專利名稱：單順反子基因表達(dá)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的基因工程技術(shù)，具體涉及一種單順反子基因表達(dá)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的高效表達(dá)必須依賴好的表達(dá)載體。影響外源基因高效表達(dá)的因素很多，如啟動子、甲基化、基因本身結(jié)構(gòu)、插入位點(diǎn)、調(diào)控序列(增強(qiáng)子、絕緣子、核基質(zhì)結(jié)合區(qū))等。CAG啟動子是人工構(gòu)建的組合啟動子，由巨細(xì)胞病毒(thecytomegalovirus，CMV)早期增強(qiáng)子(early enhancer element)和雞 β-肌動蛋白(chicken beta-act in)啟動子組成，CAG啟動子是非特異性的組成型啟動子，用于驅(qū)動基因在哺乳動物載體的高水平表達(dá)。本研究所用初始載體pCAG-1RES2-AcGFPl，是本研究室由pCAGEN載體上的CAG啟動子移植并替換 pCMV-1RES2-AcGFPl 中的 CMV，同時以 pCAGEN載體上 Rabbit globin po IyA 移植并替換pCMV-1RES2-AcGFPl中的SV40polyA而得到的。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)是真核生物染色質(zhì)中與核基質(zhì)或核骨架特異結(jié)合的一段DNA序列。MARs參與DNA復(fù)制調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種核生化過程。我們從?；蚪M克隆獲得的MARs序列大小為1203bp，AT含量為62. 31 %，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該序列也含有一個典型的DNA解旋序列(aatatt). —個潛在的T-box(taatcaa)和一個潛在的 TATA-box(tataat)序列結(jié)構(gòu)。研究表明,MARs序列的功能包括邊界因子(boundarye Iement)作用、染色質(zhì)調(diào)節(jié)作用、DNA復(fù)制起始子的組分、染色體結(jié)構(gòu)組成作用、MARs對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控作用，鑒于MARs與基因表達(dá)間的關(guān)系 ，尤其它能顯著地增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)、克服位置效應(yīng)、消除轉(zhuǎn)基因沉默，它已被作為一種順式調(diào)控元件應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因技術(shù)中?；虮磉_(dá)盒研究現(xiàn)狀，利用去除質(zhì)粒載體主干序列的基因表達(dá)盒(僅包括啟動子、編碼區(qū)和終止子)作為基因轉(zhuǎn)移體，也稱為潔凈DNA轉(zhuǎn)化(clean DNA transformation)，主要是通過基因槍轉(zhuǎn)化植物，已在水稻、棉花、小麥、葡萄轉(zhuǎn)化中獲得成功應(yīng)用，利用花粉管導(dǎo)入法在甜瓜中也成功利用，而很少見在轉(zhuǎn)基因動物尤其哺乳動物中的構(gòu)建與應(yīng)用。本研究中為了提高基因表達(dá)盒在哺乳動物中的轉(zhuǎn)染和整合及表達(dá)效率，在基因表達(dá)盒的上游和下游各加了一個牛的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MARs)，構(gòu)建制備成MAR-CAG-FATl-polyA-MAR單順反子基因表達(dá)盒，作為基因轉(zhuǎn)移體，用于轉(zhuǎn)基因動物尚未見報(bào)道。它是潔凈的、安全的基因轉(zhuǎn)移體，為轉(zhuǎn)基因動物研究提供新的思路和途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供無質(zhì)粒載體主干序列、無任何選擇標(biāo)記、具安全性的組成型單順反子基因表達(dá)盒，即MAR-CAG-FATl-polyA-MAR，獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下以雙順反子質(zhì)粒載體P MAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-po IyA-MAR為初始質(zhì)粒載體，經(jīng)用EcoR I和Not I雙酶切，將FSTN、IRES、AcGFPl切掉，選取剩余部分，與上游引入EcoR I和Hind III兩個酶切位點(diǎn)，下游引入Not I酶切位點(diǎn)的中間序列T連接，構(gòu)建成中間質(zhì)粒載體PMAR-CAG-T-PolyA-MA以制備單順反子基因表達(dá)盒的母載體，即利用EcoR/IHindI I I和Not I以任一目的基因替換T序列，即獲得單順反子基因表達(dá)盒，如用雙酶切以 Hind II1-FATl-Not I 替換 Hind III—T-Not 獲得 pMAR-CAG-FATl-polyA-MAR 質(zhì)粒載體，用Sacl和AflII雙酶切即分離到MAR-CAG-FATl-polyA-MAR基因表達(dá)盒，獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體。本發(fā)明的單順反子基因表達(dá)試劑盒無主干載體序列和任何選擇標(biāo)記，避免了它們對轉(zhuǎn)基因動物以及人類帶來的潛在危害，是具轉(zhuǎn)基因安全性的基因轉(zhuǎn)移體。


圖1 :初始質(zhì)粒載體 P MAR-CAG-FSTN-1 RES-AcGFP1-po I yA-MAR 的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 :中間質(zhì)粒載體pMAR-CAG-T-Po I yA-MAR結(jié)構(gòu)示意圖；圖3 :單順反子基因表達(dá)盒質(zhì)粒載體pMAR-CAG-FATl-polyA結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式1. MAR-CAG-FATl-polyA-MAR 基因表達(dá)盒的構(gòu)建利用圖1所示的質(zhì)粒載體pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR作為初始載體構(gòu)建沒有主干載體序列、沒有抗性基因、沒有熒光標(biāo)記的安全載體，先用EcoR I和Not I對質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，將FSTN、IRES、AcGFPl切掉，再插入一段中間序列T，通過此序列引入新的合適的酶切位點(diǎn)，再通過新的酶切位點(diǎn)插入FATl序列。2.中間序列T的獲得通過PCR反應(yīng)從PMD19T-simple vector上獲得含有HindIII酶切位點(diǎn)的序列，方便外源基因FATl的插入。PCR的引物設(shè)計(jì)上游引物引入EcoR I和HindIII兩個酶切位點(diǎn)，下游引物引入Not I酶切位點(diǎn)，PCR引物如下所示TPE3 正義鏈5' AATCGgaattcAATCGaagcttTATCCGCCTCCATCCAGTCT 3'TPE4 反義鏈5' AATCGgcggccgcTTCCGTGTCGCCCTTATTCC 3'PCR反應(yīng)條件(1)95°C 5min(2) 95 °C 30s(3) 60 °C 30s(4) 72°C 50s(5)72。。7min
(2)-(4)重復(fù)35個循環(huán)通過此反應(yīng)即可獲得該中間T序列，片斷大小為657bp。測序通過膠回收的方法回收該片段，連接到PMD19T_simplevector上,轉(zhuǎn)化并涂平板，挑菌并搖菌，通過菌液PCR檢測所挑菌落是否為陽性，最后將陽性菌液送去測序，留一部分保菌。3.將T片斷插入到酶切載體中獲得中間質(zhì)粒載體測序結(jié)果回來后，與原序列進(jìn)行比對，選擇測序結(jié)果正確的菌液進(jìn)行提質(zhì)粒，對所提質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Not I雙酶切，獲得的片段通過EcoR I和Not I兩個酶切位點(diǎn)插入到初始的酶切載體中，并進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，以確保外源基因正確插入，獲得的中間載體質(zhì)粒pMAR-CAG-T-polyA-MAR，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。4.獲得FATl序列哺乳動物自身不能合成ω-3多不飽和脂肪酸，所以通常處于供應(yīng)不足的狀態(tài)，其營養(yǎng)需求必需從攝食中獲得。ω_3多不飽和脂肪酸去飽和酶基因fat-Ι是合成ω-3系列不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶。研究表明，fat-Ι基因促使ω-6系列不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的ω-3系列不飽和脂肪酸。希望可以生產(chǎn)高表達(dá)ω-3系列多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因家畜。為方便目的片斷插入載體中，上游引物5’端引入一個HindIII酶切位點(diǎn)，下游引物引入一個Not I酶切位點(diǎn)，前面分別添加5個保護(hù)堿基，如下所示FAF3 正義鏈5' AATCGaagctt CTGGTTATTGTGCTGTCTCAT 3'FAR4 反義鏈5' AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG 3'使用上述引物從含F(xiàn)ATl基因序列的cDNA庫中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下(1)95°C 5min(2) 95 °C 30s(3) 58°C 30s(4) 72°C lmin20s(5) 72 °C 7min(2)-(4)重復(fù)35個循環(huán)通過此反應(yīng)即可獲得FATl序列的全長片斷，片斷大小為1182bp。通過膠回收的方法回收該片段,連接到PMD19T_simple vector上,轉(zhuǎn)化并涂平板，挑選菌株并擴(kuò)增，通過菌液PCR檢測所挑菌落是否為陽性，最后將陽性菌株進(jìn)行測序，留一部分保菌。5.將FATl序列插入到載體中測序結(jié)果回來后，與原序列進(jìn)行比對，選擇測序結(jié)果正確的菌液進(jìn)行提質(zhì)粒，對所提質(zhì)粒進(jìn)行HindIII和Not I雙酶切，獲得的片段通過HindIII和Not I兩個酶切位點(diǎn)插入到中間載體中，并進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，以確保外源基因正確插入，得到單順反子質(zhì)粒載體pMAR-CAG-FATl-polyA-MAR，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示。6.獲得 MAR-CAG-FAT1-po IyA-MAR 基因表達(dá)試劑盒
pMAR-CAG-FATl-po lyA-MAR質(zhì)粒載體構(gòu)建完畢后，用Sac1、AflII雙酶切，即可獲得MAR-CAG-FATl-polyA-MAR基因表達(dá)盒，其全序列為SEQ NO.1。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞整合與表達(dá)的鑒定一、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的獲得通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，具體步驟如下1、DNA的準(zhǔn)備酶切并回收基因表達(dá)盒MARCAGFATlpolyAMAR2、細(xì)胞的準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前一天解凍骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將重懸后的細(xì)胞按合適密度鋪到24孔板的6個空中(每個孔的密度為70% -80% )，每孔加500微升細(xì)胞培養(yǎng)液(成分為DMEM+10% FBS)對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。3、轉(zhuǎn)染(I)轉(zhuǎn)染試劑的配制每孔需加200微升轉(zhuǎn)染試劑，其成分為200微升opti-MEM+2微升LTX+0. 67微升plus+500 納克 DNA。配制過程如下向opt1-MEM加入適量的DNA，徹底混勻；再向其中加入適量的plus輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；最后向其中加入適量的LTX，徹底混勻后室溫靜置30分鐘。(2)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的處理在轉(zhuǎn)染試劑靜置30分鐘的過程中可以對待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行處理，處理過程如下將孔中原有的細(xì)胞培養(yǎng)液吸走，用500微升的DPBS洗兩遍，再用500微升的opt1-MEM洗一遍，將原有培養(yǎng)液中的FBS徹底去除。(3)轉(zhuǎn)染待轉(zhuǎn)染試劑靜置30分鐘后，用移液器吹吸7-8次混勻，將孔中的opt i-MEM去除，吸取200微升轉(zhuǎn)染試劑逐滴緩慢地加入到孔中，將培養(yǎng)板輕輕前后晃動幾次，確保轉(zhuǎn)染試劑均勻覆蓋在細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(4)換液轉(zhuǎn)染4-6小時后，將每個孔中的轉(zhuǎn)染試劑去除，加入500微升的DMEM+10FBS，繼續(xù)培養(yǎng)。二、外源基因整合檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)三天后，此時外源基因已經(jīng)穩(wěn)定整合，消化三個孔的細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA的提取，以其為模版，通過PCR的方法檢測外源基因的整合情況。上游引物在FATl 5'端，下游引物在MAR序列3'端，PCR產(chǎn)物3000bp。將PCR的結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，三個樣品所對應(yīng)的泳道在3000bp附近均有目的條帶，說明這三個孔的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因在DNA水平已經(jīng)正常整合。三、外源基因表達(dá)檢測轉(zhuǎn)染后的第四天，對剩余三個孔的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取，隨即對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)后的cDNA為模版進(jìn)行RT-PCR，從而檢測外源基因在RNA水平是否表達(dá)。所用引物為外源基因FATl的全長擴(kuò)增引物，因此PCR產(chǎn)物長度為1258bp。將RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示，三個樣品所對應(yīng)的泳道在1258bp附近均有目的條帶，說明這三個孔的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中外源基因在RNA水平已經(jīng)正常表達(dá)。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的MAR-CAG-FATl-polyA-MAR獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體可以有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)染、整合與表達(dá)，且無任何質(zhì)粒載體主干序列和任何選擇性抗性基因及標(biāo)志基因，是安全有效的新型基因轉(zhuǎn)移體。當(dāng)理解的是，本發(fā)明的具體實(shí)施例僅僅是出于示例性說明的目的，其不以任何方式限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.單順反子基因表達(dá)試劑盒，其含有獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體MAR-CAG-FATl-polyA-MAR，其中MAR為牛核基質(zhì)結(jié)合區(qū)；CAG為啟動子；FAT1為n_3去飽和酶基因；polyA為終止區(qū)；所述的獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體無主干載體序列和任何選擇標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單順反子基因表達(dá)試劑盒，所述獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體的全序列為SEQ NO. lo
3.權(quán)利要求1或2所述的單順反子基因表達(dá)試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟 利用圖1所示的質(zhì)粒載體pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR作為初始載體構(gòu)建沒有主干載體序列、沒有抗性基因、沒有熒光標(biāo)記的安全載體，先用EcoR I和Not I對質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，將FSTN、IRES、AcGFPl切掉，再插入一段中間序列T，通過此序列引入新的酶切位點(diǎn),再通過新的酶切位點(diǎn)插入FATl序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，所述的新的酶切位點(diǎn)是HindIII酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的FATl序列通過如下引物進(jìn)行PCR獲得 FAF3正義鏈5' AATCGaagctt CTGGTTATTGTGCTGTCTCAT 3' FAR4反義鏈 5' AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG 3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于插入FATl序列通過Sac1、Afl II雙酶切獲得MAR-CAG-FATl-polyA-MAR單順反子基因表達(dá)盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種單順反子基因表達(dá)試劑盒及其制備方法，其含有獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體MAR-CAG-FAT1-polyA-MAR，其中MAR為牛核基質(zhì)結(jié)合區(qū)；CAG為啟動子；FAT1為n-3去飽和酶基因；polyA為終止區(qū)。本發(fā)明的單順反子獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體無主干載體序列和任何選擇標(biāo)記，避免了它們對轉(zhuǎn)基因動物以及人類帶來的潛在危害，是具轉(zhuǎn)基因安全性的獨(dú)立基因轉(zhuǎn)移體。
文檔編號C12N15/63GK103031324SQ20121055493
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者李光鵬, 胡曉明, 楊磊, 諶顏, 于超然, 扈廷茂 申請人:內(nèi)蒙古大學(xué)