專利名稱：一種冬蟲夏草原草粉的雙重pcr鑒真方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥材鑒真領(lǐng)域，具體涉及冬蟲夏草原草粉的鑒真方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草在傳統(tǒng)上多為煎湯或燉服，由于未打破蟲草的細(xì)胞壁，有效成分難以溶出，不利于人體吸收。為提高冬蟲夏草的利用效率，增加人體對冬蟲夏草有效成分的吸收，有效的方法是將冬蟲夏草粉碎后，制成片劑、膠囊劑、丸劑、酒劑等劑型產(chǎn)品后服用。以往通過形態(tài)識別，優(yōu)質(zhì)的原草容易為消費者接受，但經(jīng)過粉碎加工以后，消費者的接受程度就大大降低。冬蟲夏草原草深加工產(chǎn)品品質(zhì)控制已成為制約冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)發(fā)展和升級的關(guān)鍵問題。目前，針對冬蟲夏草與其形態(tài)相似偽品的鑒別研究已有多個專利報道，2000年11月12日公開的中國專利CN 1274010A和2001年6月6日公開的中國專利CN 1298024A分別針對冬蟲夏草菌種的rDNA間區(qū)和18S rDNA進行引物和探針設(shè)計，實現(xiàn)在分子水平上對冬蟲夏草菌種的道地性鑒別。2011年6月8日公開的中國專利CN 102086471A針對冬蟲夏草菌種的rDNA間區(qū)進行研究，并建立了一種既能鑒別冬蟲夏草真?zhèn)?、又能明確其含量的分子鑒別技術(shù)；2011年10月26日公開的中國專利CN 102226217A則針對冬蟲夏草菌種的18S rDNA進行引物設(shè)計，并開發(fā)出試劑盒應(yīng)用于冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別。以上鑒別方法主要應(yīng)用于冬蟲夏草及其形態(tài)相似偽品的區(qū)分，而對冬蟲夏草原草粉的鑒真無顯著效果，難以在保證冬蟲夏草原草粉的品質(zhì)上發(fā)揮作用。因此，在本領(lǐng)域需要有一種新的檢測方法用于冬蟲夏草原草粉的鑒真，實現(xiàn)對其品質(zhì)的控制和管理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可用于冬蟲夏草原草粉鑒真的可靠方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明根據(jù)冬蟲夏草的組成特點，設(shè)計冬蟲夏草菌種和寄主蝠蛾特征性持家基因的PCR引物，進行一次單管雙重PCR反應(yīng)，同時擴增冬蟲夏草菌種和寄主蝠蛾特征性持家基因，實際擴增片斷分別為320bp和136bp。用于冬蟲夏草原草粉鑒真的引物序列如下:冬蟲夏草菌種特征性持家基因擴增引物:上游引物CICC-Oph-Fl:5，-GCCAATCCCATCAACAT-3，下游引物CICC-Oph-Rl:5，-CACCACCAACGACAAAA-3’冬蟲夏草寄主蝠蛾特征性持家基因擴增引物:上游引物CICC-H印-Fl:5’ -GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’下游引物CICC-H印-Rl:5’ -CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
I)犾取樣品基因組DNA;
2)采用上述弓丨物在PCR儀上進行PCR擴增；PCR 擴增反應(yīng)體系為 25 ii L，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5yL，4 條引物(10 u mol/L)各 I ii L，10 ii mol/L 的 dNTP 2u L,2.5U 的 Taq 酶 0.5 y L，DNA 模板 1.0 y L，ddH20 15 u L0PCR擴增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，進入循環(huán):95°C 10s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。3) PCR擴增產(chǎn)物用2 %的瓊脂糖凝膠進行檢測。

4)樣品的真實性判斷在紫外燈下查看電泳條帶，在136和320bp處有明亮條帶的為冬蟲夏草原草，僅在320bp具有明亮條帶的是冬蟲夏草菌絲體產(chǎn)品，在136和320bp處均無條帶為偽品。本發(fā)明經(jīng)過充分的前期試驗篩選和優(yōu)化，得到的引物特異性強，PCR擴增條件簡單，采用一次單管多重PCR反應(yīng)后，通過電泳檢測便可鑒別產(chǎn)品真?zhèn)?，操作簡單，成本低，?zhǔn)確度高，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1和圖2分別為冬蟲夏草菌種MAT1-2-1基因及其寄主蝠蛾COI基因的特異性引物設(shè)計示意圖，其中有下劃線的部分為擴增片段對應(yīng)的核苷酸序列，有下劃線的斜體部分為所設(shè)計的引物特異性結(jié)合位點。圖3為PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，l-DL2000Marker, 2_冬蟲夏草原草粉，3-冬蟲夏草菌粉，4-蝙蝠蛾擬青霉菌粉，5-蛹蟲草菌粉，6-陰性對照，7-DL2000Marker0具體實施案例下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明進行具體說明，實施案例是為了進一步闡述本發(fā)明，而不會給本發(fā)明造成任何限制。實施例一:PCR引物的設(shè)計及其對樣品的檢測IPCR引物的設(shè)計1.1冬蟲夏草菌種MAT1-2-1基因特異性引物的設(shè)計根據(jù)GenBank上公開登錄的冬蟲夏草MAT1_2_1基因序列信息進行引物設(shè)計(見圖1)。參考序列的 GenBank 登錄號為:FJ654171 (Ophiocordyc印s sinensis, MATl-2-lgene，complete cds, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ654171)。在18-34處設(shè)計上游引物，命名為CICC-0ph-Fl。序列為:5’~GCCMTCCCA TCMCAT-3’。在320-337 處設(shè)計下游引物，命名為 ClCOOph-Rl。序列為:5’-CACCACCMCGACMAA-3’。1.2冬蟲夏草寄主蝠蛾COI基因特異性引物的設(shè)計根據(jù)GenBank上公開登錄的冬蟲夏草寄主蝠蛾COI基因序列信息進行引物設(shè)計(見圖2)。參考序列的GenBank 登錄號為:HM595857 (Ahamus yushuensis, cytochromeoxidasesubunit I (COI) gene, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/HM595857)。在346-365 處設(shè)計上游弓丨物，命名為 cioc-Hep-Fi。序列為:5’"Ggggcatcagtagatttagc-S’。
在461-481處設(shè)計下游引物，命名為CICC-Hep-Rl。序列為:5 ’ -CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’。2樣品的檢測2.1樣品的收集購買市售冬蟲夏草原草粉、冬蟲夏草菌粉、蝙蝠蛾擬青霉菌粉、蛹蟲草菌粉。2.2樣品基因組DNA提取采用改良CTAB法提取基因組DNA，并使用OMEGA公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒對其進行純化。2.3基因組DNA的多重PCR擴增PCR 擴增反應(yīng)體系為 25 ii L，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5yL，4 條引物(10 u mol/L)各 I ii L，10 ii mol/L 的 dNTP 2u L,2.5U 的 Taq 酶 0.5 y L，DNA 模板 1.0 y L，ddH20 15 u L0PCR擴增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，進入循環(huán):95 °C 10s，58 °C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。2.4PCR產(chǎn)物檢 測PCR擴增產(chǎn)物在2 %瓊脂糖凝膠中電泳，在136和320bp處出現(xiàn)明亮條帶的為冬蟲夏草原草，僅在320bp具有明亮條帶的是冬蟲夏草菌絲體產(chǎn)品，在136和320bp處均無條帶為其他樣品(詳見圖3)。
權(quán)利要求
1.一種冬蟲夏草原草粉的鑒真方法，其特征在于:經(jīng)過一次簡單的單管雙重PCR同時檢測冬蟲夏草菌種和寄主蝠蛾特征性持家基因。
2.按照權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草原草粉鑒真方法，其特征在于:用于檢測冬蟲夏草菌種和寄主蝠蛾特征性持家基因的引物分別為: 冬蟲夏草菌種特征性持家基因擴增引物:上游引物 CICC-Oph-Fl:5’ -GCCAATCCCATCAACAT-3’下游引物 CICC-Oph-Rl:5’ -CACCACCAACGACAAAA-3’ 冬蟲夏草寄主蝠蛾特征性持家基因擴增引物: 上游引物 CICC-H印-Fl:5’ -GGGGCATCAGTAGAITTAGC-3’ 下游引物 CICC-H印-Rl:5’ -CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’。
3.按照權(quán)利要求2所述的冬蟲夏草原草粉鑒真方法，其特征在于:PCR擴增反應(yīng)體系為25iiL，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5yL，4 條引物(10umol/L)各 IuL, 10umol/L的 dNTP 2u L,2.5U 的 Taq 酶 0.5 y L，DNA 模板 1.0u L, ddH2015 u L。
4.按照權(quán)利要求3所述的冬蟲夏草原草粉鑒真方法，其特征在于:所述PCR擴增的反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，進入 循環(huán):95°C 10s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環(huán)，然后72°C延伸5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草原草粉的雙重PCR鑒真方法。其技術(shù)方案是以冬蟲夏草原草粉基因組DNA為模板，采用本發(fā)明設(shè)計的PCR引物，進行一次單管雙重PCR反應(yīng)，同時擴增冬蟲夏草菌種及其寄主蝠蛾的特征性持家基因，實際擴增片斷分別為320bp和136bp，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定產(chǎn)品的真實性。本發(fā)明可特異性識別冬蟲夏草原草粉，只需DNA提取、PCR擴增和電泳檢測三步即可完成對樣品的真實性檢測，操作簡單、易于掌握、準(zhǔn)確性高。
文檔編號C12Q1/04GK103233062SQ20121050671
公開日2013年8月7日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者程池, 扎西才吉, 李輝, 姚粟, 劉洋, 白飛榮 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院, 玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司