專利名稱：一種突變頭孢菌素c酰化酶的制作方法
一種突變頭孢菌素C?；讣夹g(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于酶工程和工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐產(chǎn)物抑制型突變頭孢菌素C?；浮⒃撁富虻妮d體、轉(zhuǎn)化體及其在一步酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物生產(chǎn)的頭孢菌素C (C印halosporin C，CPC)酰化酶，可以高效催化頭孢菌素C脫去側(cè)鏈生成7-氨基頭孢燒酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)。頭孢菌素類藥物(Cephalosporins)與青霉素一樣,是一族β-內(nèi)酰胺類廣譜抗生素，通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成并加速細(xì)胞壁的破壞而起到殺菌的作用。利用微生物產(chǎn)生的頭孢菌素C?；复呋a(chǎn)7-氨基頭孢烷酸具有工藝簡單、安全、高效、污染小等優(yōu)點，因此逐漸成為7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)的主要方法。
一步酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸的研究重點在于高產(chǎn)頭孢菌素C酰化酶的菌株的發(fā)現(xiàn)和改造以及對頭孢菌素C?；缸陨斫Y(jié)構(gòu)的改造。其中，在對CPC?；傅母脑煅芯糠矫?，酶活低、底物轉(zhuǎn)化率低和嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制問題是制約CPC?；赣糜诖呋疌PC生產(chǎn) 7-ACA的工業(yè)化的主要因素。
在酶活的改造研究方面，有學(xué)者對源于P. diminuta N176的CPC?；冈?15 位、296位和309位三個位點進(jìn)行了突變，突變體表現(xiàn)出了比GL-7-ACA更高的CPC酶活 (Pollegioni L, Lorenzi S，Rosini E, et al. Protein Science, 2005, 14(12): 3064 3076)。韓國學(xué)者對來自Pseudomonas strain SE83 acy II的CPC酸化酶通過多點突變(Vall22Ala-Glyl40Ser-Phe297Arg- Ile314Thr- Ile415Val -Ser710Cys)提高了酶對底物CPC的活性和特異性，其CPC酶活相對于野生菌提高了 8 10倍左右(W0 2005/014821 Al)。清華大學(xué)通過密碼子設(shè)計和基因合成獲得了高活性CPC酰化酶，并通過對底物入口處相關(guān)氨基酸殘基的突變(Ala675Gly)，使得酶活進(jìn)一步提高了 35% (中國發(fā)明專利，申請?zhí)?01110460235· 5 ;Yu H. Μ.等，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 113，36-41)。清華大學(xué)還通過對組成型宿主菌株E. coli JM105 (賽百盛公司)和誘導(dǎo)型表達(dá)型宿主菌株E. coli JM109 (DE3)(鼎國公司)底物分解相關(guān)基因β _內(nèi)酰胺酶基因ampC和乙?；ッ富騛es的敲除，使得底物轉(zhuǎn)化率顯著提高(Yu H. M.等，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 113, 737 - 741)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種突變頭孢菌素C?；讣捌浠?。
本發(fā)明的目的還在于提供上述突變頭孢菌素C?；傅谋磉_(dá)載體和轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的目的又在于提供上述突變頭孢菌素C?；讣捌浠颉⒑蛔冾^孢菌素 C?；富虻谋磉_(dá)載體和轉(zhuǎn)化體在制備7-ACA中的應(yīng)用。
一種突變頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)酰化酶，其具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，其是通過對SEQ ID N0:1所示基因編碼的頭孢菌素C?；赴被嵝蛄械牡?27位Ala和第228位Met進(jìn)行缺失突變得到的，此突變頭孢菌素C酰化酶命名為CPCAcy_D2。
上述的突變頭孢菌素C?；?，其具有SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列，其是通過對 SEQ ID N0:1所示基因編碼的氨基酸序列中的第212位Ala、第213位Asp、第214位Leu和第215位Ala進(jìn)行缺失突變得到的，此突變頭孢菌素C?；该麨镃PCAcy_D4。
編碼上述突變頭孢菌素C酰化酶的基因。
含上述突變頭孢菌素C酰化酶基因的表達(dá)載體。
上述突變頭孢菌素C酰化酶的基因的表達(dá)載體為誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)載體，誘導(dǎo)型表達(dá)載體為PET或其它系列誘導(dǎo)型表達(dá)載體，如誘導(dǎo)型表達(dá)載體PET28 ;組成型表達(dá)載體，為麥芽糖結(jié)合蛋白MBP融合表達(dá)的pMKC組成型表達(dá)載體或其它高效組成型表達(dá)載體。
上述突變頭孢菌素C?；富虻霓D(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體為誘導(dǎo)型或組成型的重組大腸桿菌。
誘導(dǎo)型表達(dá)載體的宿主菌優(yōu)選為E. coli BL21(DE3) (Promega公司)或 JM109(DE3)(鼎國公司)或其它適宜菌株等作為受體菌。
組成型表達(dá)載體的宿主菌優(yōu)選為E. coli TBl (New England Biolab公司)或Ε· coli JM105(賽百盛公司)或其它適宜菌株等作為受體菌。
上述突變CPC?；富蜣D(zhuǎn)化體的構(gòu)建方法為常規(guī)的氯化鈣法或電穿孔轉(zhuǎn)化法 (Sambrook J等· Molecular Cloning: A Laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)。
上述突變CPC?；?、攜帶有上述突變CPC?；妇幋a基因的表達(dá)載體或轉(zhuǎn)化體在制備7-氨基頭孢烷酸上的應(yīng)用。
本發(fā)明突變CPC?；傅拇置敢菏紫炔捎昧蛩徜@飽和沉淀進(jìn)行初步純化，進(jìn)一步采用樹脂、硅膠或其它載體進(jìn)行固定化，即可用于從CPC制備7-氨基頭孢烷酸。
本發(fā)明的有益效果為(I)本發(fā)明改良的頭孢菌素C?；傅漠a(chǎn)物耐受性顯著提升，在6g/L濃度的7-ACA溶液中，酶活保留率從7. 5%分別提高到17. 5% (CPCAcy-D2)和 40% (CPCAcy-D4) ；(2)本發(fā)明改良頭孢菌素C?；副磉_(dá)活性高，即穩(wěn)定性的提升沒有導(dǎo)致頭孢菌素C?；富钚缘南陆?。采用本發(fā)明提供的改良頭孢菌素C?；福軌蚋咝Т呋孜顲PC生成產(chǎn)物7-ACA，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖I攜帶改良頭孢菌素C?；富虻闹亟M質(zhì)粒pET28_CPCacyM示意圖。
圖2突變頭孢菌素C?；概c原酶的蛋白質(zhì)電泳帶I 為 CPCAcy-D4 (D4);帶 2 為 CPCAcy-D2 (D2);帶 3 為原酶對照 CPCacy (C)； 帶4為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖3改良頭孢菌素C酰化酶與原酶的產(chǎn)物耐受性比較具體實施方式
實施例I
突變頭孢菌素C?；窩PCacy_D2的基因突變
從原CPC?；窼EQ ID NO :1所對應(yīng)的基因序列(中國發(fā)明專利ZL200810102219. 7中所述的SEQ ID NO 4)出發(fā)，使用pUC18_acy (中國發(fā)明專利ZL 200810102219. 7)作為模板，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法構(gòu)建突變頭孢菌素C?；窩PCacyM。按照TaKaRa MutanBEST試劑盒所述步驟，用一對Upl-Downl引物(Upl : GGCGGTGATGCCAGCGACGCA ； Down I TCCAGCCGTTGATGCATTACTGAAA )對質(zhì)粒 pUC18_acy 進(jìn)行反向擴(kuò)增，使其在α亞基C端處缺失掉227-228位Ala-Met這2個氨基酸殘基。
PCR 的反應(yīng)體系為無菌水 37. 7 μ L, 10 X Pyrobest Buffer, 5 μ L ；dNTPs (每種dNTP濃度2. 5mM)，4yL ;上下游引物(濃度20 ymolL—1)，各I μ L ;質(zhì)粒模板，I μ L ; Pyrobest DNA 聚合酶(5 U μ L O, O. 3 μ L ;總體積,50 μ L.
反應(yīng)條件為94°C，5min ； 94°C O. 5min、60°C O. 5n、72 °C 5min，循環(huán) 30 次；最后 72 °C 15min。
首先采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行末端連接，再將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli JM109 (DE3)的感受態(tài)細(xì)胞(鼎國公司)，采用氨芐青霉素(Amp+) LB固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成為50ml/300ml搖瓶，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，卡那霉素， 50mg/L,瓊脂粉，15g/L，pH 7. O)平板挑選陽性克隆，得到含有突變頭孢菌素C?；富蚱瑪嗟闹亟M質(zhì)粒pUC18-CPCacyM_D2。將重組質(zhì)粒提交諾賽基因公司進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果證明所得的突變頭孢菌素C酰化酶在α亞基C端處缺失掉227-228位Ala、Met殘基，編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :2，即突變型CPCAcy-D2。
實施例2
改良后的突變頭孢菌素C?；窩PCacy_D4基因突變及其轉(zhuǎn)化體構(gòu)建
其它條件同實施例1，但所用PCR引物改為Up2-Down2，其中，Up2的基因序列為 GCATTACGTCCAGCCGTTGATGCAT ；Down2 的基因序列為AGGCGTGGAAGCGGAGCGTCTGGAG。PCR 擴(kuò)增、連接后獲得重組質(zhì)粒pUC18-CPCacyM_D4，攜帶第212-215位Ala-Asp-Leu-Ala缺失的突變CPC酰化酶基因。編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:3，即突變型CPCAcy-D4。
實施例3
表達(dá)載體pET28_CPCacyM和pMKC-CPCacy M構(gòu)建和轉(zhuǎn)化體構(gòu)建
(I)質(zhì)粒pET28_CPCacyM_D2的構(gòu)建對實施例I獲得的質(zhì)粒載體pUC18_acyM_D2和 pET28a (Novagen公司)分別采用BamHI/Hindlll雙酶切。酶切反應(yīng)體積50 μ L，質(zhì)粒用量 17 μ L，各酶用量I μ L，緩沖液5 μ L，采用無菌水補(bǔ)足至50 μ L。37°C反應(yīng)過夜，獲得酶切產(chǎn)物CPC酰化酶基因和pET28a的線性質(zhì)粒骨架。PCR產(chǎn)物回收試劑盒(天根生化科技(北京) 有限公司)純化酶切產(chǎn)物后，將CPC?；富蚝蚿ET28a的線性質(zhì)粒骨架以3 1的濃度比例用T4 DNA連接酶在4°C進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)時間為14 h至16h。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化宿主菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板(卡那霉素抗性，Kan+)，挑選陽性克隆，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)12h。收獲細(xì)胞，采用常規(guī)試劑盒提取小量質(zhì)粒進(jìn)行常規(guī)酶切和電泳驗證，獲得重組質(zhì)粒 pET28-CPCacyM_D2。
(2)轉(zhuǎn)化體 E. coli JM109(DE3)/ pET28_CPCacyM_D2 和 E. coli BL21(DE3)/ pET28-CPCacyM_D2的構(gòu)建將質(zhì)粒pET28-CPCacyM_D2分別采用常規(guī)電穿孔轉(zhuǎn)化法(電轉(zhuǎn)儀伯樂公司，電壓1250V)轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌E. coli JM109 (DE3)和E. coli BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞加入800 μ I的SOC液體培養(yǎng)基(配方見《分子克隆指南》)，置于37°C，220rpm搖床培養(yǎng)30min活化。取50 μ I菌液涂布于含有50 μ g/ml卡那抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板，放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)20小時，分別獲得基因重組菌JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM_D2和 BL21(DE3)/ pET28-CPCacy.D2。
(3)質(zhì)粒pET28-CPCaCyM_D4的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化體構(gòu)建對實施例2獲得的質(zhì)粒載體 pUC18_acyM_D4和pET28a (Novagen公司)分別采用如實施例3中(I)、(2)所示方法，獲得重組質(zhì)粒 pET28-CPCacyM4 以及轉(zhuǎn)化體 JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM4 和 BL21 (DE3) / pET28-CPCacy.D4。
攜帶突變頭孢菌素C?；富虻闹亟M質(zhì)粒pET28_CPCacyM如圖I所示；其中，M 表示227-228位的Ala-Met缺失突變或212-215位Ala-Asp-Leu-Ala缺失突變。
(4)質(zhì)粒pMKC_CPCacyM_D2和pMKC_CPCacyM_D4的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化體構(gòu)建質(zhì)粒 pMKC-CPCacy* 和 pMKC-CPCacy* 的構(gòu)建方法同實施例 3(1)，采用 BamHI/Hindlll 雙酶切，獲得突變CPC?；?CPCAcy-D2或CPCAcy_D4)全基因。同時采用相同方法酶切質(zhì)粒載體 pMKC-Acy (Yu HM 等· Journal of Molecular Biocatalysis B: Enzymatic, 2006, 43，118-123)，獲得pMKC的線性質(zhì)粒骨 架。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后，將CPCAcy_D2或 CPCAcy-D4基因和pMKC的線性質(zhì)粒骨架在4°C采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)14h，構(gòu)建組成型表達(dá)重組質(zhì)粒pMKC-CPCacy M_D2及pMKC-CPCacy M_D4。轉(zhuǎn)化方法同實施例3(2)，采用電穿孔轉(zhuǎn)化法將pMKC-CPCacy* 及pMKC-CPCacy M_D4分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM105(天根生化科技(北京)有限公司)，獲得轉(zhuǎn)化體 JM 105/pMKC-CPCaCyM_D2 以及 JM 105/pMKC-CPCaCyM_D4。
實施例4
突變頭孢菌素C?；窩PCacy_D2和CPCacy_D4在轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)
將實施例3獲得的本發(fā)明改良頭孢菌素C酰化酶CPCacy_D2和CPCacy_D4的誘導(dǎo)型表達(dá)菌株 E. coli JM109 (DE3) /ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ2 和 JM109 (DE3) / ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ4 進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，并以未突變CPC?；钢亟M菌Ε. coli JM109(DE3)/pET28-CPCacy為對照。首先在含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成為10ml/50ml搖瓶，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，pH 7.0)分別接種單菌落，37 °C,200 rpm培養(yǎng)12h，制作種瓶。
從種瓶中按照5%接種量轉(zhuǎn)接到含50mg/L卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中(50ml/300ml 搖瓶，培養(yǎng)基為玉米漿50 g/L，酵母膏10 g/L，NH4Cl 2. 5 g/L，甘油5. O g/L，KH2PO4 2. 3 g/L, K2HPO4 16.4 g/L，乳糖 3g/L，pH 7· 5)，28。。、200 rpm 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 24 小時。
以CPC為底物，采用對二甲氨基苯甲醛(PDAB)顯色法測定CPC?；傅拿富?。首先制備粗酶液5ml菌液在4°C、10000 rpm離心10 min，所得沉淀用0. IM PBS緩沖液(pH8.5)洗滌兩次后重懸于20ml緩沖液(菌體OD600約為I. 0)，冰浴超聲破碎10 min (320 W, 7X3X60次)；在4°C，12000 rpm離心5 min獲取上清酶液；20 μ I底物(0. IM PBS緩沖液，pH 8.5，配制20 mg/ml CPC溶液)，20 μ I酶，37 °C反應(yīng)5 min后，加入200 μ I終止液 (20%乙酸與0. 05 mol/L NaOH溶液2:1體積混合)，12000rpm離心3min,取200 μ I上清液加入40 μ I顯色劑(按PDAB與甲醇質(zhì)量體積比為5 :95配成)，反應(yīng)IOmin,測定415nm的吸光度，測定CPC?；傅拿富?。酶活單位定義為每分鐘催化生成I ymol 7-ACA所需的酶量。
酶活測定結(jié)果表明，重組菌E. coli JM109(DE3)/pET28_CPCacy、E. coli JM109 (DE3) /ρΕΤ28-0Ρ0βουΜ2 和 JM109 (DE3) / ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ4 表達(dá)的原酶 CPCacy 和突變酶CPCacy-D2、CPCacy-D4的酶活分別為3219、3380以及3350 U/L。收集菌體，超聲破碎后取上清液進(jìn)行常規(guī)十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測酶的表達(dá)，結(jié)果表明，本發(fā)明入編CPC酰化酶和原酶都獲得了大量的活性蛋白，如圖2所示。
與此類似，對重組菌E. coli BL21 (DE3)/pET28_CPCacy、BL21 (DE3) (DE3)/ pET28-CPCacyM_D2 和 BL21 (DE3) / pET28_CPCacyM_D4 進(jìn)行了搖瓶培養(yǎng)。結(jié)果表明，原酶 CPCacy 和突變酶CPCacy_D2、CPCacy_D4的酶活進(jìn)一步提高約40%。
同樣，對組成型表達(dá)菌JM105/pMKC_CPCacy、JM105/pMKC_CPCacy Μ2 和 JM105/ pMKC-CPCacy^114進(jìn)行平行培養(yǎng)，種瓶和搖瓶培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法同前，只是在搖瓶培養(yǎng)過程中不加入誘導(dǎo)劑乳糖，直接在28°C相同條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24小時。結(jié)果表明，組成型表達(dá)的改良CPC?；负驮傅拿富钆c誘導(dǎo)型表達(dá)相當(dāng)，且改良?；窩PCacy_D2、CPCacy-D4的酶活略高于原酶CPCacy (分別提高5%和3%)。
實施例5
改良頭孢菌素C酰化酶的產(chǎn)物抑制性評估
將實施例4 培養(yǎng)的 50ml 重組菌 E. coli JM109 (DE3) /ρΕΤ28-0Ρ0ΒογΜ2 和 JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM-D4 以及對照菌 JM109 (DE3) /pET28_CPCacy 發(fā)酵液分別離心收獲細(xì)胞，用等體積的O. IM磷酸鹽緩沖液PBS (pH 8. 5)重懸、常規(guī)方法超聲破碎后備用。
各取20 μ I超聲破碎液與等體積20 mM CPC溶液混合，加入6g/L的7-ACA溶液浸泡，37°C放置5分鐘后再測量生成的7-ACA量。結(jié)果表明，在加入6g/L的7-ACA產(chǎn)物抑制條件下，原酶CPCacy的酶活保留率僅為7. 5%，而改良型CPCAcy_D2和CPCAcy_D4的酶活保留率分別提高到17. 5%和40%，如圖3所示。組成型表達(dá)的改良CPCAcy-D2和CPCAcy_D4 具有同樣的結(jié)果。
實施例6
本發(fā)明改良CPC?；复呋疌PC生成7-ACA試驗
對實施例4 獲得的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)化體 JM109 (DE3) / pET28_CPCacyM-D2 和 JM109 (DE3) / pET28-CPCacyM_D4進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。收集50ml菌液，用O. IM PBS緩沖液(pH 8. 5)洗滌后低溫超聲破碎，細(xì)胞破碎后的粗酶液直接用于3% CPC鈉鹽到7-ACA的催化轉(zhuǎn)化，28°C下?lián)u床振蕩反應(yīng)lh。取樣200 μ 1，用PDAB顯色法分析，結(jié)果表明，本發(fā)明CPC?；窩PCAcy_D2和 CPCAcy-D4可以成功地將底物CPC —步轉(zhuǎn)化生成7-ACA，產(chǎn)物濃度分別為2. 80和2. 83g/L。 組成型表達(dá)的改良CPCAcy-D2和CPCAcy_D4具有同樣的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種突變頭孢菌素C?；?，其特征在于，其具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列，其是通過對SEQ ID NO: I所示基因編碼的頭孢菌素C酰化酶氨基酸序列的第227位Ala和第 228位Met進(jìn)行缺失突變得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種突變頭孢菌素C酰化酶，其特征在于，其具有SEQID NO:3所示氨基酸序列，其是通過對SEQ ID NO: I所示基因編碼的氨基酸序列中的第212位 Ala、第213位Asp、第214位Leu和第215位Ala進(jìn)行缺失突變得到的。
3.編碼權(quán)利要求1-2中任一項的突變頭孢菌素C?；傅幕颉?br> 4.含有權(quán)利要求3所述突變頭孢菌素C?；富虻谋磉_(dá)載體。
5.權(quán)利要求3所述突變頭孢菌素C?；富虻霓D(zhuǎn)化體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體為誘導(dǎo)型或組成型的重組大腸桿菌。
7.權(quán)利要求1-6所述任一項在制備7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于酶工程和工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的一種耐產(chǎn)物抑制型突變頭孢菌素C酰化酶、該酶基因的載體、轉(zhuǎn)化體及其在一步酶法生產(chǎn)7-氨基頭孢烷酸中的應(yīng)用。該酶的氨基酸序列為在基因序列SEQ ID NO:1所編碼的頭孢菌素C?；赴被嵝蛄猩线M(jìn)行缺失突變得到酶CPCAcy-D2和CPCAcy-D4，其氨基酸序列分別為SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。本發(fā)明還公開了該酶的基因的載體和轉(zhuǎn)化體以及其應(yīng)用，該酶不僅表達(dá)活性高，產(chǎn)物耐受性也顯著提高，能夠高效催化底物CPC生成產(chǎn)物7-ACA。
文檔編號C12P35/02GK102925423SQ201210466978
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者于慧敏, 張婧, 王穎, 羅暉, 沈忠耀 申請人:清華大學(xué)