專利名稱：儀隴坨坨麥抗條銹病基因相連鎖的特異分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農業(yè)生物技術工程和小麥抗病遺傳育種領域，具體地涉儀隴坨坨麥抗條銹病基因相連鎖的特異分子標記及其應用。
背景技術：
由條型柄鎊菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici,Pst)引起的小麥條銹病是小麥危害程度最重的典型氣傳病害之一，早在小麥作為人類的主要糧食作物之前就已經存在，在全世界除南極洲之外的各大洲60多個國家均有不同程度發(fā)生。中國是世界上最大且相對獨立的小麥條銹病流行區(qū)，小麥條銹病一直是威脅我國西北、西南、黃淮海等地冬麥區(qū)和西北春麥區(qū)最重要的小麥病害之一。近年來由于新毒性小種條中32和條中33的出現和流行更加劇了條銹病成災趨勢，我國小麥條銹病自2000年以來一直處于大流行狀態(tài)。因此，迫切需要發(fā)掘新的抗條銹病基因并高效轉育到現有主栽品種中，增強小麥栽培品種的抗性?？共⌒禄虻陌l(fā)掘及利用是育種工作的基礎，也是解決抗性喪失這一難題的根本途徑。雖然傳統(tǒng)的藥劑防治可以從一定程度上減輕條銹病的危害，但是大量使用農藥不僅增加了生產成本，還會對生態(tài)環(huán)境和人類健康產生很大的威脅。因此，選育抗病品種是防治條銹病經濟、安全、有效的方法。近年來，我國條銹病發(fā)生表現出爆發(fā)頻率高、范圍廣、危害逐年加重、發(fā)病時間早等特點。因此， 從小麥野生近緣種屬、稀有種和地方小麥中發(fā)掘新的抗條銹病基因，并有效利用，選育推廣新的抗條銹病品種，已經成為我國小麥抗條銹病育種中重要任務。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA分子標記技術在分子選擇輔助育種領域中的應用越來越廣泛。分子標記技術能夠在基因水平上對作物種質資源進行評價和鑒定，同時為抗病基因的定位、克隆和聚合提供了依據。正是由于分子標記技術較傳統(tǒng)標記手段具有速度快，標記位點多，共顯性，不易受環(huán)境影響的特點，所以，近年來分子標記技術得到了迅速發(fā)展的。目前，主要利用RAPD、SSR、AFLP, RGAP, RFLP等幾種DNA分子標記技術在50個正式命名的抗條銹病主效基因和暫定名的抗條銹主效基因中已經找到了與48個抗條銹基因連鎖的分子標記。在所有的標記技術中，Litt等于1989年開發(fā)的SSR標記具有簡便、快速、穩(wěn)定性高和等位基因多樣性高等優(yōu)點，在遺傳多樣性、種質資源鑒定、遺傳作圖、基因定位及分子標記育種等研究方面得到了廣泛的應用。目前利用該技術已成功篩選和鑒定多個條銹病抗性基因，例如 Yr2、Yr5、Yr24、Yr26、Yr30、Yr33、Yr34、Yr36、YrZH84、YrSph 等。但基于單一或少數組合的分離群體而得到的條銹病抗性基因連鎖標記，通用性常受品種背景的限制；而且多數標記距目標基因較遠，導致這些標記在育種中的應用不多。來自中國四川的地方小麥品種儀隴坨麥，經多年多點田間條銹病抗性鑒定表明，該種質對我國目前條銹病菌流行生理小種具有良好抗性。遺傳分析表明，儀隴坨麥含有一對能夠抗我國條中31、32和33混合生理小種的顯性基因。因此，篩選該抗性基因連鎖分子標記，有望直接應用于小麥抗病品種的選育，以提高選擇效率和加快小麥抗病育種進程。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本申請的發(fā)明人提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的之一是提供與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記。本發(fā)明的目的之二是提供獲得上述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記的方法。本發(fā)明的目的之三是提供上述與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記的應用。本發(fā)明針對上述研究背景，以儀隴坨麥/臺長29的F2群體為作圖群體，通過抗病性鑒定結果和SSR標記數據間的連鎖分析，獲得了與小麥條銹病抗性基因連鎖的標記Xgpw7342_35一，該標記可應用于小麥條銹病抗病品種的輔助選擇育種。 根據本發(fā)明的與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記Xgpw7342_35(lbp,通過使用SSR引物:正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’擴增而得，所述分子標記的大小為350bp，其定位在小麥7B短臂上，遺傳距離為1.8cM。本發(fā)明還提供了上述分子標記在鑒定小麥抗條銹病方面的應用。根據本發(fā)明的具體實施例方式，以抗病品種儀隴坨麥與感病品種臺長29為親本的雜交組合的高代(F3)單個小麥株系(L1-L4)對象,通過檢測其特異分子標記Xgpw7342_35(lbp的帶型數據，結合田間抗病鑒定表型數據，可以預測該株系對小麥條銹病的抗性。根據本發(fā)明的鑒定小麥抗條銹病的方法包括使用SSR引物:正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’ 進行擴增的步驟。根據本發(fā)明的獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記的方法，所述方法包括以下步驟:(I)以感病小麥品種臺長29為母本，以四川省地方小麥品種儀隴坨麥為父本，構建F2和F2:3遺傳作圖群體，構建的F2群體為抗條銹病基因遺傳作圖群體；(2)用CTAB方法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA ；(3)采用SSR分子標記技術進行小麥條銹病抗性分子標記的篩選，其中，使用 SSR 引物 Xgpw7342_350bP (正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3，;反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’)擴增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，經過連鎖性鑒定，發(fā)現該標記與小麥條銹病抗性基因相連鎖。根據本發(fā)明的獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記的方法，其中，采用SSR分子標記進行篩選與小麥抗條銹病基因相連鎖分子標記的方法是:(I)使用SSR引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體中進行DNA多態(tài)性分析；

(2)對儀隴坨麥與感病親本臺長29雜交獲得的F2單株抗性進行田間鑒定，調查F2單株的抗病性，提取&群體單株DNA，用與步驟(I)同樣的反應體系、引物及程序進行PCR擴增，統(tǒng)計抗、感株系標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MAPMARKER/EXP 3.0b計算標記與抗條銹病基因之間的遺傳距離。根據本發(fā)明的具體實施方式
，本發(fā)明所提供的與小麥條銹病抗性基因連鎖的SSR標記Xgpw7342_35(lbp,是通過以下方法獲得的:
I)以感病小麥品種臺長29為母本，抗病品種儀隴坨麥為父本，構建F2遺傳作圖群體，對獲得的F2單株抗性進行抗性鑒定。2)以CTAB方法提取親本、抗病基因池、感病基因池及F2群體單株DNA。3)根據 GrainGenes (http://www.wheat, pw.usda.gov)上公布的 SSR 引物序列合成引物，PCR后采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，獲得分子標記數據；4)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對儀隴坨麥與感病親本臺長29雜交、自交獲得的F2單株抗性進行田間鑒定，條銹病接種在兩葉一心的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過自然傳播接種，當誘發(fā)行完全發(fā)病時，測定F2單株的抗病性，調查級別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級。其中，測定病級為高抗(HR)、抗(R)或中抗的單株確定為抗病，而測定病級為中感或高感的單株確定為感病。5)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對儀隴坨麥與感病親本臺長29雜交、自交獲得的F2:3株系抗性進行田間鑒定，條銹病接種在分蘗期的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過自然傳播接種，當誘發(fā)行完全發(fā)病時，測定F2:3株系各單株抗病性，調查級別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級。其中，測定病級為高抗(HR)、抗(R)或中抗(MR)的單株確定為抗病，而測定病級為感(S)或高感(HS)的單株確定為感病。6)結合4)和5)結果，確定F2單株抗病性及攜帶抗病基因雜合性。7)用CTAB法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA ;并根據6)結果，分別篩選15個抗病基因純合F2單株和15個感病基因純合F2單株等量DNA混合，構建抗病基因池和感病基因池。

8)采用SSR分子標記方法進行小麥條銹病抗性基因分子標記的篩選，其具體獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記的方法是:(I)SSR引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及其它們的F2單株間DNA多態(tài)性分析:用SSR 標記技術篩選,根據 GrainGenes (http://www.wheat, pw.usda.gov)上公布的SSR引物序列合成引物，在AB1-9700 PCR儀上進行PCR擴增，PCR擴增反應體系:50ng/y I 小麥基因組DNA 1.0 μ 1,10XPCR Buffer (with Mg2+) 2.0 μ 1,2.5mM dNTPl.6μ I,100 μ M 引物 1.0 μ 1,2.5υ/μ I Taq DNA 聚合酶 0.3 μ 1，ddH20 13.1 μ 1，總體系 20 μ I。擴增反應程序:94 V變性5分鐘，94 V變性30秒，60 V退火30秒，72 °C延伸I分鐘，40個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產物檢測:6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點擊緩沖液為1XTBE，恒定功率80瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實驗結果。(2)分子標記的連鎖性鑒定:根據連鎖遺傳定律，按照MapmakerEXP3.0b軟件要求，將抗病親本儀隴坨麥和抗病基因池相同的帶型賦值為“A”，與感病親本臺長29和感病基因池相同的帶型賦值為“B”，同時擴增出抗病親本、抗病基因池和感病親本、感病基因池兩種帶型的賦值為“H”，帶型不清楚或缺失的賦值為結合4)田間抗病性鑒定結果，用Kosambi函數算出遺傳距離。9) 篩選出一個SSR分子標記Xgpw7342_35(lbp (正向弓丨物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’)，擴增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，發(fā)現在350bp處存在一標記，經過連鎖性鑒定，發(fā)現該標記與小麥條銹病抗性基因連鎖。SR分子標記Xgpw7342_35(lbp在抗性基因輔助選擇的應用，其具體的方法是:(I)利用條中31、32和條中33條銹病生理混合小種對抗病品種儀隴坨麥與感病品種川農16為親本的雜交組合的高代(F5)4個小麥株系(Ll-L4)、4個與抗病品種儀隴坨麥不同的四川地方小麥品種(包括:巴中挖麥、開江白麥子、宜賓豬JL麥、合江轉載小麥)、 ο個與抗病品種儀隴挖麥無親緣關系的小麥育成品種(包括:內麥8號、內麥9號、川麥47、科成麥2號、川麥42、川農16、川福5號、綿農3號、綿陽26、川麥22)抗性進行田間鑒定，條銹病接種在兩葉一心的小麥苗，將條銹病菌人工接種至病害鑒定圃的誘發(fā)行上，通過自然傳播接種，當誘發(fā)行完全發(fā)病時，測定抗病性，調查級別分為高抗(HR)、抗(R)、中抗(MR)、感(S)和高感(HS)五級。其中，測定病級為高抗(HR)、抗(R)或中抗的材料確定為抗病，而測定病級為中感或高感的材料確定為感病。(2 )用SDS法提取(I)提及小麥材料DNA ；(3)分子標記 Xgpw7342_35(lbp 在(2) DNA 多態(tài)性分析:SSR分子標記Xgpw7342_35(lbp在AB1-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR擴增反應體系:50ng/y I 小麥基因組 DNA 1.0 μ 1，10XPCR Buffer (with Mg2+) 2.0 μ 1,2.5mMdNTPl.6 μ 1，100 μ M 引物 1.0 μ 1，2.5υ/μ I Taq DNA 聚合酶 0.3 μ 1，ddH20 13.1 μ 1，總體系20 μ I。擴增反應程序:94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，40個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；產物檢測:6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，點擊緩沖液為1XTBE，恒定功率80瓦。凝膠染色采用硝酸銀染色；照相并在白光燈箱上記錄實驗結果。(4)利用分子標記Xgpw7342_35Qbp對抗性基因的鑒定:在抗病親本、抗病基因池、及抗病品種儀隴坨麥與感病品種川農16為親本的雜交組合的高代(F5)4個小麥株系(L1-L4)材料間擴增出了一條350bp大小的多態(tài)性帶紋，而在感病親本、感病基因池、4個與抗病品種儀隴坨麥不同的四川地方小麥品種(包括:巴中坨麥、開江白麥子、宜賓豬兒麥、合江轉載小麥)和10個與抗病品種儀隴挖麥無親緣關系的小麥育成品種(包括:內麥8號、內麥9號、川麥47、科成麥2號、川麥42、川農16、川福5號、綿農3號、綿陽26、川麥22)中均不能擴增出這一 350bp的特異帶型。因此，結合田間表型抗性鑒定結果，從而證實該抗性基因特異分子標記Xgpw7342_35(lbp可以鑒定該抗性基因在小麥材料中的存在。本發(fā)明的積極性效果及應用如下:1、本發(fā)明使用的PCR體系，不需要特殊的PCR儀器和特殊的反應試劑，普通商業(yè)公司生產的產品均能達到要求。2、本發(fā)明獲得的與條銹病抗性基因緊密連鎖的分子標記，是在對我國條銹病高抗的四川地方小麥品種儀隴坨麥及其遺傳作圖群體中獲得的新的標記，該標記與抗性基因遺傳距離近，PCR擴增重復性好，穩(wěn)定性強，可以用于小麥條銹病品種鑒定和小麥抗病后代的分子輔助選擇，進而加快抗病品種的育種進程。

3、為克隆小麥抗條銹病基因、基因序列分析以及轉抗條銹病基因小麥研究奠定了良好的基礎。


圖1顯示SSR標記Xgpw7342_35Qbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及其F2群體中的擴增。(RP為抗病親本儀隴坨麥；SP為感病親本臺長29 ;RB為抗病基因池；SB為感病基因池；R為抗病表型；H為雜合型；S為感病表型；“ + ”為具有特異標記
為無特異標記帶；箭頭表示SSR標記Xgpw7342_35(lbp)。圖2顯示SSR標記Xgpw7342_35(lbp在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池及抗病品種儀隴坨麥與感病品種川農16為親本的雜交組合的高代(F5) 4個小麥株系(Ll-L4)、4個與抗病品種儀隴挖麥不同的四川地方小麥品種(包括:巴中挖麥、開江白麥子、宜賓豬兒麥、合江轉載小麥)、10個與抗病品種儀隴坨麥無親緣關系的小麥育成品種(包括:內麥8號、內麥9號、川麥47、科成麥2號、川麥42、川農16、川福5號、綿農3號、綿陽26、川麥22)的PCR擴增。(RP為抗病親本儀隴坨麥；SP為感病親本臺長29 ;RB為抗病基因池；SB為感病基因池；黑色實心箭頭表示SSR標記Xgpw7342_35Qbp)。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內容所作的任何本領域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1:與四川地方小麥品種儀隴托坨麥條銹病抗性基因連鎖的SSR分子標記Xgpw7342_350bP 的獲得1、供試材料 植物材料:以感病品種臺長29為母本，抗病品種四川地方小麥儀隴坨麥為父本，構建F2遺傳作圖群體。2010年正季將F2群體的152個單株種植于四川農業(yè)大學成都校區(qū)溫江試驗基地病害鑒定圃，用于抗性鑒定。苗期取各單株的部分葉片，用于SSR分析。成熟時，收獲F2:3家系的種子，晾干保存，2011年用于抗性鑒定。條銹病菌混合生理小種:用于F2群體及F2:3家系抗性鑒定的條銹病菌混合生理小種由條中31、32和33三個小種等量混合組成。2、抗性鑒定田間試驗設計:2010年及2011年正季，四川農業(yè)大學成都校區(qū)溫江試驗基地病害鑒定圃分別將感病品種臺長29、抗病品種四川地方小麥儀隴坨麥及其F2群體和F2:3家系單粒播種，行長2.0m,行距20cm，每行播種10粒，每間隔20行設置一行感病對照品種SY95-71，在鑒定圃周圍分別種植I行用于條銹病誘發(fā)感病品種SY95-71和臺長29。抗性鑒定:采用人工接種方式進行田間抗性鑒定。當小麥幼苗長至二葉一心時用涂抹法對條銹病誘發(fā)感病品種SY95-71和感病親本臺長29進行單株人工接種。待感病親本臺長29發(fā)病充分后，記載抗病性。按以下標準進行條銹病抗性鑒定:高抗(HR):無可見侵染；抗(R):僅產生枯死斑點或失綠反應,無夏孢子堆；中抗(MR):夏孢子堆較小，周圍有枯死或失綠反應；感(S):夏孢子堆中等，周圍無枯死或失綠反應；高感(HS):夏孢子堆大，周圍無枯死或失綠反應。
鑒定結果發(fā)現F2群體中表現為感病的有35株，其后代F2:3株系表現均為感??；F2表現為抗病的有117株，其對應的F2:3中全部植株表現為抗性的有39個株系，而表現為抗感分離的株系有78個。F2群體抗感分離比符合3:1，F2:3株系抗感分離比符合1:2:1，說明抗病品種四川地方小麥儀隴坨麥攜帶了一個顯性主效抗條銹病基因。3、基因組DNA提取采用CTAB法提取基因組DNA。取2g新鮮幼嫩葉片，液氮研磨成細粉后加預熱至65 的 2XCTAB 提取液(2% CTAB, 1.4M NaCl,0.1MTris-HCl (pH8.0),0.1M EDTA (ρΗ8.0),臨用前加2% β -巰基·乙醇15ml，混勻。65°C水浴30_45min，其間輕搖混勻。冷卻至室溫后加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，輕輕混勻至上清液呈牛奶狀，4000rpm 離心 lOmin。取上清液，加等體積異丙醇，置于冰浴沉淀DNA。勾出DNA，用70%酒精洗2次，無水乙醇洗一次，氣干DNA，溶于適量pH8.0的TE溶液中。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。紫外分光光度法測定各樣品DNA濃度，將各樣品DNA稀釋至50ng/ μ I備用。4、SSR 分析根據GrainGenes (http://www.wheat, pw.usda.gov)上公布的 SSR 引物序列合成引物(由上海英俊生物技術有限公司合成)，在AB1-9700 PCR儀上進行PCR擴增，具體如下:1) PCR 反應體系(20 μ I)
權利要求
1.小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記，其特征在于，所述分子標記通過使用以下述的 SSR 引物 Xgpw7342_350bp擴增而得，正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5， -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3，。
2.權利要求1所述的與小麥抗體銹病基因相連鎖的分子標記在鑒定小麥品種抗條銹病方面的應用。
3.一種鑒定小麥抗條銹病的方法，其特征在于，所述方法包括使用SSR引物 Xgpw7342_350bp:正向引物:5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ ；反向引物:5’ -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’ 進行擴增的步驟。
4.一種獲得與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)以感病小麥品種臺長29為母本，以四川地方小麥品種儀隴坨麥為父本，構建F2和F213遺傳作圖群體，構建的F2群體為抗條銹病基因遺傳作圖群體； (2)用CTAB方法提取小麥親本幼苗及其F2群體單株DNA； (3)采用SSR分子標記技術進行小麥條銹病抗性分子標記的篩選，其中，使用SSR弓丨物Xgpw7342_350bp擴增抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體，經過連鎖性鑒定，發(fā)現該標記與小麥條銹病抗性基因相連鎖，所述 SSR 引物 Xgpw7342_350bp 包括正向引物:5’ -GCGGTGGCAACAACCTAC-3’ 和反向引物:5， -GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3，。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，采用SSR分子標記進行篩選與小麥抗條銹病基因相連鎖分子標記的方法是: (1)使用SSR引物在抗病親本、感病親本、抗病基因池、感病基因池以及它們的F2遺傳作圖群體中進行DNA多態(tài)性分析； (2)分子標記的連鎖性分析:對儀隴坨麥與感病親本臺長29雜交獲得的F2單株抗性進行田間鑒定，調查F2單株的抗病性，提取F2群體單株DNA，用與前面同樣的反應體系、引物及程序進行PCR擴增，統(tǒng)計抗、感株系標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，計算標記與抗條銹病基因之間的遺傳距離。
全文摘要
本發(fā)明涉及農業(yè)生物技術工程和小麥抗病遺傳育種領域，具體地涉及與小麥抗條銹病基因相連鎖的分子標記、其獲得方法及應用。本發(fā)明的實質是根據連鎖分離規(guī)律，以臺長29/儀隴坨麥的F2群體為作圖群體，通過田間條銹病抗性鑒定結果和SSR標記數據間的連鎖分析，獲得了與小麥條銹病抗性基因連鎖的SSR標記Xgpw7342-350bp(正向引物5’-GCGGTGGCAACAACCTAC-3’；反向引物5’-GTGCATAAAGAGGGCAGAGC-3’)。該標記可用于小麥抗條銹病的輔助選擇育種，可克服常規(guī)育種中小麥條銹病抗性鑒定易受環(huán)境影響、穩(wěn)定性和重復性較差、工作量大、費時費力、育種周期長等缺點，進而簡化選擇方法，提高育種效率，加快小麥抗條銹病品種的育種進程。
文檔編號C12N15/11GK103088016SQ20121047925
公開日2013年5月8日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權日2012年11月23日
發(fā)明者鄭有良, 陳國躍, 陳時盛, 魏育明, 蘭秀錦, 劉亞西, 代壽芬 申請人:四川農業(yè)大學