專利名稱：一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料、抗菌及美容化妝材料等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose,簡稱BC)是一類由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的天然高分子聚合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與植物纖維素相同，都是由D-吡喃葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵鏈接而成，但是BC的宏觀結(jié)構(gòu)與植物纖維素相比有很大的不同，具有特殊的結(jié)構(gòu)和性能。BC具有天然的精細(xì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，純度、聚合度和結(jié)晶度高，抗張強(qiáng)度高，持水能力強(qiáng)，透水透氣性能好，生物相容性好，可生物降解，合成過程具有良好的可調(diào)控性?；谄鋬?yōu)異的性能，細(xì)菌纖維素類生物醫(yī)用材料具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的巨大市場價(jià)值。目前，國內(nèi)外已經(jīng)在美容、人工皮膚、生物補(bǔ)片等領(lǐng)域開發(fā)一些產(chǎn)品。然而BC作為生物材料仍有一定缺點(diǎn)，缺乏生物活性，細(xì)胞粘附性差，因而限制了 BC的進(jìn)一步應(yīng)用范圍。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要化合物，也是一種天然的生物高分子，在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色，主要分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)結(jié)締組織內(nèi)，如皮膚、骨、軟骨、腱及韌帶，共有14種，其中I型膠原最為豐富，且性質(zhì)優(yōu)良，被廣泛用作生物材料。I型膠原分子具有若干的三股超螺旋結(jié)構(gòu)，它通過側(cè)向共價(jià)交聯(lián)、錯(cuò)位階梯式排列聚集成直徑為50 200nm的膠原微纖維。膠原微纖維再進(jìn)一步側(cè)向排列形成膠原纖維。膠原具有良好的耐濕熱穩(wěn)定性，良好的生物相容性，生物可降解性，經(jīng)處理可以消除抗原性，對(duì)組織恢復(fù)有促進(jìn)作用，且無異物反應(yīng)。膠原分子上還提供了許多可供細(xì)胞生長、分化、增殖和代謝的結(jié)合位點(diǎn)，因此可用作組織修復(fù)支架材料、生物可降解縫合線、人造皮膚、人工角膜、傷口敷料、人造腱及血管等。但是膠原降解速率過快，交聯(lián)后的膠原加工性能差，缺乏柔韌性，拉伸強(qiáng)度低的缺點(diǎn)限制了其更廣泛的應(yīng)用?；诖耍瑢⒓?xì)菌纖維素與膠原復(fù)合，既可克服細(xì)菌纖維素生物活性差的確定，又能利用細(xì)菌纖維力學(xué)性能好的優(yōu)點(diǎn)，制備出綜合性能更優(yōu)、應(yīng)用更廣的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。目前，對(duì)于這一方面的研究和專利也比較多，大部分都是采用直接浸潰法或者是溶液共混后冷凍-解凍法制備細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。由于細(xì)菌纖維素和膠原微觀結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，采用直接浸潰法較難保證膠原能夠浸入細(xì)菌纖維素內(nèi)，尤其是短時(shí)間的浸潰處理。溶液共混-冷凍解凍法雖然可以制備細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料，但是這種方法破壞了細(xì)菌纖維素原本的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，二者很難形成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因而會(huì)大大降低材料的機(jī)械性能。此外利用發(fā)酵原位培養(yǎng)的方法雖然可以制得一定的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料，但是其生產(chǎn)周期長，成本高，處理過程復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟(I)制備并純化細(xì)菌纖維素；(2)通過負(fù)壓滲透法或正壓法將膠原充分浸入細(xì)菌纖維素的網(wǎng)絡(luò)中，再利用交聯(lián)劑交聯(lián)細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料中的膠原，制得細(xì)菌纖維素/膠原互穿網(wǎng)絡(luò)復(fù)合材料；(3)將上述復(fù)合材料除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑后，再在殼聚糖或其衍生物類抗菌劑溶液中浸泡，制備得到具有抗菌效果的復(fù)合材料。 優(yōu)選地，所述負(fù)壓滲透法為將膠原配制O. 01% 1% (w/v)的膠原溶液，按濾布-細(xì)菌纖維素-膠原溶液的先后順序放入密閉容器中，密閉容器的底部設(shè)有通孔，從密閉容器的底部抽真空，使膠原溶液進(jìn)入細(xì)菌纖維素中，得到細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料；所述正壓法為將膠原配制O. 01% 1% (w/v)的膠原溶液，將細(xì)菌纖維素和膠原溶液一同加入密閉容器中，加壓，制得細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。優(yōu)選地，所述殼聚糖衍生物類抗菌劑為殼聚糖季銨鹽或殼聚糖季磷鹽。優(yōu)選地，所述細(xì)菌纖維素的制備以椰汁及其果肉提取物為培養(yǎng)基主要成分，并添加酵母提取物、葡萄糖以及微量元素，得到種子培養(yǎng)基，取活化后的木醋桿菌菌種接入種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，取該種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖勻，靜態(tài)培養(yǎng)制得細(xì)菌纖維素。優(yōu)選地，所述細(xì)菌纖維素的純化先去除細(xì)菌纖維素表面的雜質(zhì)，再將細(xì)菌纖維素用l 3wt.%SDS浸泡除去細(xì)菌纖維素里面的殘留的雜蛋白，然后再用O. IM NaOH溶液浸泡2 4次，每24h更換一次NaOH溶液，之后超聲60min，最后用超純水浸泡至PH為7. 0^7. 5。優(yōu)選地，所述去除細(xì)菌纖維素表面的雜質(zhì)的步驟為將制得的細(xì)菌纖維素用清水沖洗除去表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明性。優(yōu)選地,所述負(fù)壓滲透法中，抽真空至7(Tl00kpa,并保持Imin 12h ;所述正壓法中，加壓至I. O I. 5atm并保持Imin 12h。 優(yōu)選地，所述正壓法中，加壓前先將密閉容器里面空氣排出，然后充入氮?dú)饧訅?。?yōu)選地，所述交聯(lián)劑為碳二亞胺或戊二醛，交聯(lián)的溫度4°C，反應(yīng)24h。優(yōu)選地，步驟(3)所述復(fù)合材料的純化將得到的復(fù)合材料依次進(jìn)行蒸餾水沖洗、浸泡、透析處理，除去殘留的未反應(yīng)的交聯(lián)劑，從而得到純凈的復(fù)合材料。采用負(fù)壓法或正壓法制備細(xì)菌纖維素復(fù)合材料，同時(shí)利用交聯(lián)劑交聯(lián)膠原從而形成細(xì)菌纖維素/膠原互穿網(wǎng)絡(luò)復(fù)合材料，所述復(fù)合材料的膠原含量占總重的1% 30% ; —方面既可增強(qiáng)材料的力學(xué)性能，另一方面又可降低膠原的降解速率，增強(qiáng)細(xì)菌纖維素的生物活性。同時(shí)針對(duì)目前各種臨床生物醫(yī)用植入材料植入體內(nèi)后易引發(fā)細(xì)菌感染的問題，本發(fā)明在細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料中引入少量的具有抗菌殺菌作用的殼聚糖衍生物，制備細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料。該材料既具有優(yōu)良的機(jī)械性能，又能夠促進(jìn)缺損組織的再生與修復(fù)，同時(shí)還具有較好的抗菌效果，能夠減少病人在康復(fù)過程中感染細(xì)菌的機(jī)會(huì)，減輕病人的痛苦。利用此法制備的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料可用于腹壁缺損修復(fù)、人工皮膚支架、各種傷口敷料、美容保健康復(fù)等領(lǐng)域。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明采用多步純化法獲得高純度醫(yī)用細(xì)菌纖維素。在常規(guī)去離子水浸泡清洗和堿洗的基礎(chǔ)上，增加SDS等高效表面活性劑超聲溶蝕等處理方法，進(jìn)一步提高細(xì)菌纖維素的純凈度。(2)本發(fā)明利用負(fù)壓或正壓法制備細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料，克服了其他制備方法膠原浸入量不足、效果差或生產(chǎn)周期長、成本高的問題，提供了一種簡單有效的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料制備工藝。(3)本發(fā)明利用EDC/NHS、戊二醛等交聯(lián)劑交聯(lián)膠原制備細(xì)菌纖維素/膠原互穿網(wǎng)絡(luò)復(fù)合材料，克服了膠原降解速率快的缺點(diǎn)，穩(wěn)定了復(fù)合材料的組成，保證了復(fù)合材料穩(wěn)定 的生物活性，此外也一定程度地增強(qiáng)了體系的機(jī)械性能。(4)本發(fā)明通過向材料中添加殼聚糖衍生物類抗菌劑的方法克服了目前生物醫(yī)用植入材料以感染細(xì)菌的不足，制備具有抗菌性能的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，既具有良好的力學(xué)性能，又具有良好的細(xì)胞、組織相容性及生物活性，同時(shí)還具有一定的抗菌作用，可用作多種生物醫(yī)用植入材料。(5)本發(fā)明制備的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料具有優(yōu)良的力學(xué)性能，良好的透水、透氣性，具有良好的生物相容性和生物活性，同時(shí)具有良好的抗菌性。


圖I為負(fù)壓裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為加壓裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為實(shí)施例I制得的細(xì)菌纖維素微觀結(jié)構(gòu)圖，顯示了細(xì)菌纖維素所特有的精細(xì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；圖4為實(shí)施例I制得的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料微觀結(jié)構(gòu)示意圖，顯示了膠原在細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中的結(jié)合情況；圖5為FITC染色膠原后按照實(shí)施例I方法制得的復(fù)合材料的共聚焦顯微鏡熒光圖，圖中可知膠原均勻的分布在細(xì)菌纖維素三維網(wǎng)絡(luò)中。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明的一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料的制備方法做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I步驟一、細(xì)菌纖維素的制備培養(yǎng)基成分酵母粉IOg,蛋白胨6g, MgSO4 2g, CaCl2O. Ig,葡萄糖20g,椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)7d。步驟二、細(xì)菌纖維素的純化
將步驟一制得的細(xì)菌纖維素膜用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明；用3wt. % SDS浸泡2次,每12h更換一次SDS溶液，然后再用lwt. % SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液；用O. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液；超聲波60min后,去離子水浸泡6次,每12h更換超純水一次，用精密PH試紙測定細(xì)菌纖維素表面約為7. 2后保存?zhèn)溆谩２襟E三、細(xì)菌纖維素與膠原復(fù)合圖I所示為一負(fù)壓裝置，包括上部密閉容器和下部密閉容器，上部密閉容器底部的連通管伸入下部密閉容器且密封，下部密閉容器上設(shè)有真空表4和真空開關(guān)5。將膠原溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的膠原溶液，按濾布I-細(xì)菌纖維素2-膠原溶液3的先后順序放入上述負(fù)壓裝置的上部密閉容器中，密封好后用真空泵抽真空至75kpa，保壓lh，得到細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。步驟四、膠原交聯(lián) 將步驟三中得到的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用去離子水沖洗出除表面的膠原溶液后浸入O. 1%的戊二醛溶液中，4°C，反應(yīng)24h。步驟五、復(fù)合材料的純化將步驟四中得到的交聯(lián)好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料放入透析袋中，4°C，緩慢攪拌透析6次，每12h更換一次去離子水，除去殘留的未反應(yīng)的交聯(lián)劑。步驟六、復(fù)合抗菌劑將步驟五中透析好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的殼聚糖溶液中，4°C，24h。步驟七、將通過步驟六得到的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料在鼓風(fēng)干燥箱中30°C干燥后包裝保存。本方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，膠原均勻分布于細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中，膠原含量占為總量的19.2%，濕膜平衡含水量達(dá)85.7%，濕態(tài)拉伸強(qiáng)度為91. 7MPa，斷裂伸長率為29. 1% ο實(shí)施例2步驟一、細(xì)菌纖維素的制備培養(yǎng)基成分酵母粉IOg,蛋白胨6g, MgSO4 2g, CaCl2 O. Ig,葡萄糖20g,椰子提取物1000ml，滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)7d。步驟二、細(xì)菌纖維素的純化將步驟一制得的細(xì)菌纖維素膜用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明；用3wt. % SDS浸泡2次,每12h更換一次SDS溶液，然后再用lwt. % SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液；用O. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液；超聲波60min后,去離子水浸泡6次,每12h更換超純水一次，用精密PH試紙測定細(xì)菌纖維素表面約為7. 2后保存?zhèn)溆谩２襟E三、細(xì)菌纖維素與膠原復(fù)合圖2為一加壓裝置，包括容器及其密封蓋，密封蓋上設(shè)有進(jìn)氣口 I和壓力表4，同時(shí)設(shè)有進(jìn)氣閥2、放氣閥3。將膠原溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的膠原溶液，將200ml膠原溶液和數(shù)塊大小為4cmX4cm的細(xì)菌纖維素一同放入上述加壓裝置的容器中，使膠原完全浸沒纖維素塊，往容器中通入氮?dú)猓?min后密閉容器并繼續(xù)往容器中通入氮?dú)庵寥萜鲀?nèi)壓力為I. 5atm,并保壓2h。步驟四、膠原交聯(lián)將步驟三中得到的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用去離子水沖洗出除表面的膠原溶液后浸入O. I %的EDC/NHS溶液中，4°C，反應(yīng)24h。步驟五、復(fù)合材料的純化將步驟四中得到的交聯(lián)好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料放入透析袋中，4°C，緩慢攪拌透析4次，每12h更換一次去離子水。步驟六、復(fù)合抗菌劑 將步驟五中透析好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，4°C，24h。步驟七、將通過步驟六得到的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料在防腐處理后真空包裝保存。本方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，膠原均勻分布于細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中，膠原含量占為總量的17.7%，且抗菌效果好。實(shí)施例3步驟一、細(xì)菌纖維素的制備培養(yǎng)基成分酵母粉IOg,蛋白胨6g, MgSO4 2g, CaCl2 O. Ig,葡萄糖20g,椰子提取物1000ml，滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)7d。步驟二、細(xì)菌纖維素的純化將步驟一制得的細(xì)菌纖維素膜用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明；用3wt. % SDS浸泡2次,每12h更換一次SDS溶液，然后再用lwt. % SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液；用O. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液；超聲波60min后,去離子水浸泡6次,每12h更換超純水一次，用精密PH試紙測定細(xì)菌纖維素表面約為7. 2后保存?zhèn)溆谩２襟E三、細(xì)菌纖維素與膠原復(fù)合將膠原溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 05%的膠原溶液，按濾布I-細(xì)菌纖維素2-膠原溶液3的先后順序放入圖I所示的負(fù)壓裝置中，密封好后用真空泵抽真空至90kpa，保壓8h。步驟四、膠原交聯(lián)將步驟三中得到的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用去離子水沖洗出除表面的膠原溶液后浸入O. I %的EDC/NHS溶液中，4°C，反應(yīng)24h。步驟五、復(fù)合材料的純化將步驟四中得到的交聯(lián)好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料放入透析袋中，4°C，緩慢攪拌透析3次，每12h更換一次去離子水。
步驟六、復(fù)合抗菌劑將步驟五中透析好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的殼聚糖季銨鹽溶液中，4°C，24h。步驟七、將通過步驟六得到的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料在鼓風(fēng)干燥箱中30°C干燥后包裝保存。本方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，膠原均勻分布于細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中，膠原含量占為總量的8. 9%，濕膜平衡含水量達(dá)78. 6%，濕態(tài)拉伸強(qiáng)度為56. 3MPa，斷裂伸長率為15.9%。實(shí)施例4步驟一、細(xì)菌纖維素的制備 培養(yǎng)基成分酵母粉IOg,蛋白胨6g, MgSO4 2g, CaCl2 O. lg，葡萄糖20g，椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)7d。步驟二、細(xì)菌纖維素的純化將步驟一制得的細(xì)菌纖維素膜用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明；用3wt. %SDS浸泡I次，12h后更換用lwt. %SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液；用O. IM氫氧化鈉溶液浸泡4次，每12h更換一次氫氧化鈉溶液；超聲波60min后，去離子水浸泡4次，每12h更換超純水一次，用精密PH試紙測定細(xì)菌纖維素表面約為7. 2后保存?zhèn)溆谩２襟E三、細(xì)菌纖維素與膠原復(fù)合將膠原溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的膠原溶液，將200ml膠原溶液和數(shù)塊大小為4cmX4cm的細(xì)菌纖維素一同放入如圖2所示的加壓裝置中，使膠原完全浸沒纖維素塊，往容器中通入氮?dú)猓?min后密閉容器并繼續(xù)往容器中通入氮?dú)庵寥萜鲀?nèi)壓力為1.3atm，并保壓6h。步驟四、膠原交聯(lián)將步驟三中得到的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用去離子水沖洗出除表面的膠原溶液后浸入O. 1%的EDC/NHS溶液中，4°C，反應(yīng)24h。步驟五、復(fù)合材料的純化將步驟四中得到的交聯(lián)好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料放入透析袋中，4°C，緩慢攪拌透析3次，每12h更換一次去離子水。步驟六、復(fù)合抗菌劑將步驟五中透析好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的殼聚糖季銨鹽溶液中，4°C，24h。步驟七、將通過步驟六得到的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料在鼓風(fēng)干燥箱中30°C干燥后包裝保存。本方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，膠原均勻分布于細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中，膠原含量占為總量的12. 7%，濕膜平衡含水量達(dá)82. 6%，濕態(tài)拉伸強(qiáng)度為68. 3MPa，斷裂伸長率為22. 7%，且抗菌效果好。
實(shí)施例5步驟一、細(xì)菌纖維素的制備培養(yǎng)基成分酵母粉IOg,蛋白胨6g, MgSO4 2g, CaCl2 O. lg，葡萄糖20g，椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)7d。步驟二、細(xì)菌纖維素的純化將步驟一制得的細(xì)菌纖維素膜用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明；用3wt. %SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液，然后再用lwt. %SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液；用O. IM氫氧化鈉溶液浸泡2次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液；超聲波60min后,去離子水浸泡5次,每12h更換超純水一次，用精密PH試紙測定細(xì)菌纖維素表面約為7. 4后保存?zhèn)溆谩！げ襟E三、細(xì)菌纖維素與膠原復(fù)合將膠原溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25%的膠原溶液，將200ml膠原溶液和數(shù)塊大小為4cmX4cm的細(xì)菌纖維素一同放入如圖2所示的加壓裝置中，使膠原完全浸沒纖維素塊，往容器中通入氮?dú)猓?min后密閉容器并繼續(xù)往容器中通入氮?dú)庵寥萜鲀?nèi)壓力為1.5atm，并保壓2h。步驟四、膠原交聯(lián)將步驟三中得到的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用去離子水沖洗出除表面的膠原溶液后浸入O. 1%的EDC/NHS溶液中，4°C，反應(yīng)24h。步驟五、復(fù)合材料的純化將步驟四中得到的交聯(lián)好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料放入透析袋中，4°C，緩慢攪拌透析3次，每12h更換一次去離子水。步驟六、復(fù)合抗菌劑將步驟五中透析好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的殼聚糖溶液中，4°C，24h。步驟七、將通過步驟六得到的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料冷凍干燥壓模處理后包裝保存。本方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，膠原均勻分布于細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中，膠原含量占為總量的15. 6%，濕膜平衡含水量達(dá)83. 9%，濕態(tài)拉伸強(qiáng)度為74. 9MPa，斷裂伸長率為24. 5%，且具有較好的抗菌效果。實(shí)施例6步驟一、細(xì)菌纖維素的制備培養(yǎng)基成分酵母粉IOg,蛋白胨6g, MgSO4 2g, CaCl2 O. lg，葡萄糖20g，椰汁1000ml,滅菌后加入IOml無水乙醇。培養(yǎng)方法接種木醋桿菌到種子培養(yǎng)液，180rpm震蕩培養(yǎng)18h后，以10%的比例接種發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)7d。步驟二、細(xì)菌纖維素的純化將步驟一制得的細(xì)菌纖維素膜用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明；用3wt. %SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液，然后再用lwt. %SDS浸泡2次，每12h更換一次SDS溶液；用O. IM氫氧化鈉溶液浸泡2次,每12h更換一次氫氧化鈉溶液；超聲波60min后,去離子水浸泡4次,每12h更換超純水一次，用精密PH試紙測定細(xì)菌纖維素表面約為7. 3后保存?zhèn)溆?。步驟三、細(xì)菌纖維素與膠原復(fù)合將膠原溶解配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 25%的膠原溶液，按濾布I-細(xì)菌纖維素2-膠原溶液3的先后順序放入如圖I 所示的負(fù)壓裝置中，密封好后用真空泵抽真空至85kpa，保壓8h，得到細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料；步驟四、膠原交聯(lián)將步驟三中得到的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料用去離子水沖洗出除表面的膠原溶液后浸入O. 1%的EDC/NHS溶液中，4°C，反應(yīng)24h。步驟五、復(fù)合材料的純化將步驟四中得到的交聯(lián)好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料放入透析袋中，4°C，緩慢攪拌透析4次，每12h更換一次去離子水。步驟六、復(fù)合抗菌劑將步驟五中透析好的細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的殼聚糖季銨鹽溶液中，4°C，24h。步驟七、將通過步驟六得到的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料去離子水沖洗至中性并防腐處理后包裝低溫保存。本方法制得的細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料，膠原均勻分布于細(xì)菌纖維素網(wǎng)絡(luò)中，膠原含量占為總量的23. 6%，且抗菌效果好。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)制備并純化細(xì)菌纖維素； (2)通過負(fù)壓滲透法或正壓法將膠原充分浸入細(xì)菌纖維素的網(wǎng)絡(luò)中，再利用交聯(lián)劑交聯(lián)細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料中的膠原，制得細(xì)菌纖維素/膠原互穿網(wǎng)絡(luò)復(fù)合材料； (3)將上述復(fù)合材料除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑后，再在殼聚糖或其衍生物類抗菌劑溶液中浸泡，制備得到具有抗菌效果的復(fù)合材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，所述負(fù)壓滲透法為將膠原配制O.01% l%w/v的膠原溶液，按濾布-細(xì)菌纖維素-膠原溶液的先后順序放入密閉容器中，密閉容器的底部設(shè)有通孔，從密閉容器的底部抽真空，使膠原溶液進(jìn)入細(xì)菌纖維素中，得到細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料； 所述正壓法為將膠原配制O. 01% l%w/v的膠原溶液，將細(xì)菌纖維素和膠原溶液一同加入密閉容器中，加壓，制得細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖衍生物類抗菌劑為殼聚糖季銨鹽或殼聚糖季磷鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)菌纖維素的制備 以椰汁及其果肉提取物為培養(yǎng)基主要成分，并添加酵母提取物、葡萄糖以及微量元素，得到種子培養(yǎng)基，取活化后的木醋桿菌菌種接入種子培養(yǎng)基中，進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，取該種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)液中，搖勻，靜態(tài)培養(yǎng)制得細(xì)菌纖維素。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)菌纖維素的純化先去除細(xì)菌纖維素表面的雜質(zhì)，再將細(xì)菌纖維素用f 3wt. %SDS浸泡除去細(xì)菌纖維素里面的殘留的雜蛋白，然后再用O. IMNaOH溶液浸泡2 4次，每12 24h更換一次NaOH溶液，之后超聲60min，最后用超純水浸泡至PH為7. (Γ7. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述去除細(xì)菌纖維素表面的雜質(zhì)的步驟為將制得的細(xì)菌纖維素用清水沖洗除去表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；用大量自來水沖洗除去細(xì)菌纖維素表面的培養(yǎng)基及雜質(zhì)；然后用去離子水浸泡至無色透明性。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述負(fù)壓滲透法中，抽真空至70 IOOkpa,并保持Imin 12h ;所述正壓法中，加壓至I. O I. 5atm并保持Imin 12h。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或7所述的制備方法，其特征在于，所述正壓法中，加壓前先將密閉容器里面空氣排出，然后充入氮?dú)饧訅骸?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為碳二亞胺或戊二醛，交聯(lián)的溫度4°C，反應(yīng)24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求I、任意一項(xiàng)方法制備的復(fù)合材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)菌纖維素/膠原-殼聚糖復(fù)合材料及其制備方法，包括如下步驟(1)制備并純化細(xì)菌纖維素；(2)通過負(fù)壓滲透法或正壓法將膠原充分浸入細(xì)菌纖維素的網(wǎng)絡(luò)中，再利用交聯(lián)劑交聯(lián)細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料中的膠原，制得細(xì)菌纖維素/膠原互穿網(wǎng)絡(luò)復(fù)合材料；(3)將上述復(fù)合材料除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑后，再在殼聚糖或其衍生物類抗菌劑溶液中浸泡，制備得到具有抗菌效果的復(fù)合材料。本發(fā)明利用負(fù)壓或正壓法制備細(xì)菌纖維素/膠原復(fù)合材料，克服了其他制備方法膠原浸入量不足、效果差或生產(chǎn)周期長、成本高的問題，制得的復(fù)合材料具有優(yōu)良的力學(xué)性能，良好的透水、透氣性，具有良好的生物相容性和生物活性，同時(shí)具有良好的抗菌性。
文檔編號(hào)C12P19/04GK102888027SQ20121036409
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者任力, 王迎軍, 朱勇軍, 李立風(fēng) 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)