專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)(r, r)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn){R，奶-2，3-丁二醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2，3- 丁二醇(2，3-Butanediol)是一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料以及航空航天等多個(gè)領(lǐng)域，具有良好的應(yīng)用前景；同時(shí)，通過(guò)特定的化學(xué)反應(yīng)，2，3- 丁二醇可以衍生出多種重要的化學(xué)品如3-羥基丁酮、甲乙酮及1，3-丁二烯。因此，它被視作一種極具潛力的平臺(tái)化合物。
2，3-丁二醇分子內(nèi)含有兩個(gè)手性碳原子，因此存在三種立體異構(gòu)體。其中{R，R)~2, 3- 丁二醇不僅具有混旋型2，3- 丁二醇的一般功能，而且還可以用于制備手性化學(xué)品以及作為高級(jí)防凍劑。目前，{R,R)-2, 3- 丁二醇的生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法，先由I- 丁醇脫水得1_ 丁烯，再經(jīng)加成得2-氯-丁烷，再消除得2- 丁烯，再與次溴酸反應(yīng)生成3-溴-2- 丁醇，然后在堿液中水解可得到2，3-丁二醇的外消旋混合物，最后通過(guò)外消旋體的拆分得到{R，7 ) 2，3-丁二醇(紀(jì)曉俊，聶志奎，黎志勇，高振，黃和.化學(xué)進(jìn)展，2010，22:2450-2461);但是化學(xué)合成法過(guò)程繁瑣，最后還需要通過(guò)化學(xué)法進(jìn)行手性拆分，因此成本高、難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。在制備化學(xué)品的方法中，微生物制造方法與化學(xué)合成法相比，其原料豐富、工藝簡(jiǎn)單、環(huán)境友好，因此越來(lái)越受到各國(guó)科學(xué)家的青睞。據(jù)報(bào)道，傳統(tǒng)的天然微生物一般都生成兩種不同構(gòu)型2，3- 丁二醇的混合物，至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)單一生成某種構(gòu)型2，3- 丁二醇的微生物(CeliAska E, Grajek, ff. Biotechnol Adv, 2009, 27: 715 - 725)。利用傳統(tǒng)的天然微生物發(fā)酵法難以實(shí)現(xiàn)單一構(gòu)型的2，3-丁二醇的高純積累，而且由于不同立體構(gòu)型2，3- 丁二醇的物理化學(xué)性質(zhì)十分相近，實(shí)現(xiàn)其分離很困難，故通過(guò)構(gòu)建能夠產(chǎn)單一構(gòu)型2，3- 丁二醇的基因工程菌則有望解決該問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，目前構(gòu)建出的基因工程菌都只能在IPTG存在的情況下表現(xiàn)出較強(qiáng)的外源蛋白表達(dá)和目標(biāo)產(chǎn)物積累的能力，且產(chǎn)^奶-2，3-丁二醇的能力均偏低。誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且價(jià)格相對(duì)昂貴，若利用基因工程菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，誘導(dǎo)劑的添加必會(huì)大幅增加成本，不利于{R，奶-2，3-丁二醇的規(guī)?；a(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)^奶_2，3-丁二醇的基因工程菌，該基因工程菌能在不添加任何誘導(dǎo)劑的情況下發(fā)酵產(chǎn)高純度的iR，奶-2，3_ 丁二醇。本發(fā)明的另一目的是提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法，該方法簡(jiǎn)單，效率高。本發(fā)明的再一目的是提供上述基因工程菌在制備{R，/ ) _2，3-丁二醇方面的應(yīng)用，該制備方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，對(duì)環(huán)境友好，成本低廉。本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
產(chǎn)汰7 )-2，3-丁二醇的基因工程菌，是將如00基因、如說(shuō)基因和_70^基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌為大腸桿菌{Escherichia coif) MG1655。所述表達(dá)載體為pTrc99a。一種構(gòu)建所述產(chǎn){R，R)~2, 3- 丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步驟
(1)從肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae) CICC 10011中分別擴(kuò)增Zwt/i 基因和基因，從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) 168中擴(kuò)增基因；
(2)利用重疊延伸PCR技術(shù)將budB基因、budA基因和JOrJZ基因拼接得到budB基因、budA基因和基因的融合基因；
(3)將所述融合基因插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處，得到重組質(zhì)粒；
(4)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主內(nèi)即得所述產(chǎn){R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌。步驟(I)中用于擴(kuò)增too 基因的引物為Pl和P2 ;用于擴(kuò)增基因的引物為P5和P6 ;用于擴(kuò)增基因的引物為P9和PlO ；
所述P1、P2、P5、P6、P9和PlO序列分別為
Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，
P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，
P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，
P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，
PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。步驟(2)的具體方法為
(1)將步驟(1)所得如必基因
與pMD 18-simp Ie-T載體相連獲得重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-too ，以P3和P4為引物擴(kuò)增出含有budB基因的拼接序列I ;所述P3和P4的序列如下
P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’，
P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ；
(II)將況/說(shuō)基因與載體pMD18-simp Ie-T相連,獲得重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-/wo^,以P7和P8為引物擴(kuò)增出含有budA基因的拼接序列2 ;所述P7和P8的序列如下
P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，
P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ ；
(III)將ydjL 基因與載體 pMD 18-simp Ie-T 相連,獲得重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-_7t/jZ，以Pll和P12為引物擴(kuò)增出含有基因的拼接序列3 ;所述Pll和P12的序列如下
Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，
P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；
(IV)以拼接序列2和拼接序列3的重疊部分互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物I ;以所述擴(kuò)增產(chǎn)物I為模板，以P7及P12為引物擴(kuò)增獲得ZwW基因與基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下
P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，
P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；以budA基因與_7心1基因的融合基因和拼接序列I的重疊部分互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物2 ;以擴(kuò)增產(chǎn)物2為模板，P13及P14為引物，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得ZwoS基因、ZwW基因和基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下
P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’，
P14 :5’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。一種所述基因工程菌在制備(M，奶-2，3-丁二醇方面的應(yīng)用，將基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖床轉(zhuǎn)速18(T220r/min、35_38°C條件下發(fā)酵3(T48h，收獲含有{R，R)~2, 3-丁二醇的發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖80 200 g/L，蛋白胨5 10 g/L，酵母膏T7 g/L, NaCl5 10 g/L，氨芐青霉素20 50 Pg/mL，溶劑為水。有益效果
本發(fā)明基因工程菌性質(zhì)穩(wěn)定，在不添加誘導(dǎo)劑的情況下，以葡萄糖為底物高產(chǎn)高純度的說(shuō)奶_2，3-丁二醇，突破了以往報(bào)道基因工程菌需要添加誘導(dǎo)劑的限制。搖瓶發(fā)酵結(jié)果該基因工程菌可利用80g/L葡萄糖，產(chǎn)出32. 2g/L的{R, R) -2，3- 丁二醇，對(duì)映體純度高達(dá)99. 5%，相對(duì)于葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為40. 3%，理論最高轉(zhuǎn)化率為50% ;在上述相同條件下，原始菌株幾乎不耗糖，與原始的大腸桿菌菌株相比，在導(dǎo)入有效的^ 7 )-2，3_丁二醇合成途徑后，重組菌不僅實(shí)現(xiàn)了 {R，奶_2，3-丁二醇從無(wú)到有的合成，而且也不需要誘導(dǎo)劑的作用。與目前文獻(xiàn)報(bào)道的大腸桿菌產(chǎn)汰奶-2，3-丁二醇產(chǎn)量相比，產(chǎn)物終濃度也是相對(duì)最聞的。本發(fā)明構(gòu)建基因工程菌的方法，巧妙、簡(jiǎn)單、效率高。本發(fā)明基因工程菌用于發(fā)酵制備{R，奶_2，3-丁二醇，方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，對(duì)環(huán)境友好，成本低廉。發(fā)酵液中僅存在單一構(gòu)型的、R，奶_2，3-丁二醇，因此不需要復(fù)雜的拆分步驟。在發(fā)酵過(guò)程中，不需要添加誘導(dǎo)劑IPTG，成本低。


圖I為budB、budA和_7<3冗這三種基因的拼接模式示意圖。圖2為三種外源基因在宿主細(xì)胞coli MG1655中成功表達(dá)的SDS-PAGE圖譜；M為SDS-PAGE低分子量Marker ；Lane I為添加了誘導(dǎo)劑IPTG的原始菌；Lane 2未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌；Lane 3為IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌。圖3 ■、職Escherichia coli MG1655的發(fā)酵液高效液相色譜圖。圖 4 為基因工程菌coli加 IPTG 誘導(dǎo)情況下的發(fā)酵液高效液相色譜圖，其中I是3-羥基丁酮；2是汰7 )-2，3_ 丁二醇。圖5 為基因工程菌coli"^無(wú) IPTG 誘導(dǎo)情況下的發(fā)酵液高效液相色譜圖，其中I是3-羥基丁酮；2是iR，R)~2, 3- 丁二醇；3是乙醇。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅限于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明中的生物材料來(lái)源如下
Klebisella pneumoniae CICC10011 菌株(縮寫(xiě)為尤 pneumoniae CICC10011 菌株):購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏中心；
枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is) 168 (縮寫(xiě)為B. subtil is 168菌株)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；
pMD 18-simp Ie-T載體商業(yè)載體，購(gòu)于TaKaRa公司(寶生物工程有限公司)；
PUC18 :商業(yè)載體，購(gòu)于TaKaRa公司(寶生物工程有限公司)； pTrc99a載體商業(yè)載體，購(gòu)于上海北諾生物科技有限公司；
Escherichia coli MG1655 :由廣東菌種保藏中心代購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心(編號(hào)ATCC 700926)。本發(fā)明中ZwoS基因?yàn)棣?-乙酰乳酸合成酶編碼基因，budA基因?yàn)棣?-乙酰乳酸脫羧酶編碼基因，_7心1基因?yàn)閊奶_2，3-丁二醇脫氫酶編碼基因。實(shí)施例I :重組質(zhì)粒的構(gòu)建
(I)基因too 的克隆
根據(jù)Genebank公布的肺炎克雷伯氏桿菌Of. pneumoniae)中基因序列設(shè)計(jì)合成引物
Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’
P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’
以K. pneumoniae CICC10011菌株的基因組DNA為模板，應(yīng)用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 too 基因。PCR 反應(yīng)體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，弓丨物 Pl O. 5 μ L，引物P2 O. 5 μ L, K. pneumoniae CICC1001 基因組 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應(yīng)程序98°C變性208，55 621退火30s，72°C延伸lmin48s，循環(huán)30輪；最后10 C保溫。將PCR產(chǎn)物以0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，用TakaraDNA A-Tailing Kit在PCR產(chǎn)物3’端加A，然后與pMD18-simple-T載體相連獲得重組質(zhì)粒pMD 18-simple-T-Zwt/i ,進(jìn)行序列測(cè)定。Zwt/i 基因的序列如SEQ ID NO: I所不。以重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-too0為模板，P3和P4為引物，應(yīng)用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase擴(kuò)增含有too 基因的拼接序列I。P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’ ；
P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ；
PCR 反應(yīng)體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，$*P3 0.5yL，$*P30. 5μ L, pMD18-simple-T-too0質(zhì)粒DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0· 25 μ L。PCR程序?yàn)?8°C變性10s，68°C退火加延伸2min，循環(huán)30輪；最后10°C保溫。反應(yīng)結(jié)束后，0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后經(jīng)PCR純化試劑盒純化。拼接序列I用于之后的重疊延伸PCR反應(yīng)，其組成是在too 基因的前端加了SacI酶切位點(diǎn)和RBS序列，在Zwi浴基因后端加了與拼接序列2前端相重疊的15 20bp。
(2)基因budA的克隆
根據(jù)Genebank公布的肺炎克雷伯氏桿菌Of. pneumoniae)中基因序列設(shè)計(jì)合成引物
P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’。以尤pneumoniae CICC 10011菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用Takara高保真酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴(kuò)增基因。PCR 反應(yīng)體系:ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，引物 P5 O. 5 μ L，引物P6 O. 5 μ L, K. pneumoniae CICC1001 基因組 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應(yīng)程序98°C變性10s，55°C退火15s，72°C延伸48s，循環(huán)30輪；最后10°C保溫。 PCR產(chǎn)物以O(shè). 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，用Takara DNAA-Tailing Kit在PCR產(chǎn)物3’端加A，然后再與pMD18-simple-T載體相連獲得重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-/w<i4,進(jìn)行序列測(cè)定?；虻木唧w序列如SEQ ID N0:2所示。以重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-toi/ A為模板，P7和P8為引物，擴(kuò)增含有to說(shuō)基因的拼接序列2。P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，
P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ 。PCR 反應(yīng)體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，弓I 物 Ρ7 O. 5 μ L，弓I物 P8 O. 5μ L, pMD18-simple-T-too^ 質(zhì)粒 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應(yīng)程序?yàn)?8°C變性10s，55 65°C退火15s，72°C延伸50s，循環(huán)30輪，最后10°C保溫。反應(yīng)結(jié)束后，O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后經(jīng)PCR純化試劑盒純化。拼接序列2用于之后的重疊延伸PCR，其組成是在基因的前端加入SacI酶切位點(diǎn)，在況/說(shuō)基因的后端具有與基因如段序列相重置的部分。(3)基因的獲取
根據(jù)Genebank公布的枯草芽孢桿菌(β· subtil is)中基因序列設(shè)計(jì)合成引物 P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，
PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。以B. subtilis 168菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，應(yīng)用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴(kuò)增基因。PCR 反應(yīng)體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，弓I 物 Ρ9 O. 5 μ L，弓I物 PlO O. 5μ L, B. subtilis 168 基因組 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應(yīng)程序981變性108，571退火158，721延伸11^11，循環(huán)30輪；最后10 C保溫。 PCR產(chǎn)物以O(shè). 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng)PCR純化試劑盒純化后，用Takara DNAA-Tailing Kit在PCR產(chǎn)物3’端加Α，然后再與pMD18-simple-T載體相連獲得重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-_Fi/jZ,進(jìn)行序列測(cè)定。JOrJZ基因序列如SEQ ID N0:3所示。以重組質(zhì)粒pMD18-Simple-T-j</Z為模板，Pll和P12為引物，擴(kuò)增含有WjZ基因的拼接序列3。
Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，
P12 :5， -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3> 。PCR 反應(yīng)體系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，引物 Pll O. 5 μ L，引物 P12 O. 5μ L, pMD18-simple-T-_Fi/jZ 質(zhì)粒 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反應(yīng)程序?yàn)?8°C變性10s，59. 1°C退火15s，72°C延伸IminlOs，循環(huán)30輪，最后10°c保溫。反應(yīng)結(jié)束后，0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后經(jīng)PCR純化試劑盒純化。拼接序列3用于之后的重疊延伸PCR，其組成是..電ydJL基因的前端具有與基因后段序列的相重疊部分，在_7心1基因的后端加入BamHI酶切位點(diǎn)。(4)重疊延伸PCR反應(yīng)拼接to說(shuō)基因和基因
重疊延伸PCR獲得ZwW基因與JOrJZ基因的融合基因，分為兩步反應(yīng)。重疊延伸PCR第一步反應(yīng)中，不加引物，以拼接序列2和拼接序列3的重疊部分互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每管的反應(yīng)體系是ddH20 12 μ L7Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，拼接序列2和拼接序列 3 各 3 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase O. 3 μ L。PCR 反應(yīng)條件98°C 變性10s，55°C 退火 15s，72°C延伸 IminlOs，循環(huán) 8 輪；10°C保溫。重疊延伸PCR的第二步反應(yīng)中，將第一步反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板，P7和P12為引物，擴(kuò)增獲得ZwW基因與_7心1基因的融合基因。每管的反應(yīng)體系是ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yLj|*P7 O. 5yL，引物 Ρ12 0. 5yL,模板 2yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 25 μ L0 PCR 反應(yīng)條件98°C變性 10s，55°C 退火 15s，72°C延伸2min，循環(huán)30輪，10°C保溫。P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，,
P12 :5， -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3，。P7引物前端有SacI酶切位點(diǎn)，P12引物后端有BamHI酶切位點(diǎn)。(5)重疊延伸PCR反應(yīng)拼接budB基因、budA基因和70 基因
重疊延伸PCR獲得budB、budA、ydjL三種基因的融合基因，分為兩步PCR反應(yīng)。重疊延伸PCR反應(yīng)第一步中，不加引物，以Zw說(shuō)基因與基因的融合基因和拼接序列I的重疊部分互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每管的反應(yīng)體系是ddH20 12 μ L, Buffer 5 μ L,dNTP 2 μ L，budA基因與基因的融合基因3 μ L，3 μ L拼接序列1，PrimeSTAR HS DNAPolymerase O. 3 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?8°C 變性 10s，55°C 退火 15s，72°C延伸 2min，循環(huán) 8輪，10°C保溫。重疊延伸PCR的第二步反應(yīng)中，以第一步反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，P13及P14為引物，擴(kuò)增獲得too 基因、budA基因和基因的融合基因。每管的反應(yīng)體系是ddH2014. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yLj|*P13 0. 5yL，引物 Ρ14 0. 5 μ L，第一步反應(yīng)產(chǎn)物2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase O. 25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?8°C變性 10s，57°C 退火15s，72°C延伸4min，循環(huán)29輪，10°C保溫。P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3，P14 :5 ’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3，
這對(duì)引物前端有SacI酶切位點(diǎn)，后端有BamHI酶切位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，O. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后經(jīng)PCR純化試劑盒純化。將PCR回收產(chǎn)物與pUC18載體連接獲得重組載體進(jìn)行序列測(cè)定,發(fā)現(xiàn)序列正確。SacI 和 BamHI 酶切重組載體 ^MCVd-budBbudAydjL，回收和的融合基因(約3. 5Kb片段)；同時(shí)SacI和BamHI酶切pTrc99a載體，回收大片段產(chǎn)物；將雙酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下連接從而獲得重組質(zhì)粒x^d-budBbudAydjL。budB基因、budA基因和基因的拼接模式見(jiàn)圖I。實(shí)施例2 :制備基因工程coli MG1655-pTrc99 -budBbudAydjL 利用電擊穿孔儀將重組質(zhì)粒dBbudAydjL轉(zhuǎn)化大腸桿菌coli
MG1655，電轉(zhuǎn)化參數(shù)為電壓2. 5 kv，200 Ω，脈沖時(shí)間4. 5 msec。電擊轉(zhuǎn)化完畢，將經(jīng)電擊處理過(guò)的coli MG1655涂布于含有50 Pg/mL氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)12 16小時(shí)，然后挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取酶切驗(yàn)證后，確定得到重組大腸桿菌，命名 ％ Escherichia coli WGl&^-plrd^a-budBbudAydjL。實(shí)施例3 基因工程菌coli Μ61655-ρΤιχ99Β-Α ￡/^ ο^/ ^ 的穩(wěn)定性
考察方法 .洛Escherichia coli MG1655-pTrc99a-/wi/i /wiilF￡/jZ 接種至 3mL 不含氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)12h作為種子，轉(zhuǎn)種培養(yǎng)24h (即傳種20代)，轉(zhuǎn)種培養(yǎng)5次(即傳種100代)。將上述菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，從中挑取100個(gè)單菌落分別點(diǎn)在添加和不添加氨芐青霉素的LB平板上，37°C下培養(yǎng)12 16h，比較在添加和不添加氨芐青霉素的LB平板上的菌落數(shù)，即其穩(wěn)定性?？疾旖Y(jié)果傳種100代之后，其質(zhì)粒穩(wěn)定性為99%。實(shí)施例4 :基因工程菌coli誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)考察
(1)出發(fā)菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99 -budBbudAydjL
(2)以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)為目的的基因工程菌培養(yǎng)
培養(yǎng)基葡萄糖50 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3g/L, NaCl 5g/L,氨節(jié)青霉素20 Pg/mL,溶劑為水；
培養(yǎng)條件50mL培養(yǎng)基裝于250mL錐形瓶中，37°C、200rpm培養(yǎng)至0D_在O. 6^0. 8時(shí)加IPTG誘導(dǎo)，IPTG的終濃度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm培養(yǎng)8h，誘導(dǎo)外源蛋白充分表達(dá)。同時(shí)設(shè)立不用IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌的培養(yǎng)作為對(duì)照。該培養(yǎng)過(guò)程中不添加IPTG，其他培養(yǎng)條件與IPTG誘導(dǎo)基因工程菌相同。(3)誘導(dǎo)后基因工程菌的細(xì)胞破碎取步驟(2)獲得的培養(yǎng)液3ml，4000rpm、4°C下離心5min，用pH7. 4的磷酸鈉緩沖液洗滌一次、重懸至3ml ;冰浴下超聲破碎細(xì)胞(2s，3s, 15min, 300W);然后 12000rpm, 4°C 下離心 20min,取上清；取 30ul 上清與 IOul4*SDS_PAGE loading buffer混合于滅菌的I. 5ml離心管，煮沸5min后放于_20°C冰箱備用。
(4)將煮沸后的樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察是否有外源蛋白表達(dá)?？疾旖Y(jié)果在SDS-PAGE圖譜(見(jiàn)圖2)中，可以看出對(duì)應(yīng)IPTG誘導(dǎo)基因工程菌的泳道上，能夠看到表達(dá)的三種外源蛋白的明顯條帶；同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)的目的蛋白量比未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)基因工程菌顯著增加。對(duì)比例I ·.原展·Escherichia coli MG1655誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)考察
(1)出發(fā)菌株-,Escherichiacoli MG 1655
(2)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)為目的的原始菌培養(yǎng)
培養(yǎng)基葡萄糖50 g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，溶劑為水；
培養(yǎng)條件50mL培養(yǎng)基裝于250mL錐形瓶中，37°C、200rpm培養(yǎng)至0D_在O. 6^0. 8時(shí)加IPTG誘導(dǎo)，IPTG的終濃度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm培養(yǎng)8h，保證與基因工程菌的同等培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件。(3)誘導(dǎo)后原始菌的細(xì)胞破碎取誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液3ml，4000rpm、4°C下離心5min,用pH7. 4的磷酸鈉緩沖液洗漆一次、重懸至3ml ;冰浴下超聲破碎細(xì)胞(2s, 3s,15min, 300W);然后12000rpm, 4 °C下離心20min, 轉(zhuǎn)移上清；取30ul上清與IOul4*SDS_PAGE loadingbuffer混合于滅菌的I. 5ml離心管，煮沸5min后放于-20度冰箱備用。(4)將煮沸后的樣品用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察原始菌的蛋白表達(dá)情況。考察結(jié)果原始菌的SDS-PAGE凝膠圖與基因工程菌的SDS-PAGE凝膠圖相比(見(jiàn)圖
2)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)三種外源蛋白的表達(dá)條帶。這種對(duì)比結(jié)果說(shuō)明，基因工程菌中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了原始菌中不存在的三種外源蛋白的成功表達(dá)。實(shí)施例5 :基因工程菌coli發(fā)酵產(chǎn){R，奶-2，3_ 丁二醇
方法一
無(wú) IPTG 誘導(dǎo)的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 發(fā)酵產(chǎn){R，R) ~2, 3- 丁二醇
(1)出發(fā)菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)種子液制備
種子培養(yǎng)基蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L,NaCl 5g/L，氨芐青霉素2(^g/mL，溶劑為水； 培養(yǎng)條件50mL培養(yǎng)基裝于250mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)
12h。(3)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, NaCl 5 g/L,氨節(jié)青霉素20Pg/mL，溶劑為水；
培養(yǎng)條件接種量5% (v/v)，發(fā)酵溫度37°C，全程不添加誘導(dǎo)劑，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵30h。設(shè)計(jì)基因工程菌在IPTG誘導(dǎo)條件下發(fā)酵的對(duì)照，基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600在O. 6 O. 8時(shí)加IPTG誘導(dǎo)，IPTG的終濃度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm誘導(dǎo)培8h，再轉(zhuǎn)回37°C、180rpm進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵總時(shí)間30h。其他培養(yǎng)條件同無(wú)IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌。設(shè)計(jì)原始菌coli MG1655的對(duì)照,種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均不添加氨芐青霉素，其它培養(yǎng)條件與無(wú)IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌相同。發(fā)酵結(jié)果將發(fā)酵液離心后，采用高效液相色譜檢測(cè)?；蚬こ叹跊](méi)有IPTG誘導(dǎo)的條件下，能將80g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化得到32.28/1的汰奶-2，3_ 丁二醇(見(jiàn)圖5)?；蚬こ叹谟蠭PTG誘導(dǎo)的條件下，僅耗糖20g/L，生成iR，R)~2, 3- 丁二醇5. 7g/L(見(jiàn)圖4)。原始菌僅消耗極少量葡萄糖，未檢測(cè)到iR，奶-2，3-丁二醇生成(見(jiàn)圖3)。{R, R)~2, 3- 丁二醇采用高效液相色譜檢測(cè)采用日本島津高效液相色譜儀，RID-10A示差折光檢測(cè)器，Aminex HPX-87H(美國(guó)Bio-Rad公司)色譜柱。柱溫箱溫度65°C，流動(dòng)相為 O. 005 mol/L H2SO4,流速為 0.6 mL/min。
方法二
無(wú) IPTG 誘導(dǎo)的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 發(fā)酵產(chǎn){R，R) ~2, 3- 丁二醇
(1)出發(fā)菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)種子液制備
種子培養(yǎng)基蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L, NaCl 10 g/L，氨芐青霉素50 Pg/mL，溶劑為水；
培養(yǎng)條件50mL培養(yǎng)基裝于250mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度37 °C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)
16h。(3)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L,NaCl 10 g/L，氨芐青霉素50 Pg/mL，溶劑為水；
培養(yǎng)條件接種量10%(v/v)，發(fā)酵溫度37°C，全程不添加誘導(dǎo)劑，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，發(fā)酵48h。設(shè)計(jì)基因工程菌在加IPTG誘導(dǎo)條件下發(fā)酵的對(duì)照，基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600在O. 6 O. 8時(shí)加IPTG誘導(dǎo)，IPTG的終濃度I. O mmol/L,然后30°C、200rpm誘導(dǎo)培8h，再轉(zhuǎn)回37°C、220rpm進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵總時(shí)間48h。其他培養(yǎng)條件同無(wú)IPTG誘導(dǎo)的
基因工程菌。設(shè)計(jì)原始菌coli MG1655的對(duì)照,種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均不添加氨芐青霉素，其它培養(yǎng)條件與無(wú)IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌相同。發(fā)酵結(jié)果基因工程菌在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)的條件下，能將200 g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化得到75. 5g/L的iR，R) -2，3- 丁二醇?；蚬こ叹谟蠭PTG誘導(dǎo)的條件下，僅耗糖38g/L，生成{R, R) _2，3- 丁二醇10. 6g/L。原始菌僅消耗極少量葡萄糖，未檢測(cè)到{R，R) _2，3- 丁二醇生成。方法三
無(wú) IPTG 誘導(dǎo)的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 發(fā)酵產(chǎn){R，R) ~2, 3- 丁二醇(1)出發(fā)菌株'Escherichia coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)種子液制備
種子培養(yǎng)基蛋白胨7. 5 g/L，酵母膏5 g/L, NaCl 7.5 g/L，氨芐青霉素35 Pg/mL，溶劑為水；
培養(yǎng)條件50mL培養(yǎng)基裝于250mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度37 °C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)
14h。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖140 g/L，蛋白胨7. 5 g/L，酵母膏5 g/L, NaCl 7.5 g/L，氨芐青霉素35 Pg/mL，溶劑為水；
培養(yǎng)條件接種量7. 5%(v/v)，發(fā)酵溫度37°C，全程不添加誘導(dǎo)劑，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵39h。設(shè)計(jì)基因工程菌在加IPTG誘導(dǎo)條件下發(fā)酵的對(duì)照，基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600在O. 6 O. 8時(shí)加IPTG誘導(dǎo)，IPTG的終濃度I. O mmol/L,然后30°C、200rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，再轉(zhuǎn)回37°C、200rpm進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵總時(shí)間39h。其他培養(yǎng)條件同無(wú)IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌。設(shè)計(jì)原始菌coli MG1655的對(duì)照,種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均不添加氨芐青霉素，其它培養(yǎng)條件與無(wú)IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌相同。發(fā)酵結(jié)果基因工程菌在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)的條件下，能將140 g/L葡萄糖轉(zhuǎn)化得到55g/L的iR，R)~2, 3- 丁二醇?；蚬こ叹谟蠭PTG誘導(dǎo)的條件下，僅耗糖29g/L，生成{R,奶_2，3-丁二醇8. lg/L。原始菌僅消耗極少量葡萄糖，未檢測(cè)到^ 7 )-2，3-丁二醇生成。通過(guò)上述發(fā)酵過(guò)程可以發(fā)現(xiàn)，雖然IPTG誘導(dǎo)后基因工程菌表達(dá)了大量的目的蛋白，但是發(fā)酵液中目的產(chǎn)物{R，奶_2，3-丁二醇的濃度卻不高；沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)的基因工程菌表達(dá)的目的蛋白量雖然少，但是發(fā)酵液中卻有高濃度的iR，奶-2，3_ 丁二醇。其原因可能是基因工程菌不加IPTG誘導(dǎo)的本底表達(dá)就可滿足細(xì)菌代謝及iR，R)~2, 3-丁二醇的大量合成；而添加IPTG后，蛋白大量表達(dá)可能引起無(wú)活性的包涵體生成，使得2，3-丁二醇途徑活性大量降低，同時(shí)IPTG對(duì)細(xì)胞也有毒害作用。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)(疋/ )-2，3- 丁二醇的基因工程菌，是將budB基因、budA基因和ydjL基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述產(chǎn){R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌 i^scherichia coif) MG1655。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述產(chǎn){R，/ )-2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于所述表達(dá)載體為pTrc99a。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3所述產(chǎn)^奶_2，3-丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步驟 (1)從肺炎克雷伯氏桿菌{Klebsiellapneumoniae) CICC 10011中分別擴(kuò)增Zwt/i 基因和ZwW基因，從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) 168中擴(kuò)增_7心1基因； (2)利用重疊延伸PCR技術(shù)將budB基因、budA基因和基因拼接得到budB基因、budA基因和基因的融合基因； (3)將所述融合基因插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處，得到重組質(zhì)粒； (4)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主內(nèi)即得所述產(chǎn){R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建產(chǎn){R，R)~2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，其特征在于步驟(I)中用于擴(kuò)增budB基因的引物為PI和P2 ;用于擴(kuò)增budA基因的引物為P5和P6 ;用于擴(kuò)增基因的引物為P9和PlO ； 所述P1、P2、P5、P6、P9和PlO序列分別為Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述構(gòu)建產(chǎn)iR，R)~2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，其特征在于步驟(2)的具體方法為 (I)將步驟(I)所得too 基因與pMD 18-simp Ie-T載體相連獲得重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-too ，以P3和P4為引物擴(kuò)增出含有budB基因的拼接序列I ;所述P3和P4的序列如下P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’，P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ； (II)將況/說(shuō)基因與載體pMD18-simp Ie-T相連,獲得重組質(zhì)粒pMD18-simple-T-/w￡/y4,以P7和P8為引物擴(kuò)增出含有budA基因的拼接序列2 ;所述P7和P8的序列如下P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ ；(III)將ydjL 基因與載體 pMD 18-simp Ie-T 相連,獲得重組質(zhì)粒 pMD18-simple-T-_7t/jZ，以Pll和P12為引物擴(kuò)增出含有基因的拼接序列3 ;所述Pll和P12的序列如下Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；(IV)以拼接序列2和拼接序列3的重疊部分互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物I ;以所述擴(kuò)增產(chǎn)物I為模板，以P7及P12為引物擴(kuò)增獲得ZwW基因與_7心1基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ； 認(rèn)budA基因與基因的融合基因和拼接序列I的重疊部分互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物2 ;以擴(kuò)增產(chǎn)物2為模板，P13及P14為引物，進(jìn)行擴(kuò)增，獲得ZwoS基因、ZwW基因和基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’， P14 :5’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。
7.—種權(quán)利要求1-3所述基因工程菌在制備{R，/ ) _2，3-丁二醇方面的應(yīng)用，其特征在于將基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖床轉(zhuǎn)速18(T220r/min、35_38°C條件下發(fā)酵30 48h，收獲含有{R，R) _2，3- 丁二醇的發(fā)酵液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖80 200 g/L，蛋白胨5 10 g/L，酵母膏3 7 g/L, NaCl5 10 g/L，氨芐青霉素20 50呢/mL，溶劑為水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。所述基因工程菌，是將budB基因、budA基因和ydjL基因通過(guò)表達(dá)載體pTrc99a轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)MG1655得到的基因工程菌。本發(fā)明的菌株能夠在不需要添加誘導(dǎo)劑的情況下，高產(chǎn)高純度的(R,R)-2,3-丁二醇，同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，底物消耗迅速，發(fā)酵周期較短，成本低。該工程菌的獲得對(duì)生物制造(R,R)-2,3-丁二醇具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102965324SQ20121050552
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者黃和, 紀(jì)曉俊, 沈夢(mèng)秋, 聶志奎, 夏志芳 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)