[0211]示通過乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而乙?；陌被釟埢琗4表示第二氨基酸
[0212]序列并且M表示與X4綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑
[0213]Fl-X3-N2(Ac)-X4_M (IV)
[0214]其中N2(Ac)表示通過蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而對殘基N2的乙酰化；
[0215](b)使步驟(a)的產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基N2處切割通式(III)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(IV)的經(jīng)修飾底物；以及
[0216](c)檢測熒光部分Fl熒光壽命的變化，從而測定蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0217]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用于篩選蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。
[0218]附圖27中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)的方法的一個具體實(shí)施例，所述組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶使肽/蛋白質(zhì)底物中的賴氨酸殘基乙酰化。該實(shí)施例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。然而，應(yīng)理解，這些具體的熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分僅通過示例示出，并且可替換為本文中所述的替代性熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分。
[0219]上述的一般方法可用于確定任何目的乙酰轉(zhuǎn)移酶(包括但不限于任何已知的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，包括屬于酶類EC2.3.1.48的任何組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶)的活性。特別地，所述測定方法可用于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Gcn5、PCAF、Hatl和p300 (作為非限制性實(shí)例而給出)。
[0220]基于在賴氨酸殘基(特定HAT之乙?；奈稽c(diǎn))側(cè)翼并入熒光團(tuán)(Fl)和調(diào)節(jié)劑部分(M)的組蛋白N端序列的肽底物可形成該類酶FLT蛋白酶保護(hù)測定的基礎(chǔ)。在以下以及圖28和53中示出了這種底物的序列，其基于使用9-氨基吖啶(9-AA)作為熒光部分并且使用色氨酸(W)作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分，以及使用具有HAT (例如，PCAF)乙酰化位點(diǎn)K14的組蛋白H3序列。
[0221 ]肽 16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2[0222]肽17: 9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2[0223]可根據(jù)所附實(shí)施例說明的一般原則制備適用于測定其他乙酰轉(zhuǎn)移酶的肽底物。[0224]適用于上述一般方法的蛋白酶包括但不限于在賴氨酸之后切割的Endo-LysC(用于基于賴氨酸乙?；臏y定)。[0225](3)脫亞氨酶測定[0226]在一個實(shí)施方案中，本文中所述測定方法可適用于測定脫亞氨酶的活性。[0227]用于該測定的底物包含肽接頭，并且具有一般結(jié)構(gòu):[0228]F1-X5-R-X6-M (V)[0229]其中X5表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X5綴合的熒光部分，R表示通過脫亞氨酶之作用而轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二氨基酸序列并且M表示與X6綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。在用脫亞氨酶處理之后，底物轉(zhuǎn)化為由以下一般結(jié)構(gòu)表示的修飾(脫亞氨化)底物:[0230]F1-X5-R (Cit)-X6-M (VI)[0231]其中R(Cit)表示殘基R通過脫亞氨化轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。[0232]應(yīng)理解，F(xiàn)l和M實(shí)際上可以以任一定向存在。選擇氨基酸序列X5和X6 二者以使殘基R放置在脫亞氨化為瓜氨酸的適當(dāng)序列環(huán)境中，并且通過蛋白酶進(jìn)行切割(在結(jié)構(gòu)(V)中)，而且還提供熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)的最佳定向以實(shí)現(xiàn)有效調(diào)節(jié)。X5和X6的序列可基于待測定脫亞氨酶之天然底物的序列。應(yīng)理解，雖然為了有效調(diào)節(jié)熒光壽命，需要將熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)以適當(dāng)間隔定位，但是沒有必要使熒光部分(Fl)或熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)存在于肽接頭的末端(N端或C端)。因此，F(xiàn)l可與X5中的氨基酸殘基相連接并且M可與X6中的氨基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果熒光壽命調(diào)節(jié)劑M自身由氨基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側(cè)鏈提供，則充當(dāng)調(diào)節(jié)劑M的氨基酸殘基自身可形成由X6表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X5和X6可包含天然或非天然氨基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。[0233]在結(jié)構(gòu)(V)的底物中，熒光部分Fl (優(yōu)選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的熒光部分)的熒光壽命受底物中熒光壽命調(diào)節(jié)劑M(M優(yōu)選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在殘基R之后切割的蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(V)的底物將引起蛋白質(zhì)水解并且移除調(diào)節(jié)劑M對熒光壽命的調(diào)節(jié)。在殘基R通過適當(dāng)?shù)拿搧啺泵皋D(zhuǎn)化為瓜氨酸后，用蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(VI)的經(jīng)修飾肽不引起殘基R之后的切割并且熒光部分(Fl)的壽命仍受調(diào)節(jié)。在底物(V)持續(xù)轉(zhuǎn)化為經(jīng)修飾底物(VI)的情況下，如在時間過程測定中，熒光部分(Fl)的熒光壽命將作為時間(以及脫亞氨酶的濃度)的函數(shù)而降低。熒光壽命相對于100%未經(jīng)修飾底物(V)的基線測量值的變化(降低)表明發(fā)生了底物(V)向經(jīng)修飾底物(VI)的一些轉(zhuǎn)化。該變化的幅度可因此用于評價由脫亞氨酶之作用引起的底物(V)向經(jīng)修飾底物(VI)的轉(zhuǎn)化。[0234]因此，本文中提供了一種測定蛋白質(zhì)脫亞氨酶之活性的方法，其包括:[0235](a)在允許熒光受調(diào)節(jié)之酶底物酶促轉(zhuǎn)化為通式(VI)的經(jīng)修飾底物的條件下使受試樣品與通式(V)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物相接觸[0236]F1-X5-R-X6-M (V)[0237]其中X5表不第一氨基酸序列,Fl表不與X5綴合的突光部分,R表不通過脫亞氨酶之作用而轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二氨基酸序列并且M表示與X6綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑
[0238]F1-X5-R (Cit)-X6-M (VI)
[0239]其中R(Cit)表示通過脫亞氨酶之作用而形成的瓜氨酸；
[0240](b)使步驟(a)的產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基R處切割通式(V)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(VI)的經(jīng)修飾底物；以及
[0241](c)檢測熒光部分Fl熒光壽命的變化，從而測定蛋白質(zhì)脫亞氨酶的活性。
[0242]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用于篩選蛋白質(zhì)脫亞氨酶的抑制劑。
[0243]圖1中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定脫亞氨酶類酶(具體是將肽/蛋白質(zhì)底物中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的肽基精氨酸脫亞氨酶)的方法的一個具體實(shí)例。該實(shí)例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分和使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。然而，應(yīng)理解，這些具體的熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分僅通過示例示出，并且可替換為本文中所述的替代性熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分。
[0244]上述的一般方法可適用于任何目的脫亞氨酶，包括但不限于肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)，例如PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6。特別地，所述方法可用于屬于酶類EC3.5.1.15的任何肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。PAD酶可被替代性地稱為蛋白質(zhì)-精氨酸脫亞氨酶。
[0245]以下示出了用于測定PAD2或PAD4活性的合適底物的實(shí)例，其基于使用9_氨基吖啶(9-AA)作為熒光部分和色氨酸(W)作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分:
[0246]肽1:9AA-QSTRGS GHWKK-C0NH2
[0247]肽3:K (9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_CONH2
[0248]可根據(jù)以上所述和所附實(shí)施例說明的一般原則制備適用于測定其他脫亞氨酶(特別是其他肽基精氨酸脫亞氨酶)的肽底物。
[0249]適用于上述一般方法的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶和在精氨酸之后切割的Endo-ArgC0
[0250](B)基于移除蛋白酶保護(hù)之修飾的測定
[0251]測定的第二組實(shí)施方案基于使用這樣的底物，其包含與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合的肽接頭分子，所述肽通過修飾酶之作用而修飾形成經(jīng)修飾肽，其中底物中的肽在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間玉能被第二種酶(即，蛋白酶)切割，并且修飾酶對肽的修飾將肽轉(zhuǎn)化為經(jīng)修飾肽，所述經(jīng)修飾肽在焚光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間被第二種酶(即，蛋白酶)切割。在這樣的一些實(shí)施方案中，底金在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間對第二種酶(蛋白酶)的切割不敏感，但是通過修飾酶作用于底物形成的經(jīng)修飾底物在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間被第二種酶(即，蛋白酶)切割，從而使得熒光部分的熒光壽命提高。因此，與未經(jīng)修飾肽相比，蛋白酶處理后熒光部分的熒光壽命的時間依賴性提高表明形成了經(jīng)修飾肽(通過修飾酶作用于底物而形成)。
[0252]該測定的一些非限制性實(shí)施方案如下:
[0253](4)脫甲基酶測定
[0254]在一個實(shí)施方案中，本文中所述測定方法可適用于測定脫甲基酶的活性。[0255]用于該測定的底物包含肽接頭，并且具有一般結(jié)構(gòu)(VII):
[0256]Fl-X7-N3(Me)-X8_M (VII)
[0257]其中X7表不第一氨基酸序列，F(xiàn)l表不與X7綴合的突光部分，N3 (Me)表不通過脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化氨基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列并且M表示與X8綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。在用脫甲基酶處理之后，底物轉(zhuǎn)化為由以下一般結(jié)構(gòu)表示的經(jīng)修飾(脫甲基化)底物:
[0258]F1-X7-N3-X8-M (VIII)
[0259]其中N3表示脫甲基化氨基酸(例如賴氨酸或精氨酸)。
[0260]應(yīng)理解，F(xiàn)l和M實(shí)際上可以以任一定向存在。選擇氨基酸序列X7和X8 二者以使殘基N3(Me)放置在甲基化的適當(dāng)序列環(huán)境中并且被蛋白酶切割(在結(jié)構(gòu)(VIII)的經(jīng)修飾底物中)，而且還提供熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)的最佳定向以實(shí)現(xiàn)Fl熒光壽命的有效調(diào)節(jié)。X7和X8的序列可基于待測定脫甲基酶之天然底物的序列。應(yīng)理解，雖然為了有效調(diào)節(jié)熒光壽命，需要將熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)以適當(dāng)間隔定位，但是沒有必要使熒光部分(Fl)或熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)存在于肽接頭的末端(N端或C端)。因此，F(xiàn)l可與X7中的氨基酸殘基相連接并且M可與X8中的氨基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果熒光壽命調(diào)節(jié)劑M自身由氨基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側(cè)鏈提供，則充當(dāng)調(diào)節(jié)劑M的氨基酸殘基自身可形成由X8表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X7和X8可包含天然或非天然氨基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0261]在基于精氨酸脫甲基化之測定的情況下，由N(Me)表示的精氨酸殘基根據(jù)待測定其活性的脫甲基酶的底物特異性可以被單甲基化或二甲基化，后者為對稱構(gòu)型或不對稱構(gòu)型。初始底物甲基化的精確程度和二甲基化形式的構(gòu)型對于測定的性能并不重要，前提是待測定脫甲基酶能夠使底物脫甲基化為可被蛋白酶切割的完全脫甲基化形式。因此，在精氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)視測定的環(huán)境可代表單甲基化或二甲基化形式中的任何一種。
[0262]在基于賴氨酸脫甲基化之測定的情況下，由N(Me)表示的賴氨酸殘基根據(jù)待測定其活性的脫甲基酶的底物特異性可以被單、二或三甲基化。初始底物甲基化的精確程度和二甲基化形式的構(gòu)型對于測定的性能并不重要，前提是待測定脫甲基酶能夠使底物脫甲基化為可被蛋白酶切割的完全脫甲基化形式。因此，在賴氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)視測定的環(huán)境可代表單、二或三甲基化形式中的任何一種。
[0263]在結(jié)構(gòu)(VII)的底物中，熒光部分Fl (優(yōu)選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的熒光部分)的熒光壽命受底物中熒光壽命調(diào)節(jié)劑M(M優(yōu)選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。在不存在任何脫甲基酶的情況下，用在殘基N3(例如，賴氨酸或精氨酸)之后切割的蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(VII)的底物在Fl與M之間丕引起蛋白質(zhì)水解，原因是結(jié)構(gòu)(VII)的底物包含N3的甲基化形式并因此對蛋白質(zhì)水解具有抗性。因此保留熒光壽命調(diào)節(jié)劑M(例如，色氨酸)對熒光部分Fl(例如，9AA)的熒光壽命調(diào)節(jié)。在脫甲基酶存在下，殘基N3 (Me)脫甲基化形成結(jié)構(gòu)(VIII)的經(jīng)修飾底物中的殘基N3。用蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(VIII)的經(jīng)修飾底物引起殘基N3(例如，賴氨酸或精氨酸)之后的切割并且熒光團(tuán)(例如，9AA)的熒光壽命不再受調(diào)節(jié)。在底物(VII)持續(xù)轉(zhuǎn)化為經(jīng)修、飾底物(VIII)的情況下，如在時間過程測定中，熒光部分(Fl)的熒光壽命將作為時間(以及脫甲基酶的濃度)的函數(shù)而提高，原因是形成了更多的經(jīng)修飾底物并且其通過蛋白酶的作用而被切割。熒光壽命相對于100%未經(jīng)修飾底物(VII)的基線測量值的變化(提高)表明發(fā)生了底物(VII)向經(jīng)修飾底物(VIII)的一些轉(zhuǎn)化。該變化的幅度可因此用于評價由脫甲基酶引起的底物(VII)向經(jīng)修飾底物(VIII)的轉(zhuǎn)化。
[0264]因此，本文中提供了測定蛋白質(zhì)脫甲基酶之活性的方法，其包括:
[0265](a)在允許熒光受調(diào)節(jié)之酶底物酶促轉(zhuǎn)化為通式(VIII)的經(jīng)修飾底物的條件下使受試樣品與通式(VII)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物相接觸
[0266]Fl-X7-N3(Me)-X8_M (VII)
[0267]其中X7表不第一氨基酸序列，F(xiàn)l表不與X7綴合的突光部分，N3 (Me)表不通過脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化氨基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列并且M表示與X8綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑
[0268]F1-X7-N3-X8-M (VIII)
[0269]其中N3表示通過脫甲基酶之作用的脫甲基化氨基酸；
[0270](b)使步驟(a)的產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基N3處切割通式(VIII)的經(jīng)修飾底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(VII)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物；以及
[0271](c)檢測熒光部分Fl熒光壽命的變化，從而測定蛋白質(zhì)脫甲基酶的活性。
[0272]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用于篩選蛋白質(zhì)脫甲基酶的抑制劑 。
[0273]圖25中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定蛋白質(zhì)脫甲基酶(PDM)之方法的一個具體實(shí)施例，所述蛋白質(zhì)脫甲基酶將肽/蛋白質(zhì)底物中賴氨酸或精氨酸殘基的一個或更多個甲基移除。該實(shí)施例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。然而，應(yīng)理解，這些具體的熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分僅通過示例示出，并且可替換為本文中所述的替代性熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分。
[0274]上述的一般方法可適用于任何目的脫甲基酶。特別優(yōu)選的是使在賴氨酸上甲基化的肽底物脫甲基化的PKDM酶。特別地，所述測定方法可用于組蛋白-賴氨酸脫甲基酶。組蛋白-賴氨酸脫甲基酶可根據(jù)底物特異性進(jìn)行分類。使賴氨酸殘基組蛋白H3脫甲基化的組蛋白-賴氨酸脫甲基酶可使賴氨酸4 (稱為[組蛋白-H3]-賴氨酸-4脫甲基酶；EC1.14.11.B2)、賴氨酸9 (稱為[組蛋白-H3]-賴氨酸-9脫甲基酶；EC1.14.11.BI)、賴氨酸36(稱為[組蛋白-H3]-賴氨酸-36脫甲基酶；EC1.14.11.27)或賴氨酸27 (稱為[組蛋白_H3]_賴氨酸-27脫甲基酶)脫甲基化。使組氨酸H4中賴氨酸殘基脫甲基化的組蛋白-賴氨酸脫甲基酶可使賴氨酸20脫甲基化。上述測定方法可用于屬于組蛋白-賴氨酸脫甲基酶這些類中的任何一種，其包括但不限于 LSD1、JHDM1A、JMJD1A、JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C、JMJD3 (KDM6)、FBXL (KDM2)和KDM5，僅通過示例給出)。
[0275]所述測定還可用于使在精氨酸上甲基化的肽底物脫甲基化的精氨酸脫甲基酶(PRDM 酶)，例如 JMJD6。
[0276]以下示出了用于代表性PKDM酶JHDMlA的FLT測定的合適底物。JHDMlA優(yōu)先使組蛋白H3的賴氨酸36脫甲基化，將其由二甲基化或單甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為天然的未甲基化殘基。因此，所述底物基于適當(dāng)序列環(huán)境中的殘基賴氨酸36。
[0277]肽10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2
[0278]在該不例性底物中，突光部分9AA (或其他合適的突光部分)的突光壽命受在C端附近并入的色氨酸氨基(或其他合適的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化允許在該殘基處的蛋白酶誘導(dǎo)切割，從而減輕調(diào)節(jié)并導(dǎo)致9AA的熒光壽命提高。相比之下，JHDMlA抑制劑的存在將阻止賴氨酸脫甲基化，從而使肽在賴氨酸-36處保留對蛋白酶誘導(dǎo)切割的抗性。因此，9AA的熒光壽命仍受調(diào)節(jié)并且調(diào)節(jié)程度與脫甲基化的程度相關(guān)。用于該測定的合適蛋白酶是不切割甲基化賴氨酸(賴氨酸-37作為單甲基衍生物而被保護(hù)以防止在該殘基處發(fā)生非特異性切割)的Endo-LysC。
[0279]以下示出了用于代表性PKDM酶JHDMlA之FLT測定的第二種合適底物。
[0280]肽11: 9AA-ATGGVK36 (Me) KPHW-C0NH2
[0281]在該示例性底物中，熒光部分9AA (或其他合適的熒光部分)的熒光壽命受在C端附近并入的色氨酸氨基殘基(或其他合適的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化允許在該殘基處的蛋白酶誘導(dǎo)切割，從而減輕調(diào)節(jié)并導(dǎo)致9AA的熒光壽命提高。相比之下，JHDMlA抑制劑的存在將阻止賴氨酸脫甲基化，從而使肽在賴氨酸-36處保留對蛋白酶誘導(dǎo)切割的抗性。因此，9AA的熒光壽命將仍受調(diào)節(jié)并且調(diào)節(jié)程度與脫甲基化的程度相關(guān)。用于該測定的合適蛋白酶是報道為不切割相鄰C端殘基是脯氨酸之賴氨酸的胰蛋白酶(例如，Keil, B .Specificity of Proteolyis)或切割活性嚴(yán)重受損的胰蛋白酶(Rodriguez, J.,等，J.Prot.Research, 2008, 7, 300-305),從而確保防止賴氨酸-37 處的非特異性切割，或使其降低至很小的水平。
[0282]可根據(jù)上述的一般原則制備適用于測定其他脫甲基酶的肽底物。
[0283](5)脫乙酰酶測定
[0284]在一個實(shí)施方案中，本文中所述測定方法可適用于測定脫乙酰酶的活性。
[0285]用于該測定的底物包含肽接頭，并且具有以下一般結(jié)構(gòu):
[0286]F1-X9-N4(Ac)-X10-M (IX)
[0287]其中X9表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X9綴合的熒光部分，M(Ac)表示通過脫乙酰酶之作用脫而乙?；囊阴；被釟埢?例如，乙?；嚢彼?，XlO表示第二氨基酸序列并且M表示與XlO綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。在用脫乙酰酶處理之后，底物轉(zhuǎn)化為由以下一般結(jié)構(gòu)表示的經(jīng)修飾(脫乙?；?底物:
[0288]F1-X9-N4-X10-M (X)
[0289]其中N4表示脫乙酰化氨基酸，例如賴氨酸。
[0290]應(yīng)理解，F(xiàn)l和M實(shí)際上可以以任一定向存在。選擇氨基酸序列X9和XlO 二者以使殘基M(Ac)放置在脫乙酰化的適當(dāng)序列環(huán)境中并且被蛋白酶切割(在結(jié)構(gòu)⑴的經(jīng)修飾底物中)，而且還提供熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)的最佳定向以實(shí)現(xiàn)有效調(diào)節(jié)。X9和XlO的序列可基于待測定脫乙酰酶之天然底物的序列。應(yīng)理解，雖然為了有效調(diào)節(jié)熒光壽命，需要將熒光部分(Fl)和熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)以適當(dāng)間隔定位，但是沒有必要使熒光部分(Fl)或熒光壽命調(diào)節(jié)劑(M)存在于肽接頭的末端(N端或C端)。因此，F(xiàn)l可與X9中的氨基酸殘基相連接并且M可與XlO中的氨基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果熒光壽命調(diào)節(jié)劑M自身由氨基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側(cè)鏈提供，則充當(dāng)調(diào)節(jié)劑M的氨基酸殘基自身可形成由XlO表示的氨基酸序列的一部分。氨基酸序列X9和XlO可包含天然或非天然氨基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0291]在結(jié)構(gòu)(IX)的底物中，熒光部分Fl (優(yōu)選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的熒光部分)的熒光壽命受底物中熒光壽命調(diào)節(jié)劑M(M優(yōu)選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。在不存在任何脫乙酰酶的情況下，用在殘基N4(例如，賴氨酸)之后切割的蛋白酶處理玉引起結(jié)構(gòu)(IX)之底物在Fl與M之間的蛋白質(zhì)水解，原因是結(jié)構(gòu)(IX)的底物包含N4的乙酰化形式并因此對蛋白質(zhì)水解具有抗性。因此使熒光壽命調(diào)節(jié)劑M (例如，色氨酸)對熒光部分Fl (例如，9AA)的熒光壽命調(diào)節(jié)保持未受損。在脫乙酰酶存在下，殘基M(Ac)脫乙酰化以形成結(jié)構(gòu)(X)之經(jīng)修飾底物中的殘基N4。用蛋白酶處理結(jié)構(gòu)(X)的經(jīng)修飾底物引起殘基N4 (例如，賴氨酸)之后的切割并且熒光團(tuán)(例如，9AA)的熒光壽命不再受調(diào)節(jié)。
[0292]在底物(IX)持續(xù)轉(zhuǎn)化為經(jīng)修飾底物⑴的情況下，如在時間過程測定中，熒光部分(Fl)的熒光壽命將作為時間(以及脫乙酰酶的濃度)的函數(shù)而提高，原因是形成了更多的經(jīng)修飾底物并且其通過蛋白酶的作用而被切割。熒光壽命相對于100%未經(jīng)修飾底物(IX)的基線測量值的變化(提高)表明發(fā)生了底物(IX)向經(jīng)修飾底物⑴的一些轉(zhuǎn)化。該變化的幅度可因此用于評價由脫乙酰酶引起的底物(IX)向經(jīng)修飾底物(X)的轉(zhuǎn)化。
[0293]因此，本文中提供了測定蛋白質(zhì)脫乙酰酶之活性的方法，其包括:
[0294](a)在允許熒光受調(diào)節(jié)之酶底物酶促轉(zhuǎn)化為通式(X)之經(jīng)修飾底物的條件下使受試樣品與通式(IX)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物相接觸
[0295]F1-X9-N4(Ac)-XlO-M (IX)
[0296]其中X9表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X9綴合的熒光部分，M(Ac)表示通過脫乙酰酶之作用脫而乙?；囊阴；被釟埢?例如，乙?；嚢彼?，XlO表示第二氨基酸序列并且M表示與XlO綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑，
[0297]F1-X9-N4-X10-M (X)
[0298]其中N4表示通過脫乙酰酶之作用的脫乙?；被?；
[0299](b)使步驟(a)的產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基N4處切割通式(X)的經(jīng)修飾底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(IX)的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物；以及
[0300](c)檢測熒光部分Fl之熒光壽命的變化，從而測定蛋白質(zhì)脫乙酰酶的活性。
[0301]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用于篩選蛋白質(zhì)脫乙酰酶的抑制劑。
[0302]圖29中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定蛋白質(zhì)脫乙酰酶(例如組蛋白脫乙酰酶(HDAC))之方法的一個具體實(shí)施例，所述脫乙酰酶從肽/蛋白質(zhì)底物的賴氨酸殘基中移除一個或更多個乙?；?。該實(shí)施例基于使用9-氨基吖啶作為熒光部分并且使用色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈作為熒光壽命調(diào)節(jié)劑。然而，應(yīng)理解，這些具體的熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分僅通過示例示出，并且可替換為本文中所述的替代性熒光部分和熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分。
[0303]上述的一般方法可適用于任何目的脫乙酰酶。特別優(yōu)選的是組蛋白脫乙酰酶(HDAC)酶，包括但不限于HDACl-1l和SIRT1-5。特別地，上述測定方法可用于酶類EC3.5.1.98中的任何屬于組蛋白脫乙酰酶，其包括屬于HDAC1、HDAC2和HDAC3三種亞類之
一的酶。
[0304]以下說明了一種示例性HDAC底物:
[0305]Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
[0306]Xaa =任意氨基酸。
[0307]以下說明了一種示例性HDACI底物:
[0308]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2
[0309]在這些底物中，熒光部分(9AA或其他合適的熒光部分)在鄰近脫乙?；嚢彼岬腃端并入，并且色氨酸(或其他合適的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)位于上述賴氨酸N端側(cè)。HDACl催化脫乙?；蟮牡鞍酌刚T導(dǎo)切割導(dǎo)致熒光壽命提高，原因是9AA與色氨酸殘基被分開。因此，熒光壽命的提高與HDAC的活性可直接相關(guān)。當(dāng)然，考慮可根據(jù)所討論HDAC的序列特異性設(shè)計(jì)其他類似地設(shè)計(jì)的底物。
[0310]測定的實(shí)踐應(yīng)用
[0311]本文中所述測定方法都可以以高通量篩選測定形式進(jìn)行，其增強(qiáng)了用于篩選和鑒定修飾酶抑制劑之測定的效用。
[0312]當(dāng)將本文中所述測定用于篩選環(huán)境時，上述測定在待測定抑制劑活性的化合物存在下進(jìn)行。這樣的高通量篩選測定的一般形式為本領(lǐng)域技術(shù)普通人員所熟知。通常，化合物與合適的測定對照(例如 ，無抑制劑、無修飾酶、高濃度的已知抑制劑)進(jìn)行平行測試?；衔锟稍跀?shù)個不同濃度下進(jìn)行平行測試。如通過測定的熒光壽命示值讀數(shù)的變化所表明的，在受試化合物存在下修飾酶活性的降低將所述受試化合物鑒定為所述修飾酶的抑制劑。
[0313]本發(fā)明的測定通?？稍诙嗫装宓陌逯羞M(jìn)行，例如具有24孔、96孔、384孔或更高密度的孔(例如864孔或1536孔)的微滴定板。
[0314]用于鑒定酶抑制劑的高通量篩選測定通常利用高純形式的修飾酶，例如重組酶。將支持修飾酶活性之合適酶反應(yīng)緩沖液中的修飾酶和相應(yīng)的熒光受調(diào)節(jié)之底物與受試化合物(可能的酶抑制劑)一起添加到多孔板的孔中。考慮到測試的酶的動力學(xué)，通常在合適的濃度范圍(例如，IOnM至10 μ M)中在連續(xù)稀釋下測試化合物。添加到孔中的修飾酶的量和底物的量維持不變(除了不包含酶的對照孔之外)。還可以制備包含高濃度已知酶抑制劑的對照孔以及不包含化合物的孔。然后將所制備的包含酶、熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和受試化合物的板以及適當(dāng)?shù)膶φ赵诓淮嬖谌魏我种苿r修飾酶具有活性的條件下孵育。在該孵育期間發(fā)生通過修飾酶作用的底物向經(jīng)修飾底物的轉(zhuǎn)化。如果受試化合物是修飾酶的抑制劑，則通過酶的熒光受調(diào)節(jié)之底物向經(jīng)修飾底物的轉(zhuǎn)化將被抑制，抑制程度取決于抑制劑的濃度及其作為抑制劑的效力。當(dāng)然，除了作為修飾酶活性的結(jié)果，不發(fā)生底物轉(zhuǎn)化為經(jīng)修飾底物對于測定性能來說是至關(guān)重要的。
[0315]可對添加到測定中的修飾酶量和允許底物轉(zhuǎn)化為修飾酶的孵育時長進(jìn)行選擇以優(yōu)化測定的動態(tài)范圍。例如，可選擇添加的酶量和孵育時間以實(shí)現(xiàn)在不存在任何抑制劑的情況下底物向經(jīng)修飾底物的轉(zhuǎn)化小于100%。
[0316]酶、底物和抑制劑的孵育完成后，就添加第二種酶(例如，蛋白酶)并使用適當(dāng)儀器(例如，NanoTaurus?讀板器)監(jiān)測熒光壽命。如本文其他地方所解釋的，所述測定可基于測量平均熒光壽命，或者基于測量對應(yīng)于底物或產(chǎn)物的具有特異性壽命的具體熒光物質(zhì)的量，即特異性測量表現(xiàn)出“長”熒光壽命(調(diào)節(jié)不存在)的切割底物/經(jīng)修飾底物或特異性測量未切割底物/經(jīng)修飾底物(調(diào)節(jié)仍存在)。在任一情況下，對于所使用的每一種濃度的受試化合物，熒光壽命測量都為受試化合物存在下修飾酶的活性提供了指示。可由相對于受試化合物濃度的％剩余修飾酶活性的作圖來確定受試化合物的IC5tl值。
[0317]肽底物
[0318]本發(fā)明的另一方面提供了用于實(shí)施本文中所述酶測定的肽底物。特別地，提供了以下底物:
[0319](I)用于甲基轉(zhuǎn)移酶測定的底物
[0320]F1-X1-N1-X2-M (I)，或
[0321]M-X1-N1-X2-F1 (I，)
[0322]其中Xl表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與Xl (或在I’中與X2)綴合的熒光部分，NI表示通過甲基轉(zhuǎn)移酶之作用而甲基化的氨基酸殘基，X2表示第二氨基酸序列并且M表示與X2(或在I’中與XI)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0323]在一些非限制性實(shí)施方案中，所述底物可以是以下熒光受調(diào)節(jié)之肽中的一種:
[0324]肽4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0325]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0326]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0327]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0328]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
[0329]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
[0330]肽I2:WARTK4QTARK (9AA) STGGKAPRKQLAK_CONH2
[0331 ]肽 13: wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0332]肽14: WsGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK-CONH2
[0333]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0334]肽20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2
[0335](2)用于乙酰轉(zhuǎn)移酶測定的底物
[0336]F1-X3-N2-X4-M (III)，或
[0337]M-X3-N2-X4-F1 (III，)
[0338]其中X3表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X3(或在III’中與X4)綴合的熒光部分，N2表示通過乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而乙?；陌被釟埢?，X4表示第二氨基酸序列并且M表示與X4(或在III’中與X3)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0339]在一些非限制性實(shí)施方案中，所述底物可以是以下熒光受調(diào)節(jié)之肽中的一種:
[0340]肽16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2[0341 ]肽 17: 9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2
[0342](3)用于脫亞氨酶測定的底物
[0343]F1-X5-R-X6-M (V)，或
[0344]M-X5-R-X6-F1 (V，)
[0345]其中X5表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X5(或在V’中與X6)綴合的熒光部分，R、表示通過脫亞氨酶作用轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二氨基酸序列并且M表示與X6(或在V’中與X5)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0346]在一些非限制性實(shí)施方案中，所述底物可以是以下熒光受調(diào)節(jié)之肽中的一種:
[0347]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0348]肽3:K (9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_CONH2
[0349](4)用于脫甲基酶的底物
[0350]F1-X7-N3(Me)-X8-M (VII)，或
[0351]M-X7-N3(Me)-X8-F1 (VII，)
[0352]其中X7表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X7(或在VII’中與X8)綴合的熒光部分，N3(Me)表示通過脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化氨基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列并且M表示與X8 (或在VII’中與X7)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0353]在一些非限制性實(shí)施方案中，所述底物可以是以下熒光受調(diào)節(jié)之肽中的一種:
[0354]肽10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2 或
[0355]肽11: 9AA-ATGGVK36 (Me) KPHW-C0NH2
[0356](5)用于脫乙酰酶的底物
[0357]F1-X9-N4 (Ac )-XlO-M (IX)，或
[0358]M-X9-N4(Ac)-XlO-Fl (IX，)
[0359]其中X9表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X9(或在IX’中與X10)綴合的熒光部分，M(Ac)表示通過脫乙酰酶之作用而脫乙?；囊阴；被釟埢?例如，乙?；嚢彼?，XlO表示第二氨基酸序列并且M表示與XlO (或在IX’中與X9)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
[0360]在一個非限制性實(shí)施方案中，所述底物可以是以下熒光受調(diào)節(jié)之肽:
[0361 ] Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
[0362]Xaa =任意氨基酸
[0363]或肽，例如
[0364]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2
[0365]在上述熒光受調(diào)節(jié)之底物中，部分Fl與M可形成以下非限制性組合之一:
[0366]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側(cè)鏈；
[0367]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分萘基丙氨酸或其衍生物；
[0368]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分咔唑部分或其衍生物；
[0369]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分吩噻嗪或其衍生物；
[0370]熒光部分吖啶酮或其衍生物與調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈；
[0371]熒光部分喹吖啶酮或其衍生物與調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側(cè)鏈。
[0372]試劑盒
[0373]本發(fā)明的另一方面涉及用于實(shí)施本文中所述測定方法的試劑盒。所述試劑盒通常包含如本文定義的酶底物和第二種酶(例如，蛋白酶)供應(yīng)，所述第二種酶在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間切割底物或通過修飾酶作用于底物而形成的底物的經(jīng)修飾形式，從而將與熒光部分綴合之底物的一部分與與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合之底物的一部分分開。所述試劑盒還可包含對于修飾酶與底物之反應(yīng)和蛋白酶與底物(或底物的經(jīng)修飾形式)之反應(yīng)二者都合適的酶反應(yīng)緩沖液等。
[0374]特別地，提供了以下試劑盒:
[0375](I)用于甲基轉(zhuǎn)移酶測定的試劑盒
[0376]所述試劑盒包含具有以下一般結(jié)構(gòu)的熒光受調(diào)節(jié)之底物和蛋白酶:
[0377]F1-X1-N1-X2-M (I)，或
[0378]M-X1-N1-X2-F1 (I，)
[0379]其中Xl表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與Xl (或在I’中與X2)綴合的熒光部分，NI表示通過甲基轉(zhuǎn)移酶之作用而甲基化的氨基酸殘基，X2表示第二氨基酸序列，并且M表示與X2 (或在I’中與X2)綴 合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑；并且所述蛋白酶能夠?qū)⑺龅孜镏辽偾懈畛砂瑹晒獠糠諪l的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的第二部分。
[0380]在一些非限制性實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含以下熒光受調(diào)節(jié)之肽之一和蛋白酶 Endo-LysC 或 Endo-ArgC 的供應(yīng):
[0381 ]肽 4: 9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0382]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0383]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0384]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0385]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
[0386]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
[0387]肽12:wartk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0388]肽13: wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0389]肽14:WsGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK-CONH2
[0390]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2[0391 ]肽 20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2。
[0392](2)用于乙酰轉(zhuǎn)移酶測定的試劑盒
[0393]所述試劑盒包含具有以下一般結(jié)構(gòu)的熒光受調(diào)節(jié)之底物和蛋白酶:
[0394]F1-X3-N2-X4-M (III)，或
[0395]M-X3-N2-X4-F1 (III，)
[0396]其中X3表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X3(或在III’中與X4)綴合的熒光部分，N2表示通過乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而乙?；陌被釟埢?，X4表示第二氨基酸序列，并且M表示與X4(或在III’中與X3)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑；并且所述蛋白酶能夠?qū)⑺龅孜镏辽偾懈畛砂瑹晒獠糠諪l的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的第二部分。
[0397]在一個非限制性實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含以下熒光受調(diào)節(jié)之肽底物之一和蛋白酶Endo-LysC的供應(yīng):
[0398]肽16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2
[0399]肽17:9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2。
[0400](3)用于脫亞氨酶測定的試劑盒[0401]所述試劑盒包含具有以下一般結(jié)構(gòu)的熒光受調(diào)節(jié)之底物和蛋白酶:
[0402]F1-X5-R-X6-M (V)，或
[0403]M-X5-R-X6-F1 (V，)
[0404]其中X5表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X5(或在V’中與X6)綴合的熒光部分，R表示通過脫亞氨酶作用轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二氨基酸序列，并且M表示與X6(或在V’中與X5)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑；并且所述蛋白酶能夠?qū)⑺龅孜镏辽偾懈畛砂瑹晒獠糠諪l的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的第二部分。
[0405]在一些非限制性實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含以下熒光受調(diào)節(jié)之肽底物之一和蛋白酶胰蛋白酶的供應(yīng):
[0406]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0407]肽3:K(9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_CONH2。
[0408](4)用于脫甲基酶的試劑盒
[0409]所述試劑盒包含具有以下一般結(jié)構(gòu)的熒光受調(diào)節(jié)之底物和蛋白酶:
[0410]Fl-X7-N3(Me)-X8_M (VII)，或
[0411]M-X7-N3(Me)-X8-F1 (VII，)
[0412]其中X7表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X7(或在VII’中與X8)綴合的熒光部分，N3(Me)表示通過脫 甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化氨基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列，并且M表示與X8(或在VII’中與X7)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑；并且所述蛋白酶能夠?qū)⑺龅孜锏慕?jīng)修飾形式至少切割成包含熒光部分Fl的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的第二部分。
[0413]在一個非限制性實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含以下熒光受調(diào)節(jié)之肽底物之一和蛋白酶Endo-LysC的供應(yīng):
[0414]肽10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2。
[0415]在另一個非限制性實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含以下熒光受調(diào)節(jié)之肽底物之一和蛋白酶胰蛋白酶的供應(yīng):
[0416]肽11: 9AA-ATGGVK36 (Me) KPHW-C0NH2。
[0417](5)用于脫乙酰酶的試劑盒
[0418]所述試劑盒包含具有以下一般結(jié)構(gòu)的熒光受調(diào)節(jié)之底物和蛋白酶:
[0419]F1-X9-N4 (Ac)-XlO-M (IX)，或
[0420]M-X9-N4(Ac)-XlO-Fl (IX，)
[0421]其中X9表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X9(或在IX’中與X10)綴合的熒光部分，M(Ac)表示通過脫乙酰酶之作用脫而乙?；囊阴；被釟埢?例如，乙?；嚢彼?，XlO表示第二氨基酸序列，并且M表示與XlO (或在IX’中與X9)綴合的熒光壽命調(diào)節(jié)劑；并且所述蛋白酶能夠?qū)⑺龅孜锏慕?jīng)修飾形式至少切割成包含熒光部分Fl的第一部分和包含熒光壽命調(diào)節(jié)劑M的第二部分。
[0422]在一個非限制性實(shí)施方案中，所述試劑盒可包含以下熒光受調(diào)節(jié)之肽底物之一和胰蛋白酶的供應(yīng):
[0423]Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
[0424]Xaa =任意氨基酸[0425]或肽，例如
[0426]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2。
[0427]在上述試劑盒中，熒光受調(diào)節(jié)之底物中的部分Fl與M可形成以下非限制性組合之
[0428]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側(cè)鏈；
[0429]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分萘基丙氨酸或其衍生物；
[0430]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分咔唑部分或其衍生物；
[0431]熒光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調(diào)節(jié)劑部分吩噻嗪或其衍生物；
[0432]熒光部分吖啶酮或其衍生物與調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲哚基側(cè)鏈；
[0433]熒光部分喹吖啶酮或其衍生物與調(diào)節(jié)劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側(cè)鏈。
實(shí)施例
[0434]參照以下實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明。
[0435]實(shí)施例1-用于脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0436]圖1示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定脫亞氨酶類酶的方法，所述脫亞氨酶類酶將肽/蛋白質(zhì)底物中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。在這里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報道分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在精氨酸之之后切割的蛋白酶處理底物將引起蛋白質(zhì)水解并移除色氨酸殘基對熒光壽命的調(diào)節(jié)。在通過適當(dāng)?shù)拿搧啺泵笇?精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸后，然后用蛋白酶處理產(chǎn)物肽不引起精氨酸之后的切割并且熒光團(tuán)(9AA)的壽命仍受調(diào)節(jié)。
[0437](A) PAD4 I既念驗(yàn)iiH (Proof-of-Concept) FLT 蛋白酶保護(hù)泖I 定
[0438]重組人PAD4酶可商購自供應(yīng)商例如origene、abnova或modiquest research。
[0439]為了實(shí)現(xiàn)用于脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護(hù)法，必須滿足多個條件:
[0440]I)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)碾牡孜铮浒搧啺泵傅淖R別位點(diǎn)、合適地并入的色氨酸殘基(或其他FLT調(diào)節(jié)劑)和長壽命熒光團(tuán)(例如，9-氨基吖啶)。
[0441]2)正確布置調(diào)節(jié)劑和熒光團(tuán)，使得后者的FLT在完整肽中充分降低。調(diào)節(jié)劑和熒光團(tuán)在蛋白酶切割后必須位于相反的片段上，從而導(dǎo)致熒光團(tuán)FLT的切割依賴性提高。
[0442]3)使用選擇性地切割肽(瓜氨酸化)精氨酸殘基C端的合適蛋白酶。所述蛋白酶必須不能切割瓜氨酸化產(chǎn)物。
[0443]為了滿足要求I~3，設(shè)計(jì)并合成了圖2所示肽序列用于通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定脫亞氨酶PAD4。
[0444]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0445]肽2:K (9ΑΑ)-QSTRGSGHWKK_C0NH2
[0446]肽3:K (9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_C0NH2
[0447]為了提高得到合適FLT調(diào)節(jié)的可能性同時維持針對PAD4的活性，合成了三種變體。[0448]如實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述通過標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)合成所述肽。肽2和3在N端包含Boc-Lys (Fmoc) -0H,從而能夠得到正交的側(cè)鏈脫保護(hù)。使用HOCt/DIC活化在樹脂上用3-(9-氨基吖啶-2-基)_丙酸標(biāo)記肽，然后使用標(biāo)準(zhǔn)TFA切割混合物(cocktail)進(jìn)行切割。通過反相HPLC對肽進(jìn)行純化并參照9AA的摩爾消光系數(shù)進(jìn)行等分(在1:1MeCN/水中在405nm處為8735M_1cm_1)。[0449]狀I(lǐng)~3的FLT測量
[0450]在384孔黑色微孔板中將肽I~3以I μ M的濃度溶解于PAD4測定緩沖液(20mMTris pH8.0, 200 μ M CaCl2, 5mM DTT,0.01% CHAPS)中(20 μ L/孔)。如實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述使用NanoTaurus突光壽命讀板器(Edinburgh Instruments Ltd.)測量FLT。一式三份地進(jìn)行測量并在7小時時間段中進(jìn)行分析。
[0451]初始穩(wěn)定后，肽I和3的FLT隨時間保持穩(wěn)定(圖3)。相比之下，肽2的FLT穩(wěn)定地升高3小時后開始變平。相比于肽I和2，肽3初始壽命的降低反映鄰近9AA連接位點(diǎn)處存在組氨酸殘基。與色氨酸一樣，已知組氨酸殘基調(diào)節(jié)突光團(tuán)的FLT(Marme,N.,Knemeyer,J-P., Sauer, Μ.和 Wo If rum, J., Bioconjugate Chem.,2003,14,1133-1139)。
[0452]肽I~3的蛋白酶切割
[0453]胰蛋白酶是切割肽和蛋白質(zhì)中精氨酸或賴氨酸殘基C端的常用蛋白酶。所設(shè)計(jì)的肽I~3(圖2)在C端具有一個精氨酸殘基和兩個賴氨酸殘基。預(yù)計(jì)精氨酸處的切割將由于其與調(diào)節(jié)色氨酸殘基的分開而導(dǎo)致9AA FLT提高。相比之下，并且對于測定的效用來說重要的是，賴氨酸處的切割不導(dǎo)致染料和調(diào)節(jié)劑分開，因此應(yīng)對前者的FLT無影響。
[0454]為了測試蛋白酶切割對肽I~3之FLT的影響，在384孔黑色微孔板中將每種肽以I μ M的濃度溶解于PAD4測定緩沖液(20 μ L)中。向每個孔中添加10 μ L分別包含5ηΜ、
2.5nM、1.25ηΜ或0.625ηΜ酶的胰蛋白酶溶液。在45分鐘內(nèi)以規(guī)律的間隔使用NanoTaurus讀板器測量FLT。作為對照，以類似方法測試包含瓜氨酸(替代精氨酸)的相應(yīng)肽。
[0455]所有的三種肽的FLT作為胰蛋白酶濃度的函數(shù)而提高，這與9ΑΑ與調(diào)節(jié)色氨酸殘基的分開相一致(圖4Α~C)。FLT提高是肽依賴性的，使得肽I (6ns) >肽2 (4.8ns) >肽3(2.6ns)。應(yīng)注意，對于肽2，無胰蛋白酶對照中有一些漂移，這與該肽單獨(dú)在緩沖液中所觀察到的作用相一致(圖3)。肽3的降低的FLT范圍可通過切割后鄰近9AA的調(diào)節(jié)組氨酸殘基的持續(xù)存在來部分地解釋。
[0456]與在胰蛋白酶處理之后對于肽I~3所觀察到的FLT顯著提高相比，對于瓜氨酸化類似物沒有觀察到FLT提高，甚至在孵育45分鐘后也是如此(圖4D)。該發(fā)現(xiàn)與預(yù)計(jì)的胰蛋白酶不能在鄰近瓜氨酸殘基處切割相一致。
[0457]根據(jù)經(jīng)驗(yàn)證測定的蛋白酶保護(hù)方面，將注意力轉(zhuǎn)向確定肽I~3是否是PAD4的可行底物。
[0458]俥用狀I(lǐng)~3講行PAD4測定
[0459]為了確定肽I~3是否被PAD4瓜氨酸化，開發(fā)了反相HPLC法以監(jiān)測底物的消耗和產(chǎn)物的形成。作為第一步，在PAD4測定緩沖液中以15 μ M的濃度制備每種肽與其瓜氨酸化等價物的1:1混合物，并使用Luna C18柱和O~73% MeCN+0.1 % TFA梯度通過RP-HPLC監(jiān)測30分鐘。使用該梯度可將對應(yīng)于底物和產(chǎn)物肽的峰分開，這二者的保留時間均比來自緩沖液組分的峰晚，從而簡化了分析(圖5)。[0460]通過可使用的合適HPLC方法，為每種肽底物建立PAD4測定，以規(guī)律的時間間隔取出等量份并且通過RP-HPLC監(jiān)測產(chǎn)物形成。每個測定均在包含測定緩沖液(300 μ L)中的15 μ M肽和30nM PAD4 (Origene)的微型離心管中進(jìn)行。測定在室溫下進(jìn)行并且在O分鐘、30分鐘和60分鐘的時間間隔取樣。
[0461]通過圖6~8中的HPLC譜示出了在I小時的時程內(nèi)每個測定的進(jìn)展。對于使用肽1(圖6)和肽3(圖8)作為底物的測定，譜清楚地示出在30分鐘后形成了新峰，其保留時間比底物晚，并且明顯地，I小時后底物幾乎完全消失。為了確定新形成的物質(zhì)與瓜氨酸化產(chǎn)物相對應(yīng)，收集峰并通過ES1-MS分析。該方法確定了在每種情況下質(zhì)量都比初始肽大IRmu,與精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸相一致(圖9和圖10)。
[0462]與使用肽I和3的成功相比，如通過在測定時間過程中HPLC譜中出現(xiàn)多個峰的所證明的(圖7)，使用肽2作為底物的測定導(dǎo)致了肽的分解。對于分解的峰不能得到可辨別的質(zhì)量，所以不可能確定瓜氨酸化是否發(fā)生。該肽作為底物的明顯失敗與FLT研究(圖3)期間和蛋白酶切割分析(圖4B)期間所觀察到的穩(wěn)定性缺乏相一致。不進(jìn)行使用肽2的進(jìn)一步研究，而將注意力集中到在PAD4測定中已表現(xiàn)出活性的肽I和3上。
[0463]為了測試PAD4對肽I和3的瓜氨酸化是否賦予了針對胰蛋白酶的保護(hù)，將這些肽的測定混合物(上述)用測定緩沖液稀釋至I μ M的濃度，并且將20 μ L各自添加到384孔黑色微孔板的三個孔中。如前所述使用NanoTaurus讀板器測量FLT。然后將10 μ L胰蛋白酶(終濃度為IOnM)添加到每個孔中，并將板在室溫下孵育10分鐘，然后再次測量FLT。包括僅包含相同濃度肽的對照用于比較。
[0464]在PAD4不存在下，在與IOnM胰蛋白酶孵育后，肽I和3的FLT分別提高6.1ns和
3.3ns(圖11)。相比之下，對于在與胰蛋白酶孵育之前暴露于PAD4的那些肽沒有觀察到FLT提高。這些發(fā)現(xiàn)與PAD4催化的底物瓜氨酸化提供對蛋白酶處理的保護(hù)相一致。
[0465]總之，可得出以下結(jié)論:
[0466]I)肽I和3是PAD4的可行底物。
[0467]2)在用合適的蛋白酶(即，胰蛋白酶)處理后可實(shí)現(xiàn)多至6ns的FLT提高(在肽I的情況下)，從而得到優(yōu)良的測定動態(tài)范圍。
[0468]3)如缺乏FLT提高所反映的，PAD4對肽I和3的瓜氨酸化賦予了免于蛋白酶誘導(dǎo)切割的保護(hù)。
[0469]用于PAD4的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0470]由于與肽3相比，肽I表現(xiàn)出的FLT顯著更大的變化，所以選擇該肽作為微孔板測定的底物。測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進(jìn)行并且包含測定緩沖液中的肽
I(I μ Μ)和PAD4酶(500ρΜ、250ρΜ或125ρΜ)。以規(guī)律的間隔通過添加10 μ L胰蛋白酶(IOnM)終止反應(yīng)。在添加胰蛋白酶之前立即測量FLT，并且在室溫下孵育10分鐘后再次測量。所有測量使用NanoTaurus讀板器一式三份地進(jìn)行。
[0471]在添加胰蛋白酶之前，所有測定孔的FLT都類似(~10ns)，并且對于不同測定時間點(diǎn)或PAD4濃度觀察到?jīng)]有顯著變化(圖12A)。相比之下，與胰蛋白酶孵育后測量的FLT表現(xiàn)出時間和PAD4濃度依賴性降低(圖12B)，原因是進(jìn)行性瓜氨酸化賦予了蛋白質(zhì)保護(hù)，導(dǎo)致了固有的色氨酸殘基對肽I之FLT的持續(xù)調(diào)節(jié)。
[0472]底物滴定[0473]研究了 PAD4測定對肽底物濃度的依賴性。測定使用250pM PAD4在測定緩沖液(20yL)中在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行I小時。肽I的濃度在2.5μ M至0.04 μ M之間變化。反應(yīng)完成后，將胰蛋白酶(IOnM)添加到每個孔中并在10分鐘的孵育期后測量FLT。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物形成的速率，然后在GraphPad Prism中使用Michaelis-Menten模型進(jìn)行擬合以確定底物ΚΜ。由圖73可以看出，底物I的Km被確定為180ηΜ。
[0474]V -閔子
[0475]為了證明PAD4FLT 測定與高通量篩選(high-throughput screening, HTS)兼容，確定了 Z’-因子的值。Z’_因子是特定測定之穩(wěn)健性(robustness)的度量，值>0.7被認(rèn)為是優(yōu)良的(Zhang, J.H.；Chung, T.D.；01denburg, K.R.J.Biomol.Screen.1999,4,67-73)。
[0476]在384孔微孔板中建立測定，其中半個板包含測定緩沖液中的PAD4(125pM)和肽
1(200nM)，而另外半個板包含不含CaCl2的測定緩沖液中的PAD4(125pM)和肽I (200nM)。最終測定體積為20μ L，將板在室溫下孵育I小時，此時將測定緩沖液(10μ L)中的胰蛋白酶(IOnM終濃度)添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘后，測量FLT并計(jì)算Ζ’因子為 0.70 (圖 74)。
[0477]這些結(jié)果證明用于脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定可轉(zhuǎn)為微孔板形式，這有助于其用于藥物篩選和HTS應(yīng)用。
[0478]總之，已展示了采用PAD4作為代表性實(shí)例的用于脫亞氨酶類酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定。設(shè)計(jì)并入PAD4識別序列、9-氨基吖啶熒光團(tuán)和調(diào)節(jié)色氨酸序列的肽底物。FLT研究確定9ΑΑ的壽命降低而肽序列未受損，但是在用蛋白酶胰蛋白酶處理后，F(xiàn)LT由于肽切割引起染料從調(diào)節(jié)劑中釋放而提高。肽中的兩種表明使體外測定中PAD4的底物，其中序列中單個精氨酸殘基的瓜氨酸化導(dǎo)致了免于蛋白酶誘導(dǎo)切割的保護(hù)。通過與不包含酶的對照相比暴露于PAD4的那些肽的FLT降低來對該保護(hù)進(jìn)行定量。
[0479]考慮通過采用適當(dāng)設(shè)計(jì)的底物可將該測定技術(shù)轉(zhuǎn)用于其他脫亞氨酶。
[0480](B)用于PAD2脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0481]在測定脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護(hù)法的另一個示例中，肽基精氨酸脫亞氨酶
2(PAD2)被驗(yàn)證為合適的靶標(biāo)。
[0482]PAD2的調(diào)節(jié)異常與自身免疫病多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茲海默病和克雅氏癥(creutzfeldt-Jakob disease))相關(guān)(Jang, B.等，ActaNeuropathologica,2010,119,199 至 210)。
[0483]重組人PAD2可商購自供應(yīng)商例如Modiquest Research。
[0484]在使用PAD2的測定中測試先前被確定為PAD4底物的肽1(圖1)，并且通過RP-HPLC和ES1-MS監(jiān)測向瓜氨酸化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
[0485]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0486]因此，將肽I (15 μ Μ)與PAD2 (30ηΜ)在測定緩沖液(20mM Tris pH8, 200 μ M CaCl2,5mM DTT，0.01% CHAPS) (300 μ L)中孵育，以規(guī)律的時間間隔取出等量份并通過RP-HPLC分析。測定在室溫下進(jìn)行并且在O分鐘、30分鐘和120分鐘時間間隔取樣。
[0487]通過圖31中的HPLC譜示出2小時時間過程中的測定進(jìn)展。在t = O時，存在對應(yīng)于肽底物的唯一峰(tK = 14.4分鐘)。30分鐘后在405nm吸光度下存在新峰(tK = 14.7分鐘)，在2小時后該峰增長為主要的并且僅可檢測到很小的底物峰。為了確定新峰對應(yīng)于瓜氨酸化產(chǎn)物，收集所述產(chǎn)物并通過ES1-MS進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)質(zhì)量(m/zl518.7)比底物質(zhì)量大lamu，這與精氨酸殘基的胍基轉(zhuǎn)化為尿素相一致(圖32)。
[0488]為了測試PAD2對肽I的瓜氨酸化是否賦予了針對胰蛋白酶的保護(hù)，用測定緩沖液將測定混合物稀釋至I μ M的濃度，并且將20 μ L添加到384孔黑色微孔板的三個孔中。將IOy L胰蛋白酶(終濃度為IOnM)添加到每個孔中，將板在室溫下孵育10分鐘后，如實(shí)驗(yàn)章節(jié)中所述使用NanoTaurus讀板器測量熒光壽命(FLT)。包括僅包含相同濃度肽的對照用于比較。
[0489]在PAD2不存在下，在與IOnM胰蛋白酶孵育后肽I的FLT提高6.9ns (圖33)。相比之下，對于在與胰蛋白酶孵育之前暴露于PAD2的肽I沒有觀察到FLT提高。這些發(fā)現(xiàn)與PAD2催化的肽I瓜氨酸化提供對蛋白酶處理的保護(hù)相一致。
[0490]總之，肽I是測定PAD2的有效底物，其通過由瓜氨酸化賦予對蛋白酶誘導(dǎo)切割之保護(hù)導(dǎo)致的FLT降低來監(jiān)測活性。
[0491]用于PAD2的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0492]接著，以微孔板形式證明了用于PAD2的FLT蛋白酶保護(hù)測定。測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進(jìn)行并且包含測定緩沖液中的肽I (I μ Μ)和PAD2酶(23.5ηΜ、11.8ηΜ、5.9ηΜ、2.9ηΜ或1.5ηΜ)。以規(guī)律的間隔通過添加10 μ L胰蛋白酶(IOnM)終止反應(yīng)。在室溫下與胰蛋白酶孵育10分鐘后測量FLT。所有的測量使用NanoTaurus讀板器一式三份地進(jìn)行。
[0493]與胰蛋白酶孵育后測量的FLT表現(xiàn)出時間和PAD2濃度依賴性降低(圖34)，原因是進(jìn)行的瓜氨酸化提供了蛋白酶保護(hù)，導(dǎo)致固有色氨酸殘基對肽I之FLT的持續(xù)調(diào)節(jié)。因此通過測定的所測量熒光壽命降低報道瓜氨酸化。
[0494]這些結(jié)果證明用于PAD2的FLT蛋白酶保護(hù)測定可轉(zhuǎn)為微孔板形式，從而有助于其用于藥物篩選和HTS應(yīng)用。
[0495]實(shí)施例2-用于蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0496]圖13示出通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)的方法，所述甲基轉(zhuǎn)移酶將一個或更多個甲基轉(zhuǎn)移到肽/蛋白質(zhì)底物中的賴氨酸或精氨酸殘基上。在這里，9-氨基吖啶(9ΑΑ)(或其他合適的報道分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在賴氨酸或精氨酸之后切割的蛋白酶處理底物將引起蛋白質(zhì)水解并移除色氨酸殘基對熒光壽命的調(diào)節(jié)。通過適當(dāng)?shù)腜MT酶進(jìn)行賴氨酸或精氨酸甲基化后，用蛋白酶處理產(chǎn)物肽不引起賴氨酸或精氨酸后的切割并且熒光團(tuán)(9ΑΑ)的壽命仍受調(diào)節(jié)。
[0497]重組PKMT(例如 G9a、Set7/9、GLP、EZH2)和 PRMT(PRMTU PRMT3、PRMT4/CARMUPRMT5)酶可商購自供應(yīng)商例如 BPS Bioscience、Millipore、New England Biolabs 或Sigma-Aldricho
[0498]對于圖13所列途徑合適的蛋白酶為Endo-LysC (用于測定PKMT)和Endo-ArgC (用于測定PRMT)。
[0499](A) G9a概念駘證件FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0500]選擇PKMT G9a作為概念驗(yàn)證性研究一個代表性實(shí)例，因?yàn)樗且驯缓芎帽碚鞯拿?Chin, H.G., Pradhan, Μ., Esteve, Ρ_0., Patnaik, D., Evans Jr., Τ.C 和 Pradhan, S.,Biochemistry,2005,44,12998-13006)(Patnaik, D., Chin, H.G., Esteve, Ρ_0., Benner,J.，Jacobsen, S.Ε.和 Pradhan, S.，J.Biol.Chem.，2004，279，53247-53258)。不同長度的組蛋白妝被報道為底物(Rathert, P.，Dhayalan, A.，Murakami, Μ.，Zhang, X.，Tamas, R.，Jurkowska, R., Komatsu, Y., Shinkai, Y., Cheng, X., and Jeltsch, A., Nat.Chem.Biol.,2008，4，344-346)，并且其可商購自多個供應(yīng)商。G9a首先將甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白H3之N端尾區(qū)的殘基上。延長暴露于G9a可導(dǎo)致賴氨酸-9變?yōu)槎谆蛉谆?。最近報道了使用Caliper微流體轉(zhuǎn)移技術(shù)(Caliper' s microfluidic shift technology)的用于G9a的蛋白酶保護(hù)測定(Wigle, T.J.，Provencher, L.Μ.，Norris, J.L, Jin, J.，Brown, P.J.，F(xiàn)rye,S.V.，Janzen，ff.P.，Chem.Biol.,2010,17，695-704)。
[0501]在第一種情況下，基于組蛋白H3N端序列合成了一系列肽作為G9a的可能底物(圖14)。如對于脫亞氨酶類酶所舉例說明的，基于FLT的蛋白酶保護(hù)法的可行性需要并入長壽命熒光團(tuán)(例如，9AA)并且在靶殘基(在這種情況下為賴氨酸-9)的對側(cè)上并入調(diào)節(jié)殘基(例如，色氨酸)。這些部分的并入必須對G9a的識別沒有不利影響，但是，它們必須合適地進(jìn)行布置使得熒光團(tuán)的FLT對于工作測定范圍來說是足夠的。
[0502]肽4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0503]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0504]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0505]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0506]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2 [0507]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
[0508]如實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述通過標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相肽合成(SPPS)合成肽。在染料連接位點(diǎn)處肽5和9包含Boc-Lys (Fmoc) -0H,而肽6~8包含F(xiàn)moc-Lys (ivDde) -0H,從而能夠得到正交的側(cè)鏈脫保護(hù)。使用HOCt/DIC活化在樹脂上用3-(9-氨基吖啶-2-基)-丙酸標(biāo)記肽，然后使用標(biāo)準(zhǔn)TFA切割混合物進(jìn)行切割。經(jīng)反相HPLC純化肽并參照9AA的摩爾消光系數(shù)進(jìn)行等分(在 1:1MeCN/ 水中在 405nm 處為 8735M_1cm_1)。
[0509]選擇Endo-LysC作為蛋白酶,原因是已知它切割賴氨酸殘基的C端,但是當(dāng)這樣的殘基被甲基化時不切割。
[0510]在384孔黑色微孔板(Greiner)中建立測定，其中每個孔包含20 μ L測定緩沖液(20mM Tris.HCl pH8.0,25mM NaCl, ImM DTT，0.025%吐溫-20)中的肽底物(I μ M)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM) (100 μ Μ)和G9a(Millipore，500nM)。測定在室溫下進(jìn)行2小時，然后使用 NanoTaurus 讀板器(Edinburgh Instruments Ltd.)測量 FLT。然后用 2nM 蛋白酶(Endo-LysC) (IOyL)處理每個孔并且將板在室溫下孵育60分鐘。然后再次測量FLT。包括不包含G9a或不包含蛋白酶的對照。測定的結(jié)果示于圖15中。
[0511]在不存在G9a處理的情況下，對于肽4觀察到FLT最大的蛋白酶依賴性提高(5.8ns)，發(fā)現(xiàn)肽9提高最小(2.4ns)。該觀察不出乎意料，原因是9AA與色氨酸之間的分隔距離在肽4中最小并且在肽9中最大。比較用G9a與不用G9a處理的孔在蛋白酶處理后FLT的提高，明顯看出對于所有的肽，暴露于G9a的那些提高較小，表明了蛋白酶保護(hù)的程度。肽9在似乎提供完全蛋白酶保護(hù)從而指明高度賴氨酸甲基化的方面是獨(dú)一無二的(SP，蛋白酶處理后的FLT與肽對照保持相同)。該肽具有預(yù)甲基化的賴氨酸-4以防止在該殘基處被切割并且它可以是在該位點(diǎn)的小修飾，對G9a比殘基缺失或替換更耐受。比較通過另外五種肽底物提供的蛋白酶保護(hù)，似乎它們中的每一種之間差異很小(圖15)。因此，決定推動使用肽4和9，原因是前者提供了最大的動態(tài)范圍，而后者似乎是G9a的更好底物。
[0512]G9a 滴定
[0513]在384孔黑色微孔板(Greiner)中將肽4和9與20 μ L測定緩沖液中的SAM(IOOyM)和不同濃度的G9a(Abcam) —起孵育。測定在室溫下進(jìn)行2小時，之后如先前所述測量FLT。然后添加2nM Endo-LysC(10 μ L/孔)并在與蛋白酶孵育10分鐘和60分鐘后再次測量FLT。
[0514]由圖16Α所示數(shù)據(jù)看出，直至添加蛋白酶后為止任一種肽的FLT都沒有明顯變化，即賴氨酸甲基化不直接引起FLT的變化。因此，蛋白酶切割后，與對照孔相比的測定孔的FLT差異是G9a活性的直接結(jié)果。
[0515]50nM G9a足以為肽4和9賦予完全的蛋白酶保護(hù)(圖16B~E)。該濃度比用于使用來自Millipore的G9a產(chǎn)生類似數(shù)據(jù)的濃度(圖15)小十倍,強(qiáng)調(diào)了 Abcam酶更大的活性。數(shù)據(jù)還示出肽9是比肽4更活潑的底物，如通過該肽在較低G9a濃度下發(fā)生蛋白酶保護(hù)所證明(圖16B~E)。該發(fā)現(xiàn)與肽9相比于肽4的較長序列提供G9a更大程度的選擇
性相一致。
[0516]比較圖16B與16C和16D與16E，清楚地看出延長與Endo-LysC的孵育(60分鐘對10分鐘)不引起FLT的可評估變化，表明在10分鐘后發(fā)生了完全切割。因此，在所有的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中在與Endo-LysC孵育10分鐘后收集數(shù)據(jù)。
[0517]甲某化的證據(jù)
[0518]為了確定底物甲基化確實(shí)在G9a存在下發(fā)生，在微型離心管中使用肽4和9進(jìn)行測定，以規(guī)律的時間間隔取樣并通過RP-HPLC和ES1-MS進(jìn)行分析。測定條件如下:測定緩沖液(150 μ L)中的肽底物(15 μ Μ)、G9a (IOOnM)、SAM (100 μ M)。使用 Luna C18 柱和 O ~50% MeCN+0.1% TFA的梯度進(jìn)行30分鐘的分析。相關(guān)譜示于圖17和18中。
[0519]對于使用肽4作用底物的測定，在與G9a延長孵育后出現(xiàn)了保留時間比底物晚的第二峰(圖17B)。當(dāng)使用肽9時，沒有看到這樣的第二峰，但是這可能是因?yàn)槭褂卯?dāng)前的梯度方法不足以分離。收集相關(guān)峰并通過ES1-MS分析以證明甲基化(圖19~20)。
[0520]保留時間比肽4晚之峰的ES1-MS分析表明它對應(yīng)于甲基化產(chǎn)物，并且清晰可見單甲基化(m/zll66)和二甲基化(m/zll80)物質(zhì)的正確質(zhì)量(圖19B)。因?yàn)閷τ谑褂秒?的測定沒有清晰可見的確定的第二峰，所以收集包含405nm吸光度的整個峰并通過ES1-MS進(jìn)行分析。不出乎意料地，在t = O時，該峰僅包含底物的質(zhì)量(m/zl936)(圖20A)。但是，在與G9a孵育6小時后，雖然一些證據(jù)表明有底物殘余，但是現(xiàn)已有單甲基化(m/zl950)和二甲基化(m/zl964)產(chǎn)物的清晰信號(圖20B)。因此，這些結(jié)果為肽4和9在暴露于甲基轉(zhuǎn)移酶G9a后轉(zhuǎn)化為其甲基化等價物提供了直接證據(jù)。
[0521]G9a測定時間討稈
[0522]測定在不同G9a濃度下使用肽4和9 (I μ Μ)在384孔微孔板中進(jìn)行，反應(yīng)用SAM(IOOyM)開始并且以規(guī)律的間隔通過添加Endo-LysC(2ηΜ)終止。孵育10分鐘后，測量FLT以證明通過G9a催化賴氨酸甲基化引起的蛋白酶保護(hù)。、[0523]如由圖21~22可看出的，在添加Endo-LysC之前任一種肽的FLT都沒有變化。但是，在添加蛋白酶并與其孵育后，F(xiàn)LT調(diào)節(jié)的程度作為G9a濃度和測定時間的函數(shù)而改變，這與賦予蛋白酶保護(hù)的賴氨酸甲基化相一致。在t = O時,用Endo-LysC處理導(dǎo)致FLT由
11.2ns提高至17.0ns (對于肽4)以及由13.5ns提高至16.5ns (對于肽9),這與無調(diào)節(jié)和蛋白酶對底物的完全切割相一致。反應(yīng)的線性對于多個時間過程是明顯的。
[0524]對SAM的依賴件
[0525]使用肽4和9 二者作為底物研究了 G9a測定對SAM的依賴性。測定在384孔微孔板中使用測定緩沖液(20 μ L)中的25ηΜ或IOnM G9a和I μ M底物進(jìn)行。SAM濃度在200 μ M至0.4μ M之間變化并且測定在室溫下孵育2小時。完成后，將Endo-LysC(2ηΜ)添加到每個孔中并在10分鐘孵育期后測量FLT。圖23中示出的數(shù)據(jù)確定了 G9a活性對SAM濃度的依賴性，Km (app) = 3 ~11 μ M。
[0526]抑制劑滴定
[0527]為了證明用于G9a的FLT蛋白酶保護(hù)測定適用于抑制劑篩選，購買了已知的非SAM競爭性G9a抑制劑BIX-01294 (Merck Chemicals Ltd.)并在測定中進(jìn)行測試。條件如下:測定緩沖液(20 μ L)中的81父-01294(20(^]?-2011]\0、69&(2511]\1或1011]\0、3八厘(1(^]\0 和肽底物(I μ Μ)。反應(yīng)在384孔微孔板中在室溫下進(jìn)行2小時并通過添加Endo-LysC (2ηΜ)終止。
[0528]將肽9作為底物，對于ΒΙΧ-01294測定IC5tl = 1.6 μ Μ，與1.9 μ M的文獻(xiàn)值相一致(Chang, Y., Zhang, X., Horton, J.R., Upadhyay, A.Κ., Spannhoff, A., Liu, J., Snyder,J.P., Bedford, Μ.T.和 Cheng, X.,Nat.Struct.Biol.,2009,16，312-317)。相比之下，使用肽4的測定恢復(fù)為IC5tl ^ 28nM(在較低抑制劑濃度下不能變平)(圖24)。值的差異可能是因?yàn)橐种频臋C(jī)制不同， 因?yàn)橐阎狟IX-01294是組蛋白H3競爭性抑制劑并且肽4和9的序列不同可影響抑制劑結(jié)合。
[0529]V -閔子
[0530]為了證明G9a FLT測定與高通量篩選(HTS)兼容，確定了 V -因子的值。
[0531]在384孔微孔板中建立測定，其中半個板包含G9a(BPS Bioscience) (625pM)、肽9(1μΜ)和SAM(lOOyM)，而另外半個板包含G9a(625pM)、肽9(1μΜ)并且不含SAM。最終測定體積為20yL，將板在室溫下孵育I小時，此時將測定緩沖液(ΙΟμ?中的Endo-LysC (2ηΜ終濃度)添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘后，測量FLT并計(jì)算Ζ’因子為0.71，證明了測定對于HTS篩選的適用性(圖75)。
[0532]總之，設(shè)計(jì)了用于FLT蛋白酶保護(hù)測定的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的新型肽底物，其并入了長壽命熒光團(tuán)(9AA)和芳族調(diào)節(jié)劑殘基(色氨酸)。已證明兩種肽在與G9a孵育后的甲基化并且已表明該過程賦予了蛋白酶保護(hù)，正如通過添加蛋白酶Endo-LysC后持續(xù)的FLT調(diào)節(jié)所確定的。通過進(jìn)行酶、SAM和抑制劑滴定驗(yàn)證了測定性能，并且測定所確定的V -因子0.71適用于HTS應(yīng)用。
[0533]考慮這樣的途徑不限于G9a，而是使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的肽底物可轉(zhuǎn)用于其他蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶。也可采用另一些長壽命熒光團(tuán)和/或調(diào)節(jié)劑。
[0534](B)用于Set7/9賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0535]在測定蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)法的另一個實(shí)例中，Set7/9(賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶)被驗(yàn)證為合適的靶標(biāo)。
[0536]Set7/9在另一些蛋白質(zhì)靶標(biāo)中使組蛋白H3的Lys4甲基化(Wilson等，Cell2002，
111,105-115) O重組Set7/9可商購自供應(yīng)商例如BPS Bioscience。
[0537]合成肽12作為Set7/9的底物，所述肽12由組蛋白H3N端序列組成并且在N端并入色氨酸殘基并且并入與賴氨酸-9殘基相連接的9-氨基吖啶熒光團(tuán)。
[0538]肽I2:WARTK4QTARK (9AA) STGGKAPRKQLAK_CONH2
[0539]甲某化的證據(jù)
[0540]將肽12(15μΜ)與測定緩沖液(20mM Tris pH8,25mM NaCl, ImM DTT，0.025%吐溫-20) (200 μ L)中的Set7/9(172nM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM) (100 μ M)孵育，以規(guī)律的時間間隔取出等量份并通過RP-HPLC和ES1-MS進(jìn)行分析以確定Set7/9對肽底物的甲基化程度。測定在室溫下進(jìn)行并分別在O小時、2小時和6小時的時間間隔取樣。
[0541 ] 通過圖36中的HPLC譜示出6小時時間過程中的測定進(jìn)展。6小時后，保留時間由tE = 18.3分鐘(在O小時)清楚地變化為tK = 18.4分鐘。通過ES1-MS分析峰確定質(zhì)量變化為14amu，這與添加一個甲基相一致(圖37)。6小時后，檢測到非常少的底物質(zhì)量(m/Z2814)，并且對應(yīng)于單甲基化肽的m/z2828作為主要物質(zhì)存在。還觀察到對應(yīng)于二甲基化肽的小峰(m/z2842)(圖37)。
[0542]為了測試Set7/9對肽12的甲基化是否提供了針對Endo-LysC催化切割的保護(hù)，用測定緩沖液將測定混合物稀釋至I μ M的濃度并將20 μ L所得溶液添加到384孔黑色微孔板的三個孔中。將10 μ L Endo-LysC (終濃度2ηΜ)添加到每個孔中并將板在室溫下孵育15分鐘后使用NanoTaurus讀板器測量FLT。包括僅有相同濃度肽的對照用于比較。
[0543]在Set7/9不存在下，在與2nM Endo-LysC孵育后肽12的FLT提高2.4ns (圖38)。相比之下，對于在與Endo-LysC孵育之前暴露于Set7/9的肽12觀察到FLT沒有顯著提高。這些發(fā)現(xiàn)與Set7/9催化的肽12甲基化提供了對于蛋白酶誘導(dǎo)切割的保護(hù)相一致。
[0544]Set7/9測定時間討稈
[0545]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進(jìn)行并且包含在測定緩沖液中的肽12(1μΜ)和Set7/9酶(100nM、50nM、25nM或12.5nM)中。以規(guī)律的間隔通過添加10 μ LEndo-LysC (終濃度2ηΜ)終止反應(yīng)。在室溫下與Endo-LysC孵育15分鐘后測量FLT。使用NanoTaurus讀板器將所有測量一式兩份地進(jìn)行。
[0546]由圖39Α可以看出，在添加Endo-LysC之前肽12的FLT變化很小。然后在添加蛋白酶并與其孵育后，F(xiàn)LT調(diào)節(jié)的程度作為Set7/9濃度和測定時間的函數(shù)而改變，這與賴氨酸甲基化賦予蛋白酶保護(hù)相一致(圖39B)。底物與產(chǎn)物之間的總壽命變化為約2.4ns。總之，通過測定的所測量熒光壽命降低來報道通過Set7/9的甲基化。
[0547]為了提高測定的總動態(tài)范圍，合成了肽13。該肽由于缺失鄰近N端的丙氨酸殘基而比肽12短一個氨基酸。預(yù)計(jì)該改變通過使色氨酸更接近9AA熒光團(tuán)使對底物FLT的調(diào)節(jié)提高。肽13所測量的FLT為13ns，比肽12的短約1.5ns,因此肽13提供了提高Set7/9測定動態(tài)范圍的機(jī)會。然而，為了實(shí)現(xiàn)這樣的提高，肽13必須被Set7/9成功甲基化。因此，為了確定Set7/9測定中肽13的活性，使用用于肽12的相同條件重復(fù)上述時間過程。
[0548]肽13: wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0549]肽13的FLT變化直至添加蛋白酶Endo-LysC之前都不明顯(圖40A)。然而，在與Endo-LysC在室溫下孵育15分鐘后，測定孔的FLT作為Set7/9濃度和測定時間的函數(shù)而改變，這與肽13的甲基化提供蛋白酶保護(hù)相一致(圖40B)。重要地，測定的最大范圍現(xiàn)已提高至4ns，從而使靈敏度提高。因此，使用肽13作為底物進(jìn)行了 Set7/9FLT測定的進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0550]S-腺苷甲硫氨酸(SAM)滴定
[0551]使用肽13作為底物研究了 Set7/9測定對SAM輔因子的依賴性。測定使用25nMSet7/9和I μ M底物在測定緩沖液(20 μ L)中在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行2小時。SAM濃度在100 μ M至1.7ηΜ之間變化。完成后，向每個孔中添加Endo-LysC (2ηΜ)并且在20分鐘孵育期后測量FLT。圖41所示數(shù)據(jù)確定了 Set7/9活性對SAM濃度的依賴性，Km (app)=500nM。
[0552]S-腺苷高半胱氨酸抑制劑滴定
[0553]為了證明用于Set7/9的FLT蛋白酶保護(hù)測定適合于抑制劑篩選，購買了已知的SAM競爭性抑制劑S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH) (Sigma)并在測定中進(jìn)行測試。條件如下:測定緩沖液(20 μ L)中的5六!1(11111至1.3 4厘)、56七7/9(501^)、SAM(500nM)和肽13(1μΜ)。反應(yīng)在384孔微孔板中在室溫下進(jìn)行2小時并且通過添加Endo-LysC (2ηΜ)終止。
[0554]對于SAH，確定了 IC5tl = 37 μ M(圖42)，這比得上所報道的使用較低濃度SAM得到的 16 μ M 的 IC50 (Gauthier, N.；Caron, M.；Pedro, L.；Arcand, M.；Blouin, J.；Labonte, A.；Normand, C ；Paquet, V.；Rodenbrock, A.；Roy, M.；Rouleau, N.；Beaudet, L.；Padr □ s, J.；Rodriguez-Suarez, R.J.Biomol.Screen.,2012,17,49-58)。
[0555]V -閔子
[0556]為了證明Set7/9FLT測定與高通量篩選(HTS)法兼容，確定了 V -因子的值。
[0557]在384孔微孔板中建立測定，其中半個板包含Set7/9(25nM)、肽13(1μΜ)和SAM(100 μ Μ)，而另外半個板包含Set7/9 (25nM)、肽13 (I μ Μ)，但是將SAM替換為測定緩沖液。最終測定體積為20 μ L，將板在室溫下孵育2小時，此時將測定緩沖液(10 μ L)中的Endo-LysC (2ηΜ終濃度)添加到每個孔中。在室溫下再孵育15分鐘后，測量FLT并計(jì)算V因子為0.81(圖43)。
[0558]總之，兩種新型肽(肽12和13)已被驗(yàn)證為用于FLT蛋白酶保護(hù)測定中賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶Set7/9的底物。測定的基礎(chǔ)是使用9AA標(biāo)記肽底物，其并入了在通過在鄰近賴氨酸殘基處特異性切割的蛋白酶Endo-LysC之作用而將調(diào)節(jié)劑與熒光團(tuán)分開之前調(diào)節(jié)9AA之FLT的芳族部分(例如色氨酸)。通過Set7/9進(jìn)行的賴氨酸甲基化賦予了免于Endo-LysC切割的保護(hù)，從而維持肽FLT的調(diào)節(jié)。因此，通過測定的所測量FLT降低來報道賴氨酸甲基化。
[0559]通過進(jìn)行酶、SAM和抑制劑滴定驗(yàn)證了 FLT Set7/9測定的性能,并且測定所確定的0.81的Z’ -因子適合于HTS應(yīng)用。
[0560]該研究為用于蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定提供了另外的示例，并且將該方法延伸到賴氨酸-4組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set7/9。
[0561](OPRMT5概念駘證FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0562]PRMT5是PRMT的概念驗(yàn)證FLT蛋白酶保護(hù)測定的合適候選物。該酶可商購自BPS Bioscience并且優(yōu)先對稱地甲基化組蛋白H4上的精氨酸3和組蛋白H3上的精氨酸8 (Branscombe 等，J Biol.Chem2001，276，32971-32976)。以下示出用于 FLT 測定的合適底物:
[0563]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0564]肽15基于組蛋白H4的N端序列，含有通過賴氨酸側(cè)鏈連接的9AA和在N端并入以調(diào)節(jié)未受損肽中9AA之FLT的色氨酸殘基。預(yù)計(jì)用Endo-ArgC處理在精氨酸_3處切割肽(由鄰近N端的絲氨酸殘基開始計(jì)數(shù))，從而將9AA與色氨酸分開，導(dǎo)致FLT提高。PRMT5對精氨酸-3的甲基化可防止通過Endo-ArgC的切割，從而維持9AA之FLT的調(diào)節(jié)。相比之下，PRMT5抑制劑的存在會防止精氨酸甲基化，從而使肽在精氨酸-3處對蛋白酶誘導(dǎo)的切割敏感。由此，9AA的FLT會提高并且提高的程度可與抑制程度相關(guān)。
[0565]Endo-ArgC 切割
[0566]為了檢查肽15的蛋白酶切割，在包含測定緩沖液(20mM Tris pH8,25mM NaCl,lmMDTT，0.025% 吐溫-20) (30 μ L)中的肽 15(1μΜ)和不同濃度 Endo-ArgC (Merck ChemicalsLtd.) (IOnM至1.25nM)的384孔微孔板中制備測定。在I小時中以規(guī)律的間隔測量FLT，并且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進(jìn)行。
[0567]經(jīng)Endo-ArgC成功切割的肽15導(dǎo)致FLT由9.4ns提高至17.2ns (圖45)。FLT的這種大的改變提供了 PRMT5之靈敏測定的可能性。
[0568]甲某化的證據(jù)
[0569]將肽15(15μΜ)與測定緩沖液(20mM Tris pH8,25mM NaCl, ImM DTT，0.025%吐溫-20) (200 μ L)中的PRMT5 (150nM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM) (100 μ Μ)孵育，以規(guī)律的時間間隔取出等量份并通過RP-HPLC和ES1-MS進(jìn)行分析以確定PRMT5對肽底物的甲基化程度。測定在室溫下進(jìn)行并分別在O小時、3.5小時和17.5小時時間間隔取樣。
[0570]通過圖46中的HPLC譜示出17.5小時時間過程中的測定進(jìn)展。17.5小時后，保留時間由tK = 20.0分鐘(在O小時)清楚地改變?yōu)閠K = 20.3分鐘。通過ES1-MS分析峰確定了由底物(m/z2466)向單甲基化產(chǎn)物(m/z2480)的質(zhì)量變化(圖47)。此外，還觀察到對應(yīng)于二甲基化肽的小峰(m/z2494)(圖47)。
[0571 ] 雖然由RP-HPLC看出反應(yīng)仍然沒有 完成，但是通過以下過程來測試用蛋白酶處理后對FLT的影響:用測定緩沖液將測定混合物稀釋15倍并且將20 μ L所得溶液添加到384孔微孔板的三個孔中。將10 μ LEndo-ArgC (終濃度為IOnM)添加到每個孔中，并且將板在室溫下孵育60分鐘后測量FLT。包括僅有相同濃度肽的對照用于比較。注意，這里使用的Endo-ArgC來自于不同供應(yīng)商(Sigma)并且證明活性小于用于產(chǎn)生圖45中數(shù)據(jù)的批次。因此，使用更高濃度和更長時間。
[0572]在PRMT5不存在下，在與IOnM Endo-ArgC孵育后，肽15的FLT提高了 6.9ns (圖48)。相比之下，對于在與Endo-ArgC孵育之前暴露于PRMT5的肽15，F(xiàn)LT提高了 4.7ns。該提高可歸因于測定混合物中存在的剩余底物，并且由于PRMT5催化的甲基化提供了蛋白酶保護(hù)而沒有實(shí)現(xiàn)完全提高。
[0573]PRMT5測定時間討稈
[0574]在384孔黑色微孔板中以20μ L體積進(jìn)行測定并且在測定緩沖液中包含肽15 (I μ Μ)和 PRMT5 酶(100ηΜ、50ηΜ、25ηΜ 或 12.5ηΜ)。以規(guī)律的間隔通過添加 10 μ LEndo-ArgC (終濃度1.25nM)終止反應(yīng)。在室溫下與Endo-ArgC孵育15分鐘后測量FLT。使用NanoTaurus讀板器將所有測量一式三份地進(jìn)行。
[0575]由圖49可以看出，在添加Endo-ArgC之前肽15的FLT沒有變化。但是，在添加蛋白酶并與其孵育后，F(xiàn)LT調(diào)節(jié)的程度作為PRMT5濃度和測定時間的函數(shù)而改變，這與精氨酸甲基化賦予蛋白酶保護(hù)相一致。因此，通過測定的所測量熒光壽命降低來報道通過PRMT5的精氨酸甲基化。
[0576]西奈芬凈抑制劑滴定
[0577]為了證明用于PRMT5的FLT蛋白酶保護(hù)測定適合于抑制劑篩選，購買了已知的通用SAM競爭性抑制劑西奈芬凈(Sigma)并在測定中進(jìn)行測試。條件如下:測定緩沖液(20 μ L)中的西奈芬凈(2mM 至 0.lyM)、PRMT5(50nM)、SAM(10yM)和肽 15 (I μ Μ)。反應(yīng)在室溫下在384孔微孔板中一式三份地進(jìn)行3小時，并且通過添加Endo-ArgC(InM)終止。對于西奈芬凈測定IC5tl為13 μ M(圖51)。該抑制劑針對PRMT5的IC5tl值先前在同行評審的文獻(xiàn)中未有報道。
[0578]總之，該工作為使用Endo-ArgC作為特異性蛋白酶的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶提供了 FLT蛋白保護(hù)測定的示例。同時，使用PRMT5進(jìn)行舉例說明，使用適當(dāng)設(shè)計(jì)的肽底物可將這樣的方法延伸至其他PRMT。
[0579](D)用于ΕΖΗ2賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0580]在測定蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)法的另一個示例中，ΕΖΗ2( —種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶)被驗(yàn)證為合適的靶標(biāo)。
[0581]ΕΖΗ2使組蛋白Η3上的賴氨酸-27甲基化并且在與四種其他蛋白質(zhì)(EED、SUZ12、RbAp48和ΑΕΒΡ2)復(fù)合時具有活性。人重組五元復(fù)合體可得自于BPS Bioscience。EZH2酶的突變與非霍奇金淋巴瘤之某些形式的惡性腫瘤的風(fēng)險提高相關(guān)(Morin，R.D.Johnson,N.A.；Severson, T.M.；Mungall, A.J.；An, J.；Goya, R.；Paul, J.E.；Boyle, M.；Woolcock,B.W.;Kuchenbauer，F(xiàn).;Yap，D.;Humphries，R.K.;Griffith，0.L ；Shah, S.;Zhu，H.；Kimbara, M.；Shashkin, P.；Chariot, J.F.；Tcherpakov, M.;Corbett，R.；Tam, A.;Varhol，R.;Smailus，D.;Moksa，M.;Zhao，Y.;Delaney，A.;Qian，H.;Birol，1.;Schein，J.；Moore, R.；Holt, R.；Horsman, D.E.；Connors, J.M.；Jones, S.；Aparicio, S.；Hirst, M.；Gascoyne, R.D.；Marra, M.A.Nat.Genet.2010，42，181-185)。因此，藥物發(fā)現(xiàn)小組努力探索有助于尋找EHZ2的小分子抑制劑的測定。
[0582]基于H3K27序列的肽是EZH2酶復(fù)合體的合適底物，并且這樣的肽被修飾成包含9AA發(fā)光團(tuán)和色氨酸殘基，從而能夠開發(fā)用于該酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定(圖68)。
[0583]肽20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2
[0584]將肽20暴露于賴氨酸特異性蛋白酶(例如Endo-LysC)將在鄰近賴氨酸_27處切害I]，導(dǎo)致9AA與色氨酸殘基的調(diào)節(jié)作用分開，導(dǎo)致FLT提高。相比之下，當(dāng)賴氨酸-27通過EZH2的作用而被甲基化時，通過Endo-LysC在該殘基處的切割不再可能，從而維持了對9AA之FLT的調(diào)節(jié)。因此，通過測定的所測量FLT降低來報道EZH2甲基化。
[0585]妝20的Endo-LysC切害
[0586]通過在測定緩沖液(20mMBicine pH7.6,50mM NaCl，0.002% 吐溫-20，0.005%BSA, ImM DTT) (20 μ L)中不同濃度的Endo-LysC (4~OnM)存在下在包含肽20 (I μ M)的384孔h1-base微孔板中研究肽20的蛋白酶切割。I小時中以規(guī)律的間隔測量FLT，并且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進(jìn)行。
[0587]通過Endo-LysC切割肽20導(dǎo)致FLT的時間和濃度依賴性提高，原因是賴氨酸_27處的切割導(dǎo)致9AA與色氨酸的調(diào)節(jié)作用分開(圖69)。FLT由12ns提高至16ns，為測定提供了良好的動態(tài)范圍。
[0588]EZH2測定時間討稈
[0589]測定在384孔h1-base黑色微孔板中以10 μ L體積進(jìn)行并且包含緩沖液(20mMBicine pH7.6,50mM NaCl，0.002 % 吐溫-20，0.005 % BSA，ImM DTT)中的肽 20 (I μ Μ)、SAM (3 μ Μ)和ΕΖΗ2復(fù)合體(200ng/孔至75ng/孔)。以規(guī)律的間隔通過添加10 μ LEndo-LysC (終濃度4ηΜ)終止反應(yīng)。在室溫下與Endo-LysC孵育35分鐘后測量FLT。所有測量使用NanoTaurus讀板器一式兩份地進(jìn)行。
[0590]由圖70可以看出，在與蛋白酶孵育后，所測量的FLT作為ΕΖΗ2濃度和測定時間的函數(shù)而降低，這與賴氨酸-27的甲基化賦予針對蛋白酶誘導(dǎo)切割的保護(hù)相一致。關(guān)于75和IOOng/孔ΕΖΗ2，響應(yīng)都是線性的，選擇后一濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。注意，由于ΕΖΗ2復(fù)合體的周轉(zhuǎn)率較低，所以使測定運(yùn)行較長的一段時間。總之，通過測定的所測量熒光壽命降低來報道通過ΕΖΗ2的甲基化。
[0591]S-腺苷甲硫氨酸(SAM)滴定
[0592]使用肽20作為底物研究了 ΕΖΗ2測定對SAM輔因子的依賴性。測定使用IOOng/孔ΕΖΗ2復(fù)合體和I μ M底物在測定緩沖液(10 μ L)中在室溫下在384孔h1-base微孔板中進(jìn)行5小時。SAM濃度在100 μ M至0.05 μ M之間變化。完成后，向每個孔中添加Endo-LysC (4ηΜ)并且在15分鐘孵育期后測量FLT。將數(shù)據(jù)在GraphPad Prism中擬合至可變斜率劑量響應(yīng)模型(variable slope dose-response model)以確定 SAM 的 Km(app)。
[0593]由圖71看出，在EZH2測定中SAM的KM(app)測定為0.71μΜ。該值與放射性計(jì)量測定形式中確定的文獻(xiàn)值 0.21 至 0.30 μ M(Sneeringer, C.J.；Scott, M.P.；Kuntz,K.W.；Knutson, S.K.;Pollock，R.M.;Richon，V.M.；Copeland, R.A.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A2010，107，20980-20985)非常吻合。
[0594]S-腺苷高半胱氨酸(SAH)抑制劑滴定
[0595]為了證明用于EZH2的FLT蛋白酶保護(hù)測定適合于抑制劑篩選，購買了已知的通用SAM競爭性抑制劑SAH(Sigma)并在測定中進(jìn)行測試。條件如下:測定緩沖液(IOyL)中的SAHdmM ~0.05 μ Μ)、ΕΖΗ2 復(fù)合體(lOOng/ 孔),SAM (3 μ Μ)和肽 20 (I μ Μ)。反應(yīng)在 384 孔h1-base微孔板中在室溫下進(jìn)行5小時(重復(fù)三次)并通過添加Endo-LysC(4nM)終止。
[0596]對于SAH,確定IC50為9.7 μ M (圖72)。針對ΕΖΗ2的該抑制劑的IC50值先前在同行評審的文獻(xiàn)中未有報道。
[0597]總之，肽20已被驗(yàn)證為用于FLT蛋白酶保護(hù)測定中賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶ΕΖΗ2的底物。測定的基礎(chǔ)是使用9ΑΑ標(biāo)記肽底物，其并入了在調(diào)節(jié)劑與熒光團(tuán)被在鄰近賴氨酸殘基處特異性切割的蛋白酶Endo-LysC之作用而分開之前調(diào)節(jié)9ΑΑ之FLT的芳族部分(例如，色氨酸)，從而維持對肽FLT的調(diào)節(jié)。因此，通過測定的所測量FLT降低來報道賴氨酸甲基化。
[0598]通過進(jìn)行酶、SAM和抑制劑滴定證明FLT ΕΖΗ2測定性能。[0599]該研究為蛋白質(zhì)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶提供了 FLT蛋白酶保護(hù)測定的另一個示例，并且將該方法延伸至賴氨酸-27組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2。
[0600]實(shí)施例3-用于蛋白質(zhì)脫甲基酶的FLT保護(hù)測定
[0601]圖25示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定蛋白質(zhì)脫甲基酶(PDM)的方法，所述脫甲基酶將一個或更多個甲基從肽/蛋白質(zhì)底物的賴氨酸或精氨酸殘基中移除。在這里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報道分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在賴氨酸或精氨酸之后切割的蛋白酶處理底物不引起蛋白質(zhì)水解并且保留了通過色氨酸的壽命調(diào)節(jié)。通過適當(dāng)PDM酶進(jìn)行賴氨酸或精氨酸脫甲基化后，然后用蛋白酶處理產(chǎn)物肽引起賴氨酸或精氨酸后的切割并且熒光團(tuán)(9AA)的壽命不再受調(diào)節(jié)。
[0602]重組PKDM(例如，LSDl，Jumonji結(jié)構(gòu)域類)酶可商購自供應(yīng)商例如BPS
Bioscience、Millipore 或 Enzo-Life Sciences。迄今為止鑒定的唯--種 PRDM 為
JMJD6 (Cheng, B.，Chen, Y.，Zhao, Y.，Bruick, R.K.，Science，2007，318，444-447)，但是最近的研究反駁其聲稱的脫甲基酶活性，認(rèn)為其主要作用是催化賴氨酸殘基的水解(Webby，C.J.，Wolf, A.，Gromak, N.，Dregerj Μ.，Kramer, H.，Kessler, B.，Neilsen，M.L，Schmitz,C，Butler, D.S.，Yates III，J.R.，Delahunty, C.M.，Hahn, P.，Lengeling，A.，Mann, M.，Proudfoot, N.J.，Schofield, C.J.和Bottger, A.，Science，2009，325，90-93)。
[0603]JHDMlA是用于PKDM之概念驗(yàn)證FLT蛋白酶保護(hù)測定的合適候選物。該酶可商購自BPS Bioscience并且優(yōu)先使組蛋白H3上的賴氨酸-36脫甲基化，將其由二甲基化或單甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為天然的未甲基化殘基(Tsukada，U.等，Nature，2006，439，811-826)。用于FLT測定的合適底物是圖26所示的肽10。
[0604]在圖26所示的這個實(shí)施例中，9AA的FLT受在C端附近合并的色氨酸殘基之存在的調(diào)節(jié)。JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化允許該殘基處的蛋白酶誘導(dǎo)切割，從而減輕調(diào)節(jié)并導(dǎo)致9AA的FLT提高。相比之下，JHDMlA抑制劑的存在可防止賴氨酸脫甲基化，從而使肽在賴氨酸-36處保留對蛋白酶誘導(dǎo)切割的抗性。因此，9AA的FLT仍受調(diào)節(jié)并且調(diào)節(jié)程度可與脫甲基化的程度相關(guān)。對于該目的合適的蛋白酶是Endo-LysC，其不切割甲基化賴氨酸(賴氨酸-37作為單甲基衍生物被保護(hù)以防止該殘基的非特異性切割)。Endo-LysC可商購自供應(yīng)商例如Thermo-Fisher。
[0605]THDMlA 測定
[0606]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進(jìn)行并且包含測定緩沖液(50mM Tris,pH7.4，100 μ M抗壞血酸鈉，10 μ M硫酸亞鐵銨，100 μ Ma-酮戊二酸鹽，0.01%吐溫-20)中的肽10(1 μ Μ)和JHDMlA酶(150ηΜ)。還包括僅包含肽的對照孔。在室溫下孵育5小時后，將IOyL Endo-LysC(30nM)添加到孔中并在室溫下將板孵育直至120分鐘。然后在NanoTaurus讀板器上一式三份地測量FLT。
[0607]肽10對照的FLT在與蛋白酶孵育后不提高，這與甲基化賴氨酸賦予蛋白酶保護(hù)導(dǎo)致固有色氨酸殘基對9AA之FLT的持續(xù)調(diào)節(jié)相一致(圖35)。相比之下，在與JHDMlA反應(yīng)后，肽10的FLT在蛋白酶處理后提高超過Ins。該結(jié)果與JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化使得肽對Endo-LysC切割敏感相一致(圖35)。因此，通過測量的熒光壽命提高來報道脫甲基酶對底物的脫甲基化，并因此報道脫甲基酶活性。[0608]這些結(jié)果證明FLT蛋白酶保護(hù)策略可延伸至測定蛋白質(zhì)脫甲基酶靶標(biāo)類。
[0609]實(shí)施例4-用于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0610]圖27示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)的方法，所述乙酰轉(zhuǎn)移酶使肽/蛋白質(zhì)底物中的賴氨酸殘基乙?；?。在這里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報道分子)的底物壽命受序列中色氨酸(或其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。用在賴氨酸之后切割的蛋白酶處理底物將引起蛋白酶水解并移除色氨酸殘基對熒光壽命的調(diào)節(jié)。通過適當(dāng)?shù)腍AT酶使賴氨酸乙?；?，然后用蛋白酶處理產(chǎn)物肽不引起賴氨酸后的切割并且熒光團(tuán)(9AA)的壽命仍受調(diào)節(jié)。
[0611]重組HAT酶(例如，Gcn5、PCAF、Hatl、p300)可商購自供應(yīng)商例如abnova或millipore。
[0612]基于在具體HAT乙?；稽c(diǎn)的賴氨酸殘基對側(cè)并入熒光團(tuán)和調(diào)節(jié)殘基的組蛋白N端序列的肽底物可形成該類酶FLT蛋白酶保護(hù)測定的基礎(chǔ)。肽16是基于具有PCAT乙酰化位點(diǎn)K14的組蛋白H3序列(圖28)。
[0613]肽16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2
[0614]妝 16 的 Endo-LysC 切割
[0615]通過在Endo-LysC (25nM)存在或不存在下，在包含測定緩沖液(50mM Tris pH8，0.1mM EDTA, ImM DTT, 0.05% BSA) (30 μ L)中的肽16 (I μ Μ)的384孔微孔板中進(jìn)行測定研究了肽16的蛋白酶切割。I小時中以規(guī)律的間隔測量FLT，并且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進(jìn)行。
[0616]當(dāng)與Endo-LysC孵育I小時后，肽16的FLT由13.9ns提高至15.7ns (圖52)。相比之下，在Endo-LysC不存在下,FLT在該時間段中保持不變。這些結(jié)果與Endo-LysC在賴氨酸-14處的切割導(dǎo)致9AA熒光團(tuán)與色氨酸殘基的調(diào)節(jié)作用分開，導(dǎo)致9AA之FLT提高相一致。還設(shè)計(jì)了第二種底物，其中9AA與色氨酸更接近(圖53)。用肽17重復(fù)如上詳述的通過Endo-LysC的切割反應(yīng),結(jié)果示于圖54中。
[0617]肽17: 9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2
[0618]對于肽17,在暴露于Endo-LysC后FLT由10.2ns提高至15.0ns,提供了 4.8ns的測定范圍，這與肽16觀察到的1.8ns范圍相比有顯著提高。此外，曲線在I小時后沒有變平，提供了通過延長切割反應(yīng)再進(jìn)一步提高測定范圍的選擇。
[0619] 乙?；淖C據(jù)
[0620]將肽17 (30 μ L)與測定緩沖液(50mM Tris ρΗ8，0.ImM EDTA, ImM DTT, 0.05% BSA)(250 μ L)中的PCAF(IOOnM)和乙酰輔酶A(AcCoA) (50 μ Μ)孵育，以規(guī)律的時間間隔取出等量份并通過RP-HPLC和ES1-MS進(jìn)行分析以確定pCAF對肽底物的乙?；潭?。測定在室溫下進(jìn)行并且分別在O分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘時間間隔取樣。
[0621]通過圖55中的HPLC譜示出了 90分鐘時間過程中的測定進(jìn)展。30分鐘后明顯有一個與底物峰(tK = 16.1分鐘)分開的新峰(tK = 16.7分鐘)出現(xiàn)。通過ES1-MS分析該峰確定tK = 16.7分鐘的新峰的質(zhì)量比底物高42amu，這與添加一個乙?；嘁恢?圖56)。到90分鐘時，底物峰可以忽略，被替換為乙酰化產(chǎn)物的峰。因此，該實(shí)驗(yàn)確定肽17是用于PCAF的良好底物。
[0622]PCAF測定時間討稈[0623]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進(jìn)行并且包含測定緩沖液中的肽17(I μ Μ)、AcCoA (50 μ Μ)和PCAF酶(250nM至3InM)。以規(guī)律的間隔通過添加10 μ LEndo-LysC (終濃度25ηΜ)終止反應(yīng)。在室溫下與Endo-LysC孵育90分鐘后測量FLT。所有的測量在NanoTaurus讀板器上一式兩份地進(jìn)行。
[0624]由圖57A可以看出，在添加Endo-LysC之前肽17的FLT變化可以忽略。但是，在添加蛋白酶并與其孵育后，F(xiàn)LT作為PCAF濃度和測定時間的函數(shù)而降低，這與賴氨酸乙?；x予了針對蛋白酶誘導(dǎo)切割的保護(hù)相一致(圖57B)。總之，通過測定的所測量熒光壽命降低來報道通過PCAF的乙酰化。
[0625]AcCoA 滴定
[0626]研究了 PCAF測定對AcCoA濃度的依賴性。測定使用125nM PCAF和I μ M肽17在測定緩沖液(20 μ L)中在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行2小時。AcCoA的濃度在25 μ M至0.02 μ M之間變化。反應(yīng)完成后，向每個孔中添加Endo-LysC (25ηΜ)并在90分鐘孵育期后測量FLT。將數(shù)據(jù)在GraphPad Prism中擬合至可變斜率劑量響應(yīng)模型以確定AcCoA的表觀Km。
[0627]由圖58看出，在PCAF測定中AcCoA的KM(app)測定為1.2 μ Μ。該值與報道的KmL 6 μ M(Poux, A.N ；Cebrat, M.；Kim, C.Μ.；Cole, P.A.；Marmorstein, R.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2002，99，14065-14070)相一致。
[0628]總之，肽17已被驗(yàn)證為用于FLT蛋白酶保護(hù)測定中組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶PCAF的底物。測定的基礎(chǔ)是使用9AA標(biāo)記的肽底物，其并入了在調(diào)節(jié)劑與熒光團(tuán)被在鄰近賴氨酸殘基處特異性切割的蛋白酶Endo-LysC之作用而分開之前調(diào)節(jié)9AA之FLT的芳族部分(例如色氨酸)。通過PCAF使賴氨酸乙?；x予了對于Endo-LysC切割的保護(hù)，從而維持了肽FLT的調(diào)節(jié)。因此，通過測定的所測量FLT降低來報道賴氨酸乙?；?。
[0629]通過進(jìn)行酶和SAM滴定驗(yàn)證FLT PCAF測定性能。
[0630]該研究使用PCAF作為代表性實(shí)例為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定提供了示例。
[0631]實(shí)施例5-用于組蛋白脫乙酰酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定
[0632]圖29示出了通過FLT蛋白酶保護(hù)法測定組蛋白脫乙酰酶(HDAC)的方法，所述脫乙酰酶使肽/蛋白質(zhì)底物的賴氨酸殘基脫乙酰化。在這里，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報道分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的熒光壽命調(diào)節(jié)劑)之存在的調(diào)節(jié)。底物由于賴氨酸殘基的乙?；再|(zhì)而被保護(hù)免于被賴氨酸特異性蛋白酶切割，從而維持熒光團(tuán)的FLT調(diào)節(jié)。通過適當(dāng)HDAC的脫乙酰化使得肽在賴氨酸處對蛋白酶誘導(dǎo)切割敏感，導(dǎo)致熒光團(tuán)與調(diào)節(jié)序列分開并且FLT隨之提高。重組HDAC酶(例如，HDACl-1K SIRT1-5)可商購自供應(yīng)商例如 Millipore, Signalchem, Sigma-Aldrich, EnzoLife Sciences 或 BPS Bioscience。
[0633]如圖30所示的底物可適用于基于FLT的蛋白酶保護(hù)測定。在這里，在鄰近脫乙?；馁嚢彼岬腃端并入了熒光團(tuán)(9AA)，并且色氨酸(或其他合適的調(diào)節(jié)殘基)布置在前述賴氨酸的N端側(cè)上。在HDAC催化脫乙?；蟮牡鞍酌刚T導(dǎo)切割導(dǎo)致FLT提高，原因是9AA與色氨酸殘基被分開。因此，F(xiàn)LT的提高可與HDAC活性直接相關(guān)。當(dāng)然，考慮根據(jù)所討論HDAC的序列特異性可采用其他類似地設(shè)計(jì)的底物。[0634]HDACl是用于組蛋白脫乙酰酶之概念驗(yàn)證FLT蛋白酶保護(hù)測定的合適候選物，原因是它是可商購自供應(yīng)商例如BPS Bioscience的被很好表征的酶。雖然已報道HDACl使組蛋白H3上的賴氨酸-27脫乙?；俏墨I(xiàn)的證據(jù)表明HDACl和其他成員可識別包含圖30所示類型的乙?；嚢彼釟埢亩屉牡孜?Riester, D.；Hildmann, C ；Griinewald, S.；Beckers, T.；Schwienhorst, A.Biochem.Biophys.Res.Commun.2007, 357,439-445)。因此，用于HDAC1FLT蛋白酶保護(hù)測定的合適底物是以下和圖59示出的肽18
[0635]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2
[0636]肽19 =Ac-1ffKK (9AA) -CONH2
[0637]在肽18的乙?；嚢彼釟埢腘端側(cè)是色氨酸殘基，并且在C端側(cè)有其側(cè)鏈標(biāo)記有9AA熒光團(tuán)的賴氨酸殘基。在未受損的底物中，9AA的FLT受位于附近的色氨酸殘基調(diào)節(jié)。通過HDACl使賴氨酸殘基脫乙酰化以形成肽19 (圖60)使得肽對適當(dāng)酶(例如胰蛋白酶)在該位點(diǎn)的切割敏感，導(dǎo)致9AA與色氨酸分開，導(dǎo)致FLT提高。將底物18暴露于胰蛋白酶玉引起切割，原因是所述蛋白酶不識別乙?；嚢彼帷４送?，HDACl抑制劑的存在將阻止賴氨酸脫乙酰化，從而保留肽對蛋白酶誘導(dǎo)切割的抗性。因此，9AA的FLT仍受調(diào)節(jié)并且調(diào)節(jié)程度可與抑制程度相關(guān)。
[0638]肽18和19的胰蛋白酶切割
[0639]為了檢查肽18和19的蛋白酶切割，在包含測定緩沖液(25mM Tris pH8,137mMNaCl,2.7mM KCl, ImM MgCl2,0.01% BSA) (30 μ L)中的肽 18 (I μ M)或 19 (I μ Μ)和不同濃度胰蛋白酶(625ρΜ至OpM)的384孔微孔板中制備測定。I小時中以規(guī)律的間隔測量FLT，并且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進(jìn)行。
[0640]當(dāng)將肽18暴露于不同 濃度的胰蛋白酶時沒有觀察到FLT提高，這與該蛋白酶不能在乙?；嚢彼岣浇懈钕嘁恢?圖61A)。相比之下，當(dāng)將對應(yīng)的脫乙?；?9與胰蛋白酶孵育時，F(xiàn)LT具有時間和濃度依賴性提高，原因是賴氨酸處的切割導(dǎo)致9AA與色氨酸的調(diào)節(jié)作用分開(圖61B)。FLT由5.5ns提高至16ns，提供了 10.5ns的優(yōu)良測定范圍。
[0641]脫乙酰化的證據(jù)
[0642]將肽18 (15 μ M)與測定緩沖液(25mM Tris pH8,137mM NaCl,2.7mM KCl, ImMMgCl2,0.01% BSA) (200 μ L)中的HDACl (200nM)孵育，以規(guī)律的時間間隔取出等量份并通過RP-HPLC和ES1-MS進(jìn)行分析以確定HDACl對肽底物的脫乙?；潭?。測定在室溫下進(jìn)行并且分別在O小時、2小時、4小時和6小時時間間隔取樣。
[0643]通過圖62中的HPLC譜示出了 6小時時間過程中的測定進(jìn)展。2小時后，明顯有一個與底物峰(tK = 21.2分鐘)分開的新峰(tK = 19.1分鐘)出現(xiàn)。通過ES1-MS分析峰確定了 tK = 16.7分鐘的新峰的質(zhì)量比底物小42amu，這與失去一個乙?；嘁恢?圖63)。但是正如通過tK = 21.2分鐘的底物峰的持續(xù)存在所證明的，反應(yīng)在6小時后似乎沒有達(dá)到完成，其原因可能是試劑隨時間降解。該實(shí)驗(yàn)確定了肽18是用于HDACl的底物。
[0644]HDACl測定時間討稈
[0645]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進(jìn)行并且包含測定緩沖液中的肽
18(I μ Μ)和HDACl酶(200ηΜ至25ηΜ)。以規(guī)律的間隔通過添加10 μ L胰蛋白酶(終濃度IOnM)終止反應(yīng)。在室溫下與Endo-LysC孵育10分鐘后測量FLT。所有的測量在NanoTaurus讀板器上一式兩份地進(jìn)行。[0646]由圖64A可以看出，在添加胰蛋白酶之前FLT的改變可以忽略。但是，在添加蛋白酶并與其孵育后，F(xiàn)LT作為HDACl濃度和測定時間的函數(shù)而提高，這與賴氨酸脫乙?；沟秒膶Φ鞍酌刚T導(dǎo)切割敏感相一致(圖64B)。使用200nM HDACl在2小時后導(dǎo)致完全脫乙?；?，正如通過FLT值的平臺所表明的；而25恤HDACl導(dǎo)致信號隨時間線性提高。總之，通過測定的所測量熒光壽命提高來報道通過HDACl的乙?；?。
[0647]底物滴定
[0648]研究了 HDACl測定對肽底物濃度的依賴性。測定使用25nM HDACl在測定緩沖液(20 μ L)中在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行I小時。肽18的濃度在40 μ M至0.3 μ M之間變化。反應(yīng)完成后，向每個孔中添加胰蛋白酶(IOnM)并在10分鐘孵育期后測量FLT。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物形成速率并且在GraphPad Prism中擬合到Michaelis-Menten模型以確定底物ΚΜ。
[0649]由圖65看出，在HDACl測定中底物18的Km確定為22.5 μ Μ。該值與HDAC測定中采用的其他短妝底物(Riester, D.；Hildmann, C ；Griinewald, S.；Beckers, T.；Schwienhorst,A.Biochem.Biophys.Res.Commun.2007, 357,439-445)相一致。
[0650]曲古抑菌素A抑制劑滴定
[0651]為了證明用于HDACl的FLT蛋白酶保護(hù)測定適合于抑制劑篩選，購買了已知的通用型HDAC抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)并在測定中進(jìn)行測試。條件如下:測定緩沖液(20 μ L)中的TSA (I μ M至5.6nM) ,H DACl (25ηΜ)和肽18 (10 μ Μ)。反應(yīng)在室溫下在384孔微孔板中一式三份地進(jìn)行1.5小時，并且通過添加胰蛋白酶(IOnM)終止。
[0652]TSA 的 IC50 測定為 0.89ηΜ(圖 66)，這與文獻(xiàn)報道的 1.3ηΜ 的 IC50(Hailey, F.；Reinshagen, J.；Ellinger, B.；ffolf, Μ.；Niles ；Α.Μ.；Evans, N.J.；Kirkland, Τ.A.；Wagner, J.M.；Jung, M.；Gribbon, P.;Gul, S.J.Biomol.Screen.2011,16,1227-1235)相一致。
[0653]V -閔子
[0654]為了證明HDAC1FLT測定與高通量篩選(HTS)兼容，確定了 V -因子的值。
[0655]在384孔微孔板中建立測定，其中板的一半包含HDACl (25nM)和肽18 (10 μ M)，而另一半包含HDACl (25ηΜ)、肽18 (10 μ Μ)和TSA抑制劑(I μ Μ)。最終測定體積為20 μ L并且將板在室溫下孵育1.5小時，此時向每個孔中添加測定緩沖液(10 μ L)中的胰蛋白酶(IOnM終濃度)。在室溫下再孵育15分鐘后，測量FLT并計(jì)算V-因子為0.85(圖67)，證明測定適合于HTS篩選。
[0656]總之，肽18已被驗(yàn)證為FLT蛋白酶保護(hù)測定中組蛋白脫乙酰酶HDACl的底物。測定的基礎(chǔ)是使用9ΑΑ標(biāo)記的肽底物，其并入了在調(diào)節(jié)劑與熒光團(tuán)被在鄰近賴氨酸(或精氨酸)殘基處特異性切割的蛋白酶胰蛋白酶之作用而分開之前調(diào)節(jié)9ΑΑ之FLT的芳族部分(例如，色氨酸)。HDACl的賴氨酸脫乙?；沟秒膶σ鹊鞍酌傅那懈蠲舾?，由于9ΑΑ熒光團(tuán)與調(diào)節(jié)劑被分開而導(dǎo)致FLT提高。因此，通過測定的所測量FLT提高來報道賴氨酸脫乙?；?。
[0657]通過進(jìn)行酶、底物和抑制劑滴定證明了 FLT HDACl測定性能，并且0.85的Ζ’ -因子確定測定適合于HTS應(yīng)用。
[0658]該研究使用HDACl作為代表性實(shí)例為組蛋白脫乙酰酶的FLT蛋白酶保護(hù)測定提供了示例。
[0659]實(shí)驗(yàn)-材料和方法
[0660]以下章節(jié)提供了用于實(shí)施例1至5的實(shí)驗(yàn)方案、材料和方法的另一些細(xì)節(jié)。
[0661]概沭
[0662]除非另有說明，否則試劑和溶劑購買自Sigma-Aldrich、Merck Chemicals、NewEngland Biolabs、Thermo_Fisher或Rathburn并且以供應(yīng)原樣使用。人重組PAD4酶通過Insight Biotechnology 購買自 Origene。人重組 G9a 酶購買自 Millipore、Abcam 或 BPSBioscience (通過 AMSBio, UK)。人重組 PAD2 酶購買自 Modiquest Research、Ni jmegen、TheNetherlands。人重組 JHDMlA、Set7/9、PRMT5、HDACl 和 EZH2/EED/SUZ12/RbAp48/AEBP2 復(fù)合體通過 AMSBio，UK 購買自 BPS Bioscience 并且人重組 PCAF 購買自 Enzo Life Sciences。3-(9-氨基Π丫唳-2-基)-丙酸由Almac Sciences, Craigavon, NI制備并且以供應(yīng)原樣使用ο 384孔微孔板購買自Greiner (#781076或784076)。
[0663]質(zhì)譜得自于Bruker microTOF電噴霧MS。分析型RP-HPLC使用AgilentllOO或1200系列HPLC系統(tǒng)進(jìn)行，所述系統(tǒng)使用Phenomenex Luna C18柱(250X4.6mm)和包含0.1% TFA的水/乙腈梯度，流速為Iml/分鐘。制備型RP-HPLC使用Gilson HPLC系統(tǒng)進(jìn)行，所述系統(tǒng)由Gilson305泵、Gilson811C動態(tài)混合器和ABI783A UV檢測器組成，并且使用Phenomenex Luna C18 柱(250 X 21.2mm)和包含 0.1% TFA 的水 / 乙臆梯度，流速為 9ml/分鐘。
[0664]突光壽命在NanoTaurus突光壽命讀板器(Edinburgh Instruments Ltd.)上采用時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(time-correlated single photo counting,TCSPC)進(jìn)行測量。激發(fā)源是405nm的半導(dǎo)體激光，其以5MHz的重復(fù)頻率產(chǎn)生皮秒光脈沖。通過帶寬20nm的438nm帶通濾波器(Semrock)收集發(fā)射。在峰通道中收集3000次計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)并使用雙指數(shù)衰減模型(biexponential decay model)計(jì)算平均壽命。
[0665]肽合成
[0666]使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc/tBu SPPS化學(xué)，在具有0.20~0.25mMol Rink酰胺樹脂的ABI433肽合成器上進(jìn)行自動化固相肽合成，每個偶聯(lián)循環(huán)使用lmmol Fmoc-氨基酸和HOCt (1-羥基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯)或Oxyma Pure (2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸乙酯)/DIC (N，N' - 二異丙基碳二亞胺)偶聯(lián)劑。通過用0.5M乙酸酐的DMF溶液處理來封閉未反應(yīng)的氨基。通過用20% v/v哌啶的DMF溶液處理20分鐘進(jìn)行Fmoc移除。當(dāng)熒光團(tuán)標(biāo)記是通過賴氨酸殘基進(jìn)行時，根據(jù)染料連接位點(diǎn)在肽序列N端還是肽序列內(nèi)，使用Boc-Lys (Fmoc)-OH或Fmoc-Lys (ivDde)-OH構(gòu)件有助于正交脫保護(hù)。通過用3%肼的DMF溶液處理從樹脂上移除ivDde基團(tuán)。
[0667]通過以下過程進(jìn)行3_(9_氨基B丫唳_2_基)_丙酸對妝的手動標(biāo)記:將染料(相對于樹脂為2當(dāng)量)溶解于最小體積的DMF中，以及用0.5M HOCt (1-羥基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯)(3當(dāng)量)和0.5M DIC(2當(dāng)量)的DMF溶液通過超聲活化30分鐘。然后將活化的染料添加到樹脂中，在DMF中預(yù)膨脹，并且在室溫下將反應(yīng)混合物超聲攪拌5小時后使其在室溫下靜置過夜。過濾樹脂，用DMF和DCM徹底清洗并在真空中下干燥過夜。
[0668]在伴有側(cè)鏈脫保護(hù)的情況下，通過用92.5% TFA v/v,5% H2O v/v,2.5% TIS v/v處理4小時將肽從固相中切割下來。通過過濾移除樹脂，粗制肽從冰冷的醚中沉淀出來并、且通過以4000rpm離心5分鐘進(jìn)行收集。然后將粗制肽溶解于MeCN/H20(50: 50)中并凍干，然后通過制備型HPLC純化至>95%的純度。基于87351^(?^的9AA摩爾消光系數(shù)(在I: IMeCN/水中405nm處)將標(biāo)記的肽等分，并且在Varian Cary50UV紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行測量。
[0669]緩沖備件
[0670]PAD4 和 PAD2 緩沖液由 pH8.0 的 20mM Tris/HCl, 200 μ M CaCl2, 5mM DTT 和 0.01 %CHAPS構(gòu)成。
[0671]G9a、Set7/9 和 PRMT5 緩沖液由 ρΗ8.0 的 20mM Tris/HCl, 25mM NaCl，ImM DTT 和
0.025%吐溫-20構(gòu)成。
[0672]JHDMlA緩沖液由pH7.4的50mM Tris/HCl, 100 μ M抗壞血酸鈉，10 μ M硫酸亞鐵銨，100 μ Ma-酮戊二酸鹽和0.01 %吐溫-20構(gòu)成。
[0673]HDACl 緩沖液由 ρΗ8.0 的 25mM Tris/HCl, 137mM NaCl，2.7mM KCl，ImM MgCl2,0.01% BSA 構(gòu)成。
[0674]pCAF 緩沖液由 ρΗ8.0 的 50mM Tris/HCl,0.1mM EDTA，0.05% BSA, ImM DTT 構(gòu)成。
[0675]EZH2 緩沖液由 ρΗ7.6 的 20mM Bicine, 50mM NaCl，0.002% 吐溫-20，0.005% BSA，ImM DTT 構(gòu)成。
[0676]切害1丨測丨定
[0677]將相關(guān)測定緩沖液(10 μ L)中的Endo-LysC或胰蛋白酶添加到384孔微孔板的孔中。還可包括其中將蛋白酶替換為測定緩沖液的對照。通過添加測定緩沖液(IOyL)中的肽底物開始反應(yīng)并且以 規(guī)律的間隔測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0678]PAD4 測定
[0679]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為300 μ L。通過將肽添加到包含重組PAD4酶的溶液中開始反應(yīng)。測定中PAD4的終濃度為30ηΜ并且肽的終濃度為15 μ M0在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0分鐘、30分鐘和60分鐘，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1%甲酸的I: IMeCN/水)中用于分析。
[0680]當(dāng)確證了肽底物的瓜氨酸化后，用測定緩沖液將測定混合物稀釋15倍，轉(zhuǎn)移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)并測量FLT。然后將胰蛋白酶(測定緩沖液中IOyL)添加到每個孔中并且在室溫下將板孵育10分鐘。然后再次測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行，并且孔中胰蛋白酶的終濃度為ΙΟηΜ。
[0681]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(IOyL)中的重組PAD4酶的孔中添加測定緩沖液(IOyL)中的肽I。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中PAD4的終濃度在125至500ρΜ之間變化，同時肽I的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始并且90分鐘后通過添加胰蛋白酶(測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度IOnM) —起終止。在室溫下孵育10分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。
[0682]對于底物滴定，向包含測定緩沖液(10 μ L)中不同濃度的肽I的孔中添加測定緩沖液(IOyL)中的PAD4。將板在室溫下孵育I小時，然后將10 μ L測定緩沖液中的胰蛋白酶添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘后測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。[0683]對于V-因子確定，384孔微孔板的一半裝有10 μ L測定緩沖液中的PAD4和肽I。其余的孔裝有10 μ L不包含CaCl2的測定緩沖液中的PAD4和肽I。將板密封并在室溫下孵育I小時。然后將10 μ L測定緩沖液中的胰蛋白酶添加到每個孔中，在室溫下孵育10分鐘后測量FLT。試劑的終濃度為:PAD4(125pM);肽I (200nM);胰蛋白酶(IOnM)。
[0684]PAD2 測定
[0685]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為300 μ L。通過將肽I添加到包含重組PAD2酶的溶液中開始反應(yīng)。測定中PAD2的終濃度為30ηΜ并且肽的終濃度為15 μ Μ。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0分鐘、30分鐘和120分鐘，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1%甲酸的I: IMeCN/水)中用于分析。
[0686]當(dāng)確證了肽底物的瓜氨酸化后，用測定緩沖液將測定混合物稀釋15倍，轉(zhuǎn)移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)并測量FLT。然后將胰蛋白酶(測定緩沖液中IOyL)添加到每個孔中并且在室溫下將板孵育10分鐘。然后再次測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行，并且孔中胰蛋白酶的終濃度為ΙΟηΜ。
[0687]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(IOyL)中的重組PAD2酶的孔中添加測定緩沖液(IOyL)中的肽I。還包括僅含肽或瓜氨酸化肽的對照。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中PAD2的終濃度在23.5至1.5ηΜ之間變化，同時肽I的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始并且60分鐘后通過添加胰蛋白酶(測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度IOnM) —起終止。在室溫下孵育10分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分 鐘并測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0688]G9a 測定
[0689]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為150yL。通過將SAM(100 μ Μ)添加到包含重組G9a酶的溶液中開始反應(yīng)。測定中G9a的終濃度為100 μ M并且肽的終濃度為15 μ M0在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0分鐘、2小時和6小時，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用于分析。
[0690]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(5yL)中的重組G9a酶的孔中添加測定緩沖液(IOyL)的肽。通過添加SAM(5yL)開始反應(yīng)。振搖板，然后用蓋玻片密封。G9a濃度在200nM與1.5nM之間變化并且SAM濃度在200與0.4 μ M之間變化。肽的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始并且在2小時后通過添加Endo-LysC (測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度2ηΜ) —起終止。在室溫下孵育10分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。
[0691]對于抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與G9a(5 μ L)在室溫下預(yù)孵育30分鐘后添加肽5 (5 μ L)和SAM (5 μ L)。包括不包含SAM或抑制劑的對照。
[0692]對于V -因子確定，384孔微孔板的一半裝有10 μ L測定緩沖液中的G9a、肽9和SAM。其余的孔裝有10 μ L G9a和肽9并且不存在SAM。將板密封并在室溫下孵育I小時。然后將10 μ L測定緩沖液中的Endo-LysC添加到每個孔中，在室溫下孵育10分鐘后測量FLT。試劑的終濃度為:G9a(625pM)』?9(1μΜ) ;Endo_LysC(2ηΜ)。
[0693]Set7/9 測定
[0694]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為200 μ L。通過將SAM添加到包含重組Set7/9酶和肽12的溶液中開始反應(yīng)。測定中試劑的終濃度為172nM(Set7/9) UOO μ M(SAM)和15 μ M(肽12)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):O小時、2小時和6小時，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(CrawfordScientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用于分析。
[0695]當(dāng)確證了肽底物的甲基化后，用測定緩沖液將測定混合物稀釋15倍，轉(zhuǎn)移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)并測量FLT。然后將Endo-LysC (測定緩沖液中10 μ L)添加到每個孔中并且在室溫下將板孵育15分鐘。然后再測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行，并且孔中Endo-LysC的終濃度為2ηΜ。
[0696]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(10 μ L)中的重組Set7/9酶和肽12或13的孔中添加測定緩沖液的SAM(10 μ L)。還包括僅包含肽的對照。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中Set7/9的終濃度在IOOnM與
12.5nM之間變化，同時肽和SAM的濃度分別維持在I μ M和100 μ M不變。測定在不同時間開始并且在120分鐘后通過添加Endo-LysC (測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度2ηΜ) —起終止。在室溫下孵育15分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。所有的測量一式兩份地進(jìn)行。
[0697]對于抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與Set7/9 (5 μ L)和肽13 (5 μ L)在室溫下預(yù)孵育10分鐘后添加SAM(10 μ L) 。包括不包含SAM或不包含抑制劑的對照。
[0698]對于V -因子確定，將10 μ L包含測定緩沖液中的Set7/9和肽13的溶液添加到384孔微孔板的每個孔中。向板的一半中添加10μ L測定緩沖液，同時向另一半中添加測定緩沖液(IOyL)中的SAM以使反應(yīng)開始。將板密封并在室溫下孵育2小時。然后將測定緩沖液(IOyL)中的Endo-LysC添加到每個孔中，在室溫下孵育15分鐘后測量FLT。試劑的終濃度為:Set7/9(25nM) ；SAM(100yM)』--3(1μΜ) ;Endo_LysC(2ηΜ)。
[0699]PRMT5 測定
[0700]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為200 μ L。通過將SAM添加到包含重組PRMT5酶和肽15的溶液中開始反應(yīng)。測定中試劑的終濃度為150nM(PRMT5)、100 μ M(SAM)和15 μ M(肽15)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):O小時、3.5小時和17.5小時，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1 %甲酸的1:1MeCN/水)中用于分析。
[0701]當(dāng)確證了肽底物的甲基化后，用測定緩沖液將測定混合物稀釋15倍，轉(zhuǎn)移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)并測量FLT。然后將Endo-ArgC (測定緩沖液中10 μ L)添加到每個孔中并且在室溫下將板孵育15分鐘。然后再測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行，并且孔中Endo-ArgC的終濃度為ΙΟηΜ。
[0702]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(?ο μ L)中的重組PRMT5酶和肽15的孔中添加測定緩沖液中的SAM (10 μ L)。還包括僅包含肽的對照。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中PRMT5的終濃度在IOOnM與12.5nM之間變化，同時肽15和SAM的濃度分別維持在I μ M和100 μ M不變。測定在不同時間開始并且在120分鐘后通過添加Endo-ArgC (測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度1.25ηΜ) 一起終止。在室溫下孵育15分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。所有的測量一式兩份地進(jìn)行。
[0703]對于抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與PRMT5/肽15 (5 μ L)在室溫下預(yù)孵育30分鐘后添加SAM (5 μ L)。測定在室溫下運(yùn)行3小時并通過添加10 μ L Endo-ArgC終止。在室溫下孵育I小時后測量FLT。還包括不包含PRMT5或不包含抑制劑的對照。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0704]ΕΖΗ2 測丨定
[0705]酶滴定在室溫下在384孔h1-base微孔板中進(jìn)行,測定體積為10 μ L/孔。向包含測定緩沖液(5 μ L)中的重組ΕΖΗ2復(fù)合體的孔中添加測定緩沖液(5 μ L)中的肽20/SAM混合物。還包括不含ΕΖΗ2的對照。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中ΕΖΗ2的終濃度在IOOng/孔與75ng/孔之間變化，同時肽20和SAM的濃度分別維持在I μ M和3 μ M不變。測定在不同時間開始并且在6小時后通過添加Endo-LysC(測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度4ηΜ) 一起終止。在室溫下孵育35分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。所有的測量一式兩份地進(jìn)行。
[0706]對于SAM滴定，向包含測定緩沖液(2.5 μ L)中的不同濃度SAM的孔中添加測定緩沖液(2.5 μ L)中的ΕΖΗ2復(fù)合體。通過添加測定緩沖液(5 μ L)中的肽20而開始反應(yīng)。在室溫下將板孵育5小時，然后將10 μ L測定緩沖液中的Endo-LysC添加到每個孔中。在室溫下再孵育15分鐘后，測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0707]對于抑制劑滴定，將化合物(2.5 μ L)與ΕΖΗ2復(fù)合體(2.5 μ L)在室溫下預(yù)孵育20分鐘后添加測定緩沖液(5yL)中的肽20/SAM混合物。測定在室溫下運(yùn)行5小時并通過添加10 μ L Endo-LysC終止。在室溫下孵育I小時后測量FLT。包括不包含ΕΖΗ2或抑制劑的對照。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0708]THDMlA 測定
[0709]測定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(IOyL)中的重組JHDMlA酶的孔中添加測定緩沖液(IOyL)中的肽10。包括兩組僅含肽10的對照孔。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中JHDMlA的終濃度為150ηΜ，肽10的終濃度為I μ Μ。在室溫下孵育5小時后，將Endo-LysC (測定緩沖液中10 μ L ;終濃度IOnM)添加到測定孔和一組對照孔中。向另一組對照孔中添加10 μ L測定緩沖液。在室溫下孵育120分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0710] PCAF 測丨定
[0711]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為250yL。通過將AcCoA添加到包含重組PCAF酶和肽17的溶液中開始反應(yīng)。測定中試劑的終濃度為IOOnM(PCAF)、50 μ M(AcCoA)和30 μ M(肽17)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):
O分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用于分析。[0712]酶滴定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(IOyL)中的重組PCAF酶的孔中添加測定緩沖液(IOyL)中的肽17/AcCoA混合物。還包括不包含PCAF的對照。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中PCAF的終濃度在250nM與31.3nM之間變化，同時肽17和AcCoA的濃度分別維持在I μ M和50 μ M不變。測定在不同時間開始并且在120分鐘后通過添加Endo-LysC (測定緩沖液中的10 μ L ;終濃度25ηΜ) —起終止。在室溫下孵育90分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。所有的測量一式兩份地進(jìn)行。
[0713]對于AcCoA滴定，向包含不同濃度AcCoA(測定緩沖液中5 μ L)中添加5 μ L測定緩沖液中的肽17然后添加IOyL測定緩沖液中的PCAF。將板在室溫下孵育2小時，然后將10 μ L測定緩沖液中的Endo-LysC添加到每個孔中。在室溫下再孵育90分鐘后，測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0714]HDACl 測定
[0715]為了 HPLC監(jiān)測，測定在微型離心管中在室溫下進(jìn)行，總測定體積為200 μ L。通過將肽18添加到包含重組HDACl酶的溶液中開始反應(yīng)。測定中試劑的終濃度為200nM(HDACl)和15 μ M(肽18)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0小時、2小時、4小時和6小時，然后添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統(tǒng)中，收集相關(guān)峰并稀釋于MS緩沖液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用于分析。
[0716]酶滴定在室溫下在384孔微孔板中進(jìn)行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩沖液(10 μ L)中的重組HDACl酶的孔中添加測定緩沖液(10 μ L)中的肽18。還包括僅包含肽的對照。振搖板，然后用蓋玻片密封。測定中HDACl的終濃度在200ηΜ與25ηΜ之間變化，同時肽18的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始并且在2小時后通過添加胰蛋白酶(測定緩沖液中10 μ L ;終濃度IOnM) —起終止。在室溫下孵育10分鐘后，以500rpm將微孔板離心I分鐘并測量FLT。所有的測量一式兩份地進(jìn)行。
[0717]對于底物滴定，向包含測定緩沖液(10 μ L)中的不同濃度肽18的孔中添加測定緩沖液(?ο μ L)中的HDAC1。將板在室溫下孵育I小時，然后將10 μ L測定緩沖液中的胰蛋白酶添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘后測量FLT。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0718]對于抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與HDACl (5 μ L)在室溫下預(yù)孵育30分鐘后添加測定緩沖液(10 μ L)中的肽18。測定在室溫下運(yùn)行1.5小時并通過添加10 μ L胰蛋白酶終止。在室溫下孵育10分鐘后測量FLT。包括不包含HDACl或不包含抑制劑的對照。所有的測量一式三份地進(jìn)行。
[0719]對于Ζ’-因子確定，384孔微孔板的一半裝有5 μ L測定緩沖液和5 μ L測定緩沖液中的HDACl。其余的孔裝有測定緩沖液中的5μ L TSA抑制劑和5μ L HDACl。在室溫下預(yù)孵育30分鐘后，將10 μ L測定緩沖液中的肽18添加到每個孔中。密封板并在室溫下孵育
1.5小時。然后將10 μ L測定緩沖液中的胰蛋白酶添加到每個孔中并在室溫下孵育15分鐘后測量FLT。試劑的終濃度為:HDACl(25nM) JSA(IyM)JilS(IOyM);胰蛋白酶(ΙΟηΜ)。
[0720]本文引用的所有專利公開和科學(xué)參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文。
【權(quán)利要求】
1.測定受試樣品中修飾酶之活性的方法，其包括: (a)使所述受試樣品與熒光受調(diào)節(jié)之酶底物相接觸，所述底物包含與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)所述熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合的接頭分子，其中所述底物通過所述修飾酶的作用來修飾以形成經(jīng)修飾底物，由于所述修飾而使得所述經(jīng)修飾底物之所述接頭分子在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間對第二種酶的切割敏感或者保護(hù)所述經(jīng)修飾底物之所述接頭分子在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間免于被第二種酶切割，其中通過所述第二種酶切割所述底物或所述經(jīng)修飾底物將含有所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之所述底物的一部分與含有所述熒光部分之所述底物的一部分分開；以及 (b)通過檢測由所述第二種酶對所述經(jīng)修飾底物和/或所述底物之作用而引起的所述熒光部分之所述熒光壽命的變化來檢測所述經(jīng)修飾底物的形成，其中所述經(jīng)修飾底物的形成為所述修飾酶的活性提供指示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的所述接頭分子是肽接頭，并且所述第二種酶是這樣的蛋白酶:其切割所述肽接頭或通過所述修飾酶對所述肽接頭之作用而形成的經(jīng)修飾肽接頭，以將含有所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之所述底物的一部分與含有所述熒光部分之所述底物的一部分分開。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述肽接頭能夠被所述蛋白酶切割，其中所述切割將含有所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之所述底物的一部分與含有所述熒光部分之所述底物的一部分分開，并且所述修飾酶對所述肽接頭的修飾保護(hù)所述經(jīng)修飾肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié) 劑部分之間免于被所述蛋白酶切割，與未經(jīng)修飾的肽接頭相比，蛋白酶處理之后所述熒光部分之所述熒光壽命的時間依賴性降低表明所述經(jīng)修飾肽接頭的形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述經(jīng)修飾肽接頭通過所述肽接頭中氨基酸殘基的甲基化來形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述修飾酶是蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶是組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PKMT)，例如 G9a、Set7/9、GLP 或 EZH2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶是組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)，例如 PRMT1、PRMT3、PRMT4/CARM1 或 PRMT5。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述經(jīng)修飾肽接頭通過所述肽接頭中氨基酸殘基的乙?；瘉硇纬?。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述修飾酶是乙酰轉(zhuǎn)移酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述乙酰轉(zhuǎn)移酶是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，例如Gcn5、PCAF、Hatl 或 p300。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述經(jīng)修飾肽接頭通過所述肽接頭中氨基酸殘基的脫亞氨化來形成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述修飾酶是脫亞氨酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述脫亞氨酶是肽基精氨酸脫亞氨酶，例如PAD 1、PAD2、PAD3、PAD4 或 PAD6。
14.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間不能被所述蛋白酶切割，并且所述修飾酶對所述肽接頭的修飾使得所述經(jīng)修飾肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間對所述蛋白酶的切割敏感，與未經(jīng)修飾的肽相比，蛋白酶處理之后所述熒光部分之所述熒光壽命的時間依賴性提高表明所述經(jīng)修飾肽接頭的形成。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述經(jīng)修飾肽接頭通過所述肽接頭中甲基化氨基酸殘基的脫甲基化來形成。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述修飾酶是脫甲基酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述脫甲基酶是組蛋白脫甲基酶，例如LSD1、JHDMlA 或 JMJD6。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述經(jīng)修飾肽接頭通過所述肽接頭中乙?；被釟埢拿撘阴；瘉硇纬?。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述修飾酶是脫乙酰酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述脫乙酰酶是組蛋白脫乙酰酶，例如HDACl-1l 或 SIRT1-5。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述熒光部分選自9-氨基吖啶及其衍生物、吖啶酮衍生物、吖啶、喹吖啶和吖啶鑛.部分。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分選自:吲哚基部分，包括氨基酸色氨酸側(cè)鏈中存在的吲哚基部分；酚部分，包括氨基酸酪氨酸側(cè)鏈中存在的酚部分；咪唑部分，包括氨基酸組氨酸側(cè)鏈中存在的咪唑部分；和芐基部分，包括氨基酸苯丙氨酸的芐基側(cè) 鏈；苯氧基部分；萘基丙氨酸部分；咔唑部分和吩噻嗪部分。
23.篩選酶抑制劑的方法，所述方法包括在受試化合物存在下使用權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的方法測定所述酶的活性，其中在所述受試化合物存在下酶活性的降低將所述受試化合物鑒定為所述酶的抑制劑。
24.熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其包含與熒光部分和配置成調(diào)節(jié)所述熒光部分之熒光壽命的熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分相綴合的接頭分子，其中所述底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經(jīng)修飾底物，由于所述修飾而使得所述經(jīng)修飾底物之所述接頭分子在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間對第二種酶的切割敏感或者保護(hù)所述經(jīng)修飾底物之所述接頭分子在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間免于被第二種酶切割，其中通過所述第二種酶切割所述底物或所述經(jīng)修飾底物將含有所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之所述底物的一部分與含有所述熒光部分之所述底物的一部分分開。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的所述接頭分子是肽接頭，并且所述第二種酶是這樣的蛋白酶:其切割所述肽接頭或通過所述修飾酶對所述肽接頭之作用而形成的經(jīng)修飾肽接頭，以將含有所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之所述底物的一部分與含有所述熒光部分之所述底物的一部分分開。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其中所述肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間能夠被所述蛋白酶切割，并且通過所述修飾酶對所述肽接頭的修飾保護(hù)所述經(jīng)修飾肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間免于被所述蛋白酶切割。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其用于測定甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物具有式(I)或(I’)所示結(jié)構(gòu)
F1-X1-N1-X2-M (I) M-X1-N1-X2-F1 (I，) 其中Xl表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與Xl (或在I’中與X2)綴合的所述熒光部分，NI表示通過所述甲基轉(zhuǎn)移酶之作用而甲基化的氨基酸殘基，X2表示第二氨基酸序列并且M表示與X2(或在I’中與XI)綴合的所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其選自:
肽 4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
肽 5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
肽 6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
肽 7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
肽 8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
肽 9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
肽 12: wartk4qtark (9AA) stggkaprkqlak-conh2
肽 13: wrtk4qtark(9AA)stggkaprkqlak-conh2
肽 14: WsGR3GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH2
肽 15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK-CONH2
肽 20:PRKQLATK(9 AA)AARK27SAPATGGW-C0NH2。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其用于測定乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物具有式(III)或(III’ )所示結(jié)構(gòu)
F1-X3-N2-X4-M (III) M-X3-N2-X4-F1 (III，) 其中X3表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X3 (或在III’中與X4)綴合的所述熒光部分，N2表示通過所述乙酰轉(zhuǎn)移酶之作用而乙?；陌被釟埢?，X4表示第二氨基酸序列并且M表示與X4(或在III’中與X3)綴合的所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其選自:
肽 16:wqtark (Me) Stggk14Aprk (9AA) Qlatk-COnh2
肽 17:9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其用于測定脫亞氨酶的活性，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物具有式(V)或(V’)所示結(jié)構(gòu)
F1-X5-R-X6-M (V) M-X5-R-X6-F1 (V，) 其中X5表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示X5(或在V’中X6)的所述熒光部分，R表示通過所述脫亞氨酶之作用而轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二氨基酸序列并且M表示與X6 (或在V’中與X5)綴合的所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其是:
肽 1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2，或
肽 3:K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-C0NH2。
33.根據(jù)權(quán)利要求25所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其中所述肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間不能被所述蛋白酶切割，并且所述修飾酶對所述肽接頭的修飾使得所述經(jīng)修飾肽接頭在所述熒光部分與所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間對所述蛋白酶的切割敏感。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其用于測定脫甲基酶的活性，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物具有式(VII)或(VII’)所示結(jié)構(gòu)
F1-X7-N3(Me)-X8-M (VII)
M-X7-N3(Me)-X8-F1 (VII，) 其中X7表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X7 (或在VII’中與X8)綴合的所述熒光部分，N3(Me)表示通過所述脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化氨基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二氨基酸序列并且M表示與X8 (或在VII’中與X7)綴合的所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其是:
肽 10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2 或
肽 11:9AA-ATGGVK36 (Me) KPHw-CONH2。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其用于測定脫乙酰酶的活性，其中所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物具有式(IX)或(IX’)所示結(jié)構(gòu)
F1-X9-N4(Ac)-XlO-M (IX)
M-X9-N4 (Ac)-XlO-Fl (IX，) 其中X9表示第一氨基酸序列，F(xiàn)l表示與X9 (或在IX’中與X10)綴合的所述熒光部分，M(Ac)表示通過所述脫乙酰酶之作用而脫乙酰化的乙?；被釟埢?例如，乙?；嚢彼峄?，XlO表示第二氨基酸序列并且M表示與XlO (或在IX’中與X9)綴合的所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，其是Ac-Trp-Xaa-Lys (Ac) -Lys (9AA)或肽 18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2。
38.用于測定甲基轉(zhuǎn)移酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求27或權(quán)利要求28所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間切割所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的蛋白酶。
39.用于測定乙酰轉(zhuǎn)移酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間切割所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的蛋白酶。
40.用于測定脫亞氨酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求31或權(quán)利要求32所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間切割所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的蛋白酶。
41.用于測定脫甲基酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間切割在殘基N3處脫甲基化的所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的經(jīng)修飾形式。
42.用于測定脫乙酰酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求36或權(quán)利要求37所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶在熒光部分與熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分之間切割在殘基N4處脫乙酰化的所述熒光受調(diào)節(jié)之酶底物的經(jīng)修飾形式。
43.根據(jù)權(quán)利要求24至27、29、31、33、34或36中任一項(xiàng)所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，或根據(jù)權(quán)利要求38至42中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述熒光壽命調(diào)節(jié)劑部分選自:吲哚基部分，包括氨基酸色氨酸側(cè)鏈中存在的吲哚基部分；酚部分，包括氨基酸酪氨酸側(cè)鏈中存在的酚部分；咪唑部分，包括氨基酸組氨酸側(cè)鏈中存在的咪唑部分；和芐基部分，包括氨基酸苯丙氨酸的芐基側(cè)鏈；苯氧基部分；萘基丙氨酸部分；咔唑部分和吩噻嗪部分。
44.根據(jù)權(quán)利要求24至27、29、31、33、34或36中任一項(xiàng)所述的熒光受調(diào)節(jié)之酶底物，或根據(jù)權(quán)利要求38至42中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述熒光部分選自9-氨基吖啶及其衍生物、吖啶酮衍生物、 吖啶、喹吖啶和吖啶'輪部分。
【文檔編號】C12Q1/00GK103476944SQ201280014940
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月25日
【發(fā)明者】格雷厄姆·科頓, 科林·鄧斯莫爾 申請人:艾爾瑪可科學(xué)（蘇格蘭）有限公司