專(zhuān)利名稱(chēng)：提高骨髓單個(gè)核細(xì)胞心肌細(xì)胞保護(hù)及遷移能力的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高骨髓單個(gè)核細(xì)胞心肌細(xì)胞保護(hù)能力及遷移能力的預(yù)處理方法，可提高其移植治療急性心肌梗死的療效。背景技術(shù)：
目前充血性心力衰竭發(fā)病率逐年升高，全球有1500萬(wàn)受累者，在美國(guó)有500萬(wàn)患者，每年新發(fā)病例為46. 5萬(wàn)，是65歲上人群的首位住院原因，也是心血管死亡的最主要原因。細(xì)胞移植療法可促進(jìn)梗死局部血管新生和心肌再生而改善心肌梗死后心功能，已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。骨髓單個(gè)核干細(xì)胞(BMMNCs)是具多分化方向能力的成體干細(xì)胞，進(jìn)行自體移植無(wú)排異及來(lái)源的限制，也不涉及倫理問(wèn)題，是細(xì)胞移植治療的理想細(xì)胞來(lái)源。大量的基礎(chǔ)研究和初步的臨床試驗(yàn)已顯示了骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療缺血性心肌病的安全性和可行性。然而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植治療心力衰竭仍存在一些問(wèn)題， 主要是移植療效不夠理想。因此，提高移植療效是目前干細(xì)胞移植領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
作為臨床應(yīng)用，經(jīng)靜脈或冠脈注射移植細(xì)胞，細(xì)胞遷移至局部受損組織是干細(xì)胞修復(fù)損傷組織的第一步也是最關(guān)鍵的一步。動(dòng)物研究表明經(jīng)靜脈注射干細(xì)胞盡管能遷移到局部損傷區(qū)域，但遷移至局部損傷的細(xì)胞數(shù)量是不充分的，它嚴(yán)重制約著干細(xì)胞修復(fù)梗死心肌的能力，也是導(dǎo)致移植療效不夠理想的主要原因之一。因此提高骨髓干細(xì)胞的遷移能力及心肌細(xì)胞保護(hù)能力是確保移植療效的關(guān)鍵，將有助于提高干細(xì)胞移植療法在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種提高骨髓單個(gè)核細(xì)胞心肌細(xì)胞保護(hù)能力及遷移能力的預(yù)處理方法，從而提高其移植治療急性心肌梗死的療效。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種提高骨髓單個(gè)核細(xì)胞遷移能力及心肌細(xì)胞保護(hù)能力的預(yù)處理方法，所述方法為將新鮮分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞先以Valsartan溶液培養(yǎng)30分鐘，再以Angiotensin II溶液培養(yǎng)2小時(shí)，得到處理后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞用于移植治療急性心肌梗死；所述 Valsartan溶液中Valsartan終濃度為O. 5^2 μ mol/L,溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基；所述 Angiotensin II溶液中Angiotensin II終濃度為50 150nmol/L,溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
AngiotensinII為非特異性血管緊張素受體激動(dòng)劑，可同時(shí)激活血管緊張素I型受體(ATlR)和血管緊張素2型受體(AT2R)，是美國(guó)Sigma Aldrich公司生產(chǎn)的化學(xué)試劑(分子式=C50H71N13O12 ;分子量 1046. 18 ;產(chǎn)品號(hào)A9525)。
Valsartan是特異性血管緊張素I型受體(ATlR)激動(dòng)劑，由北京諾華制藥公司提供(分子式=C24H29N5O3 ;分子量435. 5)。終濃度為I μ mol/L，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
所述培養(yǎng)均在常規(guī)條件下進(jìn)行，具體于37°C下，在CO2體積濃度5%、空氣體積濃度 95%的混合氣體中進(jìn)行。
優(yōu)選的，所述Valsartan溶液中Valsartan終濃度為I μ mol/L。
優(yōu)選的,所述Angiotensin II 溶液中 Angiotensin II 終濃度為 100nmol/L。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過(guò)預(yù)處理間接激活骨髓單個(gè)核細(xì)胞血管緊張素 2型受體AT2R激活的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分泌一氧化氮增加，遷移能力及心肌細(xì)胞保護(hù)能力增強(qiáng)，一定程度上可提高其移植治療急性心肌梗死的療效。

圖I為利用transwell技術(shù)比較未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞(A)、CGP42112A預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞(C)、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞(B)的體外遷移能力，標(biāo)尺為100 μ m ；
圖2為利用共培養(yǎng)技術(shù)比較未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞(B)、CGP42112A預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞(D)、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞(C)的體外心肌細(xì)胞保護(hù)能力，標(biāo)尺為100 μ m ;箭頭所指為凋亡心肌細(xì)胞；圖A為缺氧缺血清直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，作為陽(yáng)性對(duì)照；
圖3為利用定量PCR技術(shù)比較未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞、CGP42112A預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞、AngiotensinII與V alsartan聯(lián)合預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植入大鼠心梗模型后的遷移情況；* P<0. 05 vs未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植組；
圖4為利用經(jīng)胸心臟超聲技術(shù)比較低糖DMEM培養(yǎng)基、未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞、 CGP42112A預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈途徑移植入大鼠心梗模型后心功能改善情況；其中圖A為各組大鼠心臟M型超聲圖(其中a為假手術(shù)組(正常大鼠組)，b為低糖DMEM培養(yǎng)基組，c為未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞組，d為CGP42112A預(yù)處理組，e為AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預(yù)處理組)，圖B為各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)比較柱狀圖，圖C為各組大鼠心臟短軸縮短率比較柱狀圖；* p<0. 05 vs未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植組；
圖5為利用經(jīng)胸心臟超聲技術(shù)比較低糖DMEM培養(yǎng)基、未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞、 CGP42112A預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞、AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預(yù)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)心肌途徑移植入大鼠心梗模型后心功能改善情況；其中圖A為各組大鼠心臟M型超聲圖(其中a為假手術(shù)組(正常大鼠組)，b為低糖DMEM培養(yǎng)基組，c為未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞組，d為CGP42112A預(yù)處理組，e為AngiotensinII與Valsartan聯(lián)合預(yù)處理組)，圖B為各組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)比較柱狀圖，圖C為各組大鼠心臟短軸縮短率比較柱狀圖；* p〈0. 05 vs未處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞組；
圖4、圖5的B、C中，MI即心梗模型，BMMNCs即骨髓單個(gè)核干細(xì)胞AngII即 AngiotensinII, Val 即 Valsartan, CGP 即 CGP42112A，“ + ” 表示添加，“一”表示未添加。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例I :
I.骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離無(wú)菌條件下取心梗7天后Sprague Dawley (SD)大鼠的CN 102943063 A書(shū)明說(shuō)3/4頁(yè)股骨及脛骨，用注射器沖洗骨髓腔收集骨髓液。將骨髓液置于Ficoll (天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)溶液上，1800rpm離心20分鐘后取中間云霧狀細(xì)胞層，再以IOOOrpm 離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀以低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)重懸。
2.骨髓單個(gè)核細(xì)胞血管緊張素2型受體(AT2R)激活
(I)直接AT2R激活骨髓單個(gè)核細(xì)胞以含10nmol/L CGP42112A (美國(guó)Sigma Aldrich公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基于37°C，含5% CO2飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，V /V)的細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma 3111,美國(guó)Thermo Fisher公司)內(nèi)處理2小時(shí)；
(2)間接AT2R激活骨髓單個(gè)核細(xì)胞先以含I μ mol/L Valsartan (由北京諾華制藥公司提供)的低糖DMEM培養(yǎng)基于37°C，含5% CO2飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，V /V)的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)處理半小時(shí)，再以100nmol/L的AngiotensinII (美國(guó)Sigma Aldrich公司) 于37°C，含5% CO2飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，v /v)的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)處理2小時(shí)。
3.利用Transwell評(píng)價(jià)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體外遷移能力
分別獲得未預(yù)處理的骨髓單個(gè)核細(xì)胞及AT2R激活處理后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，各采用200ul含1% (v/v)FBS (杭 州四季青生物工程材料有限公司)的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸， 制備成5 X IO5Cel 1/200 μ I的細(xì)胞懸液，接種于Transwell小室(美國(guó)Costar公司，孔徑為 8 μ m)中，小室外添加500 μ I含20%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，含5% CO2和飽和濕度(CO2 5%，空氣95%，V /v)的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)。隨后，取出Transwell小室，用棉簽擦去小室膜上層細(xì)胞，PBS輕柔洗滌2次后，置于4% (w/w)多聚甲醛(美國(guó)Sigma公司) 內(nèi)，37°C 固定 30 分鐘，PBS 洗滌 2 3 次后，采用 I μ g/ml Hoechst 33258 (美國(guó) Invitrogen 公司)室溫避光染色15分鐘，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)拍照記錄，結(jié)果見(jiàn)圖I。
由圖I可見(jiàn)AT2R激活處理后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(CGP42112A預(yù)處理或 Angiotensin II與Valsartan聯(lián)合與處理)遷移至下層小室的能力增強(qiáng)。
4.利用共培養(yǎng)體系評(píng)價(jià)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體外心肌細(xì)胞保護(hù)能力
分別獲得未預(yù)處理的骨髓單個(gè)核細(xì)胞及AT2R激活處理后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，各采用200ul低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成2 X IO5CelΙ/mL的細(xì)胞懸液，接種于Transwell體系上層小室(美國(guó)Costar公司，孔徑為3 μ m)中，下層小室接種2 X IO5Cell的乳大鼠心肌細(xì)胞，置于37°C，含O. 5% O2 (O2 O. 5%，氮?dú)?9. 5%，v /v)的缺氧培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。隨后，取出Transwell小室，下層小室以PBS輕柔洗滌2次后，置于4%多聚甲醛(美國(guó)Sigma公司)內(nèi)，室溫固定10分鐘，PBS洗漆2 3次后，米用DeadEnd Fluorometric TUNEL System kit (美國(guó)Promega公司)進(jìn)行TUNEL染色,突光顯微鏡(日本Olympus公司)拍照記錄,結(jié)果見(jiàn)圖2。
由圖2可見(jiàn)與AT2R激活處理過(guò)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞抵抗缺氧缺血清的能力增強(qiáng)。
5.采用大鼠急性心梗模型的體內(nèi)移植來(lái)評(píng)價(jià)骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體內(nèi)遷移能力
雌性Sprague Dawley (SD)大鼠(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)經(jīng)水合氯醒麻醉后，氣管插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)支持，開(kāi)胸，用6 — O絲線(xiàn)在左心耳下方結(jié)扎左前降支冠脈，根據(jù)心電圖變化和局部組織顏色變化確定心梗模型制成，關(guān)胸。分別獲得未預(yù)處理的雄性SD 大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞及AT2R激活處理后的雄性SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，各采用Iml低糖 DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成IXlO7ceIVmL的細(xì)胞懸液，通過(guò)尾靜脈注射入雌性SD大鼠心梗5模型中，24小時(shí)后，引頸處死大鼠,取出心臟左室,稱(chēng)重,液氮研磨，采用Universal Genomic DNA Extration Kit Ver. 3. O (日本TAKARA公司)提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq kit (日本TAKARA公司)定量PCR檢測(cè)SRY基因(特異性表達(dá)與Y 染色體，代表雄性移植細(xì)胞)表達(dá)水平。引物序列Forward Sry CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA ； Reverse Sry: ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC。計(jì)算公式所取材中的細(xì)胞總數(shù)=(實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)所得SRY的平均數(shù)X被檢DNA的稀釋倍數(shù))X [原取材質(zhì)量(mg)/用來(lái)提取DNA的標(biāo)本質(zhì)量(mg)]，結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可見(jiàn)AT2R激活的骨髓單個(gè)核細(xì)胞遷移至缺血心肌病變部位的能力增強(qiáng)。
6.采用大鼠急性心梗模型的體內(nèi)移植來(lái)評(píng)價(jià)骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療急性心肌梗死療效
雄性Sprague Dawley (SD)大鼠(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)經(jīng)水合氯醒麻醉后，氣管插管，小動(dòng)物呼吸機(jī)支持，開(kāi)胸，用6 - O絲線(xiàn)在左心耳下方結(jié)扎左前降支冠脈，根據(jù)心電圖變化和局部組織顏色變化確定心梗模型制成，關(guān)胸。
(I)分別獲得未預(yù)處理的雄性SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞及AT2R激活處理后的雄性 SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，各采用Iml低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成I X 107cell/mL的細(xì)胞懸液，通過(guò)尾靜脈注射入雄性SD大鼠心梗模型中，28天后行經(jīng)胸心臟超聲檢查評(píng)價(jià)心功能改善狀況；
(2)分別獲得未預(yù)處理的雄性SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞及AT2R激活處理后的雄性 SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，各采用150 μ I低糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制備成3 X IO6ceIlAiL的細(xì)胞懸液，經(jīng)心肌途徑注射入雄性SD大鼠心梗模型中，28天后行經(jīng)胸心臟超聲檢查評(píng)價(jià)心功能改善狀況，結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。
由圖4、圖5可見(jiàn)AT2R激活的骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)尾靜脈途徑或經(jīng)心肌途徑移植， 均能改善心梗后心功能狀況。
結(jié)論血管緊張素2型受體(AT2R)激活(CGP42112A預(yù)處理或AngiotensinII和 Valsartan聯(lián)合預(yù)處理)處理骨髓單個(gè)核細(xì)胞能提高其體內(nèi)體外的運(yùn)動(dòng)遷移能力及心肌保護(hù)能力，從而進(jìn)一步提高其移植治療急性心肌梗死的效果。
權(quán)利要求
1.一種提高骨髓單個(gè)核細(xì)胞的心肌細(xì)胞保護(hù)能力及遷移能力的預(yù)處理方法，所述方法為將新鮮分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞先以Valsartan溶液培養(yǎng)30分鐘，再以Angiotensin II 溶液培養(yǎng)2小時(shí)，得到處理后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞；所述Valsartan溶液中Valsartan終濃度為O. 5 2 μ mol/L,溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基；所述Angiotensin II溶液中Angiotensin II 終濃度為5(Tl50nmol/L，溶劑為低糖DMEM培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)均在37°C下，在CO2體積濃度5%、 空氣體積濃度95%的混合氣體中進(jìn)行。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述Valsartan溶液中Valsartan終濃度為 I μ mol/L0
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述AngiotensinII溶液中Angiotensin II終濃度為IOOnmoI/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高骨髓單個(gè)核細(xì)胞遷移能力及心肌細(xì)胞保護(hù)能力的預(yù)處理方法，所述方法為將新鮮分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞先以Valsartan溶液培養(yǎng)30分鐘，再以Angiotensin II溶液培養(yǎng)2小時(shí)，得到處理后的骨髓單個(gè)核細(xì)胞用于移植治療急性心肌梗死；本發(fā)明通過(guò)預(yù)處理間接激活骨髓單個(gè)核細(xì)胞血管緊張素2型受體， AT2R激活的骨髓單個(gè)核細(xì)胞分泌一氧化氮增加，遷移能力及心肌細(xì)胞保護(hù)能力增強(qiáng)，一定程度上可提高其移植治療急性心肌梗死的療效。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102943063SQ20121036390
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者王建安, 胡新央, 徐銀川 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)