專利名稱：一種用于檢測(cè)輪狀病毒的分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于食源性病毒快速檢測(cè)技術(shù)的一種。
背景技術(shù)：
輪狀病毒是嬰幼兒腹瀉主要病原體。輪狀病毒的經(jīng)典病原檢測(cè)方法包括電鏡技術(shù)和分離培養(yǎng)。電鏡技術(shù)要求每毫升樣本中包含約IO6個(gè)病毒顆粒，而且病毒顆粒易于降解，對(duì)正確診斷產(chǎn)生影響。分離培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)靈敏度較低，需要特殊培養(yǎng)條件，對(duì)輪狀病毒的基礎(chǔ)研究和臨床診斷價(jià)值有限。以抗原檢測(cè)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法特異性和靈敏度較低，而且不能有效地進(jìn)行定量檢測(cè)。PCR技術(shù)具有更高的靈敏度，不需細(xì)胞培養(yǎng)，但是檢測(cè)費(fèi)用高，且操作步驟繁瑣，需要時(shí)間長(zhǎng)。目前開(kāi)發(fā)的輪狀病毒檢測(cè)方法中，提高檢測(cè)方法的靈敏度、特異性，開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)實(shí)用的試劑盒仍是輪狀病毒檢測(cè)技術(shù)的主要方向。發(fā)展快速、高效輪狀病毒檢測(cè)新的檢測(cè)方法對(duì)有效預(yù)防輪狀病毒疫情的暴發(fā)，鑒定輪狀病毒的污染狀況，評(píng)估環(huán)境衛(wèi)生狀況等將發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
以受控分子馬達(dá)技術(shù)為核心，集成核酸探針識(shí)別、熒光探針標(biāo)記與檢測(cè)等技術(shù)，建立了一個(gè)全新概念的快速檢測(cè)技術(shù)體系。利用ATP酶作為載體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的特點(diǎn)。分子馬達(dá)連接上特異的核酸探針，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定食品微生物的快速、特異性、高通量的檢測(cè)。本發(fā)明可將檢測(cè)時(shí)間縮短至I 1.5h，且檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0.005ng/mL，滿足現(xiàn)有的食源性病毒檢測(cè)范圍。


附圖1為分子馬達(dá)生 物傳感器模式圖(其中a、b、c、α、β、δ、Υ、ε均為ATP合酶亞基)，I為ε亞基抗體，2為鏈霉親和素(Strptavidin)，3為N-biotin，4為VP7探針，5為輪狀病毒單鏈RNA。附圖2為chix) VP7對(duì)不同種菌株的檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)表示熒光值，橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的樣本，其中I為水，2輪狀病毒,3為甲肝病毒,4為諾如病毒。附圖3為chro VP7對(duì)15個(gè)添加輪狀病毒食品樣本的檢測(cè)結(jié)果,縱坐標(biāo)表不突光值,橫坐標(biāo)表示檢測(cè)的樣本,I 15為食品檢測(cè)樣本編號(hào)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)輪狀病毒VP7基因設(shè)計(jì)特異性核酸探針5’-AGCACAACATTATAATCACAGTATAGTTTGGGTCGA-3’，其中探針的5’用生物素進(jìn)行標(biāo)記。將該探針通過(guò)生物素抗體連接在分子馬達(dá)上面，利用分子馬達(dá)生物傳感器即可對(duì)待測(cè)樣本的RNA進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品為輪狀病毒RNA時(shí)，檢測(cè)體系的熒光值會(huì)發(fā)生明顯的變化，通過(guò)這一變化即可判斷樣本為陽(yáng)性。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)試劑盒，可以方便、快速對(duì)食源性輪狀病毒進(jìn)行檢測(cè)。
試劑盒組成:
權(quán)利要求
1.本發(fā)明要求保護(hù)的內(nèi)容有:異性核酸探針與FtlF1-ATP合酶連接的方式:在FtlF1-ATP合酶的ε亞基上依次連接ε亞基抗體、生物素、鏈霉親和素、生物素標(biāo)記的輪狀病毒核酸探針。
2.劑盒檢測(cè)體系的反應(yīng)條件:室溫溫育10min。
3.成buffer、啟動(dòng)buffer、PBS的配方。合成buffer:甘油20 氯化鎂5mM,Tricine50mM,憐酸氫二鉀 5mM ;啟動(dòng) buffer:ADP (1.6mM):上述合成 buffer = 1: 3 (v/v)；PBS:137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鉀。
全文摘要
一種用于檢測(cè)食源性輪狀病毒的分子馬達(dá)生物傳感器試劑盒，屬于食源性病毒快速檢測(cè)領(lǐng)域，主要解決傳統(tǒng)檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)、所需儀器設(shè)備昂貴的問(wèn)題。本發(fā)明的核心技術(shù)是利用載色體Chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，F(xiàn)0F1-ATP合酶由于能快速地旋轉(zhuǎn)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)它建立了催化位點(diǎn)與質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)之間的偶聯(lián)。首先在ATP合酶的ε亞基上連接VP7探針，將待測(cè)樣品和陰性對(duì)照分別與生物傳感器結(jié)合后，比較其催化ATP合成10分鐘后的ATP產(chǎn)生量，ATP合成的多寡可以通過(guò)環(huán)境中H+的量進(jìn)行測(cè)量，而H+的多寡通過(guò)H-DHPE所體現(xiàn)的熒光強(qiáng)度大小來(lái)獲得。本試劑盒可對(duì)待測(cè)樣本中的食源性輪狀病毒進(jìn)行快速、靈敏、高通量的檢測(cè)，能有效縮短檢測(cè)周期，提高工作效率。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK103088155SQ20121040607
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者張捷, 楊麗君, 張惠媛, 盧曉宇, 許美玲, 顧德周, 劉巖, 汪琦, 張昕, 王佩榮, 陳廣全, 樂(lè)加昌 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局, 煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局