專(zhuān)利名稱(chēng)：準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途的制作方法
準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及到準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆中轉(zhuǎn)錄因子EsDREB基因的功能和在植物抗逆上的用途。具體的說(shuō)涉及轉(zhuǎn)EsDREB基因的植物增強(qiáng)了對(duì)干旱脅迫， 高鹽脅迫，冷脅迫，熱脅迫的抗性。
背景技術(shù)：
干旱，鹽等非生物脅迫是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量的主要因素，每年導(dǎo)致作物減產(chǎn)達(dá)50%以上。常規(guī)育種方法改良作物的抗逆性受到周期長(zhǎng)、優(yōu)異種質(zhì)資源缺乏的限制。近年來(lái)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)和基因表達(dá)調(diào)控的研究初步揭示了植物干旱脅迫的作用分子機(jī)理。目前，利用分子手段分離脅迫相關(guān)基因用來(lái)提高植物的抗逆能力，已經(jīng)成為植物抗逆分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)和植物抗逆基因工程重要的研究方向。
DREB 轉(zhuǎn)錄因子(Dehydration Responsive Element Binding protein),即干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白，屬于AP2/EREBP類(lèi)基因家族，特異存在于植物中。DREB與抗逆基因啟動(dòng)子區(qū)域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)順式作用兀件結(jié)合，其核心序 TACCGACAT，啟動(dòng)下游一系列的有DRE順式作用元件的抗逆基因的表達(dá)，廣泛參與干旱、高鹽，熱等脅迫應(yīng)答反應(yīng)，從而能從整體上提高植物的綜合抗逆性。
自1994年Yamaguchi-Shinozaki從擬南芥中首次檢測(cè)到DRE作用的蛋白因子并命名為DREBl以來(lái)，DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆一直是植物分子生物學(xué)的熱點(diǎn)。目前已從擬南芥、水稻、玉米、小麥、黑麥、大豆、西紅菜，棉花，蘆薈等大量植物中分離并鑒定出調(diào)控干早、高鹽及低溫耐性的DREB基因，并利用這些基因得到了抗逆性增強(qiáng)的擬南芥、煙草、 油菜、西紅柿、小麥等轉(zhuǎn)基因植株。但目前關(guān)于DREB的研究主要集中于草本植物領(lǐng)域，對(duì)于木本植物研究較少。由于木本植物生命周期長(zhǎng)，并且其抵御外界不良環(huán)境侵害的因素會(huì)多于草本植物，其分子機(jī)制應(yīng)該也更為復(fù)雜。對(duì)木本植物DREB的研究主要以楊樹(shù)和桉樹(shù)為主。另外，有關(guān)DREB/CBF類(lèi)抗逆境轉(zhuǎn)錄因子DREB的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究大部分來(lái)自模式植物擬南芥及經(jīng)濟(jì)作物水稻，小麥等，而對(duì)自然界天然存在的抗逆能力極強(qiáng)的植物資源卻嘗試較少。實(shí)際上，植物中還存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其從極端抗旱的超旱生木本資源植物中挖掘DREB基因并進(jìn)行抗逆育種尚鮮見(jiàn)報(bào)道。而從本土抗逆植物資源中克隆抗逆相關(guān)基因并改良農(nóng)作物不失為一種新的嘗試。因此，從本土超旱生荒漠植物中尋找新的DREB轉(zhuǎn)錄因子，在基因工程水平上培育抗干旱，耐低溫，耐高鹽等新的作物品種具有重要意義。
準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆(Eremosparton songoricum(Litv. ) Vass.)系豆科無(wú)葉豆屬超旱生無(wú)葉灌木，僅片斷化分布于新疆古爾班通古特沙漠流動(dòng)沙丘上，是典型的流沙先鋒植物。該種是我國(guó)的單屬種植物類(lèi)群，西北荒漠植被中的標(biāo)志性種，稀有種。由于長(zhǎng)期生活在極端惡劣的流動(dòng)沙丘環(huán)境中，沙漠干旱、少雨、大風(fēng)、沙埋等環(huán)境塑造了準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆抗旱的形態(tài)學(xué)及生理學(xué)特性，表現(xiàn)在該種為小半灌木，葉極端退化，以營(yíng)養(yǎng)枝執(zhí)行光合作用，故稱(chēng)“無(wú)葉豆”;具有超強(qiáng)的根吸水能力以及細(xì)胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，長(zhǎng)期的環(huán)境壓力使得該種具有抗旱，抗高溫，抗風(fēng)蝕沙埋等抵抗多種非生物脅迫的能力，其體內(nèi)必定蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因資源。準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆作為天然抗逆性極強(qiáng)的典型荒漠沙生植物，開(kāi)展該種的抗旱相關(guān)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆，對(duì)于深入發(fā)利用抗逆基因資源，定向培育植物新品種均有重要價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途，該基因用于轉(zhuǎn)化植物，提高植物的多種非生物脅迫抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將 EsDREB基因轉(zhuǎn)化到野生型煙草中，并研究其在煙草中的抗逆功能，為EsDREB基因在其它植物中的應(yīng)用提供了很好的基礎(chǔ)。
本發(fā)明所述的一種準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途，該基因用于轉(zhuǎn)化植物，提高植物的多種非生物脅迫抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆 EsDREB基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，具體操作按下列步驟進(jìn)行
a、用Kpn I和Pst I分別酶切pMD19-T-EsDREB質(zhì)粒載體和植物真核表達(dá)空載體 PCAMBIA1301,回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，將EsDREB基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體PCAMBIA1301中，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1301_EsDREB ；
b、將步驟a中的重組質(zhì)粒pCAMBIA1301_EsDREB導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌；
C、將步驟b帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物；
d、目標(biāo)植物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的鑒定；
e、利用轉(zhuǎn)基因目標(biāo)植物的體系驗(yàn)證EsDREB基因的抗逆功能。
所述基因?yàn)闇?zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的核苷酸序列
TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAG CTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAA CAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATG AGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT
EsDREB基因的氨基酸序列
MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGE⑶SGSGTSSSDPSLS。
所述多種非生物脅迫抗性為抗干旱脅迫，抗高鹽脅迫，抗冷脅迫，抗熱脅迫。
步驟d目標(biāo)植物為煙草。
本發(fā)明所述的準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途，該基因?yàn)闇?zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB 基因，EsDREB基因其核苷酸序列
TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAG CTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAA CAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATG AGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT
EsDREB基因氨基酸序列
MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTffGKffVAEI REPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASP AGSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGE⑶SGSGTSSSDPSLS
本發(fā)明是在專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01110377962. 5的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究，以超旱生沙漠植物準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆中的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因EsDREB為研究對(duì)象，利用煙草體系對(duì)該基因功能進(jìn)行了研究，證實(shí)了該轉(zhuǎn)錄因子基因具有抗干旱，抗高鹽，抗低溫和高溫脅迫的能力。特別珍貴的是，對(duì)于干旱和高鹽脅迫，轉(zhuǎn)基因煙草既提高了抗逆性，同時(shí)還保持了與沒(méi)有脅迫的煙草幾乎相等的生物量。這種不以抑制植物生長(zhǎng)為基礎(chǔ)的提高植物多種抗逆性的基因在作物遺傳育種上有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明所述的準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途，該基因適用于煙草、棉花、小麥或水稻等的抗干旱脅迫，抗高鹽脅迫，抗冷脅迫，抗熱脅迫。


圖I為本發(fā)明pCAMBIA1301-EsDREB植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
圖2為本發(fā)明pCAMBIA1301_EsDREB質(zhì)粒PCR電泳圖，其中M為分子量Maker DL2000 ;泳道I是沒(méi)有模板的PCR陰性對(duì)照；泳道2是空載質(zhì)粒pCAMBIA1301的PCR結(jié)果； 泳道3-8是隨機(jī)挑選的pCAMBIA1301-EsDREB陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
圖3為本發(fā)明pCAMBIA1301_EsDREB雙酶切電泳圖，其中M為分子量Maker DL2000 ;泳道1-4是隨機(jī)挑選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的雙酶切結(jié)果；泳道5是空載質(zhì)粒pCAMBIA1301 的雙酶切結(jié)果。
圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草鑒定的PCR電泳圖，其中M為分子量MakerDL2000 ;泳道 I是沒(méi)有模板的PCR陰性對(duì)照；泳道2-17是隨機(jī)挑選的待檢測(cè)轉(zhuǎn)EsDREB基因的煙草植株的DNA為模板的PCR結(jié)果；泳道16是以陽(yáng)性轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCAMBIA1301-EsBREB為模板的PCR結(jié)果。
圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因煙草鑒定的RT-PCR電泳圖，M為分子量MakerDL2000 ;泳道 I是沒(méi)有模板的RT-PCR陰性對(duì)照；泳道2-10是隨機(jī)挑選的待檢測(cè)轉(zhuǎn)EsDREB基因的煙草植株的cDNA為模板的RT-PCR結(jié)果；泳道11是陽(yáng)性轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCAMBIA1301_EsDREB為模板的 PCR結(jié)果。
圖6為本發(fā)明調(diào)控下游基因表達(dá)圖，干旱脅迫條件下(左圖)和鹽脅迫下(右圖)， 各個(gè)檢測(cè)的下游基因在野生型煙草，轉(zhuǎn)基因煙草株系下的脅迫前(Oh)和脅迫后(3h)各個(gè)基因的表達(dá)量結(jié)果。
圖7為本發(fā)明兩周大苗脅迫表型圖，每組圖片從左到右依次為脅迫前，脅迫后， 恢復(fù)正常生長(zhǎng)后；每組圖片從上到下依次為野生型煙草幼苗，轉(zhuǎn)EsDREB基因的煙草株系 I (D6)，轉(zhuǎn)基因株系2 (D4)，其中，A組圖片沒(méi)有脅迫情況下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草脅迫前， 脅迫后和恢復(fù)后的生長(zhǎng)情況組圖片是干旱脅迫下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復(fù)后的生長(zhǎng)情況；C組圖片是鹽脅迫情況下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復(fù)后的生長(zhǎng)情況；D組圖片是冷脅迫情況下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復(fù)后的生長(zhǎng)情況；E組圖片是熱脅迫條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復(fù)后的生長(zhǎng)情況。
圖8為本發(fā)明兩周大苗脅迫后生物量圖，每組圖片的左圖是各種生長(zhǎng)情況下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的形態(tài)指標(biāo)(根長(zhǎng)，根數(shù)量，葉片數(shù))統(tǒng)計(jì)結(jié)果，右圖是相對(duì)應(yīng)的生物量 (鮮重)數(shù)據(jù)，其中，A組圖片是沒(méi)有脅迫情況下的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和生物量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；往下依次為B組的干旱脅迫，C組的鹽脅迫，D組的冷脅迫，E組的熱脅迫的各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)和生物量統(tǒng)計(jì)結(jié)果，I為形態(tài)，2為鮮重。
圖9為本發(fā)明兩周大幼苗脅迫后生理指標(biāo)圖，比較了野生型植株和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在各種脅迫處理后脯氨酸，丙二醛和葉綠素含量的變化(總左至右)，其中A組圖片是沒(méi)有脅迫情況下的以上三種生理指標(biāo)的比較結(jié)果；往下依次為B組的干旱脅迫，C組的鹽脅迫，D組的冷脅迫，E組的熱脅迫的各項(xiàng)生理指標(biāo)結(jié)果，I為脯氨酸含量，2為丙二醛含量，3 為葉綠素含量。
圖10為本發(fā)明兩月大苗脅迫表型圖，從左到右依次為脅迫前，脅迫后和恢復(fù)2周后的野生型和轉(zhuǎn)基因株系間的表型圖；從上至下依次為干旱脅迫，鹽脅迫，冷脅迫，熱脅迫情況下的野生型和轉(zhuǎn)基因株系在脅迫前，脅迫后和復(fù)水后的表型圖，I為野生型植株，2-4 為轉(zhuǎn)基因植株。
圖11為本發(fā)明兩月大苗脅迫后的存活率，其中A為干旱脅迫，B為鹽脅迫，C為冷脅迫，D為熱脅迫的存活率，□代表的是野生型植株的存活率，胃代表的是轉(zhuǎn)基因植株的存活率。
具體實(shí)施方式
在下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M奧斯伯，R.E.金斯頓，J. G塞德曼主編，馬學(xué)軍，舒躍龍譯，北京科學(xué)出版社，2004)和植物基因工程(王關(guān)林，方宏筠主編，北京科學(xué)出版社，2009)中所述的方法進(jìn)行；
實(shí)施例
所述基因?yàn)闇?zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因核苷酸序列
TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTAGGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTTAGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATGATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAGCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATGAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT
EsDREB基因氨基酸序列
MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGEGDSGSGTSSSDPSLS ；
pCAMBIA1301-EsDREB重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建
用Kpn I和Pst I兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶分別酶切pMD19_EsDREB基因的質(zhì)粒和空載體PCAMBIA1301，并回收，連接，篩選測(cè)序，構(gòu)建出pCAMBIA1301-EsDREB載體(載體構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒PCR鑒定(圖2)及質(zhì)粒雙酶切(圖3)確定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-EsDREB ；
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草
農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
挑取LBA4404單菌落接種于5mL YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素100mg/mL，利福平 100mg/mL)中，溫度28°C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜；吸取2mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50mLYEB液體培養(yǎng)基中， 繼續(xù)培養(yǎng)至0D600值為O. 5左右(約4小時(shí))；
將菌液轉(zhuǎn)至無(wú)菌離心管中，冰浴30min，5000rpm離心5min ；
用I. 6mL 20mmol/L無(wú)菌CaCl2重懸菌體,加入400 μ L無(wú)菌甘油，混勻后，按每管 200 μ L分裝于無(wú)菌I. 5mL微量離心管中，液氮中速凍lmin，溫度_80°C保持備用；
凍融法將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301_EsDREB轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌
在滅菌的1.5mL離心管中加入20(^1^新鮮制備的1^八4404感受態(tài)細(xì)胞及IOyL 鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pCAMBIA1301-EsDREB混勻后冰浴30min ；
將離心管移入溫度42°C水浴鍋中，水浴60s (切忌振蕩)；
立即將離心管置于冰中，2-3min后再移入溫度37°C水浴鍋中水浴5min ；
向離心管中加入800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，在溫度37°C恒溫振蕩器上以260r/min 培養(yǎng)lh，4000rpm離心5min，棄上清，取剩余菌體均勻涂布于YEB選擇培養(yǎng)基(含鏈霉素 100mg/mL,卡那霉素50mg/mL,利福平100mg/mL)表面,待菌體完全被吸收后,將平板倒置于溫度28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，待培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落后，進(jìn)行菌落PCR，篩選陽(yáng)性重組子；
在YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C培養(yǎng)48h，然后將菌液制備成甘油菌，溫度_20°C保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
煙草遺傳轉(zhuǎn)化
葉盤(pán)制備及預(yù)處理
將煙草種子(品種為Petite Havana SRl)用濃度75%酒精浸泡30s，I % NaClO浸泡lOmin，無(wú)菌水沖洗5遍，接種于MS培養(yǎng)基上，16h光照，溫度28°C培養(yǎng)30d，即為煙草無(wú)菌苗，取無(wú)菌苗葉片剪出葉圓盤(pán)，預(yù)培養(yǎng)2-3d，材料切口處剛剛開(kāi)始膨大時(shí)即可進(jìn)行浸染；
農(nóng)桿菌的活化和制備
取溫度_80°C冰箱內(nèi)保存的農(nóng)桿菌菌液100 μ L接種到3mL YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C，180rpm過(guò)夜培養(yǎng)，取活化菌液200 μ L加滅菌的50%甘油200 μ L保存于離心管中， 放于溫度_20°C冰箱中備用，取活化菌液或上述備用菌液100 μ L加入IOmL的YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至0D600值為O. 6-0. 8，將菌液分裝到50mL三角瓶中，用于侵染；
侵染和共培養(yǎng)
于超凈工作臺(tái)上，將菌液倒入無(wú)菌小培養(yǎng)皿中，將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)處理的葉盤(pán)放入活化后的菌液中，浸泡10-15min，用滅菌的吸水紙將侵染過(guò)的葉盤(pán)表面菌液吸干后，將葉盤(pán)放于分化培養(yǎng)基上，溫度28 °C,暗培養(yǎng)48h ；
選擇分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)
暗培養(yǎng)結(jié)束后，將葉盤(pán)放于選擇分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)(50mg/L潮霉素)，以后每 10-15d繼代一次，選擇培養(yǎng)2-3周后，葉盤(pán)周?chē)只隹剐匝?，待抗性芽長(zhǎng)至2-3cm，切下插入到選擇生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-3周長(zhǎng)出不定根，得到轉(zhuǎn)EsDREB基因的煙草植株;
轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定
轉(zhuǎn)基因煙草的潮霉素篩選
將收獲的TO代種子經(jīng)消毒后(消毒方法同上)播種于含有50 μ g/ml的潮霉素的 MS培養(yǎng)基上，溫度28°C，16h光照培養(yǎng)14天左右，可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因植株呈深綠色，子葉健康，而野生型植株發(fā)芽緩慢，萌發(fā)率極低( 4% )，植株小，呈黃綠色，有的植株子葉畸形，之后將潮霉素篩選后的陽(yáng)性植株移入營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)至收獲，用收獲的Tl代種子重復(fù)以上步驟，直至獲得T2代種子；
轉(zhuǎn)基因煙草的DNA檢測(cè)
潮霉素篩選的同時(shí)，用分子手段對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草做進(jìn)一步的鑒定，用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片總DNA，以野生型煙草總DNA為陰性對(duì)照，以陽(yáng)性重組質(zhì)粒 DH5 a -pCAMBIA1301-EsDREB 為陽(yáng)性對(duì)照，用 EsDREB 基因全長(zhǎng)引物(DL-f :5’ TTC TTCCTC AAATGCCTTCTGG3’ 和 DL_r :5’ ATGCAAAACTTACATCAAGACAATG 3’ )進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增體系及反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.一種準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途，其特征在于該基因用于轉(zhuǎn)化植物，提高植物的多種非生物脅迫抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，具體操作按下列步驟進(jìn)行 a、用KpnI和PstI分別酶切pMD19-T-EsDREB質(zhì)粒載體和植物真核表達(dá)空載體PCAMBIA1301,回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，將EsDREB基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體PCAMBIA1301中，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-EsDREB ； b、將步驟a中的重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-EsDREB導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌； C、將步驟b帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物； d、目標(biāo)植物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的鑒定； e、利用轉(zhuǎn)基因目標(biāo)植物的體系驗(yàn)證EsDREB基因的抗逆功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述基因?yàn)闇?zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的核苷酸序列TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTAGGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTTAGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATGATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAGCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATGAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT EsDREB基因的氨基酸序列MSATCMHKLVKNHNK⑶ASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSRCNYRGVRQRTffGKffVAEIREPNRGNRLffLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPAGSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGE⑶SGSGTSSSDPSLS。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于多種非生物脅迫抗性為抗干旱脅迫，抗高鹽脅迫，抗冷脅迫，抗熱脅迫。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于步驟c目標(biāo)植物為煙草。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因的用途，該基因用于轉(zhuǎn)化植物對(duì)干旱脅迫，高鹽脅迫，冷脅迫，熱脅迫多種非生物脅迫的抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準(zhǔn)噶爾無(wú)葉豆EsDREB基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將EsDREB基因轉(zhuǎn)化到野生型煙草中，并研究其在煙草中的抗逆功能，為EsDREB基因在其它植物中的應(yīng)用提供了很好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102978238SQ20121046253
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者李小雙, 張道遠(yuǎn), 楊紅蘭, 張?jiān)?申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所