一種檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒。包括同時檢測5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號SNP位點、5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801131號SNP和甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號SNP位點的特異性引物對及SYBRGreenⅠ熒光染料、用于實時定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測與葉酸代謝的5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因和甲硫氨酸合成酶還原酶基因的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體葉酸代謝能力。
【專利說明】一種檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒，通過同時檢測與葉酸代謝能力密切相關(guān)的5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)上的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體葉酸代謝能力。
【背景技術(shù)】
[0002]葉酸是人體在利用糖分和氨基酸時的必要物質(zhì)，是機(jī)體細(xì)胞生長和繁殖所必須的物質(zhì)。在體內(nèi)葉酸以四氫葉酸的形式起作用，四氫葉酸在體內(nèi)參與嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和轉(zhuǎn)化。葉酸在制造核酸(核糖核酸、脫氧核糖核酸)上扮演重要的角色。葉酸幫助蛋白質(zhì)的代謝，并與維生素B12共同促進(jìn)紅細(xì)胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質(zhì)。葉酸也作為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)及其它微生物的促進(jìn)增殖因子而起作用。
[0003]葉酸對細(xì)胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的合成起著重要的作用。人體缺少葉酸可導(dǎo)致紅血球的異常，未成熟細(xì)胞的增加，貧血以及白血球減少。葉酸是胎兒生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)素。孕婦缺乏葉酸有可能導(dǎo)致胎兒出生時出現(xiàn)低體重、唇腭裂、心臟缺陷等。如果在懷孕頭3個月內(nèi)缺乏葉酸，可引起胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷，而導(dǎo)致畸形。因此，準(zhǔn)備懷孕的女性，可在懷孕前就開始每天服用400微克葉酸。
[0004]但目前已知育齡婦女服用葉酸增補(bǔ)劑時由于個人的遺傳體質(zhì)不同，存在葉酸代謝能力的差異，不同人群所需葉酸劑量不能一概而論。如服用劑量不足實際需求，達(dá)不到補(bǔ)充葉酸的效果；而盲目過量服用高濃度葉酸，會干擾孕婦的營養(yǎng)元素代謝，同樣會影響胎兒發(fā)育，超量服用葉酸也會引起藥品不良反應(yīng)，反而會對孕婦和胎兒造成嚴(yán)重不良后果。所以不同遺傳體質(zhì)的育齡婦女必須根據(jù)自身對葉酸代謝情況，有的放矢地補(bǔ)充所需要的葉酸。
[0005]因此，選取與育齡婦女孕`前/孕期以及胎兒發(fā)育所需的葉酸代謝密切相關(guān)且研究明確的一些重要基因位點，綜合利用現(xiàn)代科學(xué)研究成果，開發(fā)一項基于分子遺傳基礎(chǔ)的檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒，通過此檢測報告還可以幫助醫(yī)師針對不同體質(zhì)的育齡婦女指導(dǎo)她們補(bǔ)充適量的葉酸，具有很強(qiáng)的社會意義和廣闊的市場前景。
[0006]目前，經(jīng)證實并且機(jī)理研究清楚的與葉酸代謝密切相關(guān)的基因有:5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)。
[0007]MTHFR 為 5,10 — methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亞甲基四氫葉酸還原酶)蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸鹽。5-甲基四氫葉酸鹽可以進(jìn)一步進(jìn)入甲基傳遞通路，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接的為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個較低的水平。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因存在多種多態(tài)型，影響MTHFR活性和熱穩(wěn)定性。常見的變異包括:(1)677 C-T =MTHFR基因第677位密碼子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，編碼后酶分子中丙氨酸被纈氨酸替代，引起MTHFR熱穩(wěn)定性和活性降低，相對于正常的C/C基因型，純合子T/T基因型MTHFR活性在37攝氏度降低50%~60%，在46攝氏度降低65% ；(2) 1298 A-C:編碼后酶分子中谷氨酸被丙氨酸替代，引起MTHFR活性降低。1298 A-C與677 C-T不同的是，純合子和雜合子血漿同型半胱氨酸升高和葉酸降低均不明顯。然而，如果同時存在1298 A-C和677 C-T復(fù)合變異的雜合子，則MTHFR活性低于野生型40%。
[0008]甲硫氨酸是蛋白質(zhì)合成和一碳代謝的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR編碼)催化的，而甲硫氨酸合酶因為輔助因子維生素B12被氧化而最終失活。MTRR編碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR能夠保持甲基鈷銨III在一定水平，而甲基鈷銨III是激活蛋氨酸合成酶的輔助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR變異是造成葉酸/甲基維生素缺乏癥E型的主要原因。MTRR 66A — G多態(tài)性，導(dǎo)致蛋氨酸被異亮氨酸替代，使該酶活性降低。該基因型對同型半胱氨酸水平有顯著影響。有研究指出，MTRR基因A66G多態(tài)，血漿同型半胱氨酸增高，基因型為MTRR 66GG，MTRR 66AG的孕婦或胎兒發(fā)生神經(jīng)管畸形的危險性較正常對照組增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]基于5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)上的3個SNP位點多態(tài)性可用來評估葉酸代謝遺傳能力的基礎(chǔ)，本發(fā)明提供一種檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒。
[0010]該試劑盒包括:
檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；` 檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；
檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對；實時定量PCR反應(yīng)組件(包括ddH20、Buffer、MgCl2溶液、dNTPs、Taq酶、SYBR染料等)本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號和rsl801131號SNP位點、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點而設(shè)計，能使用SYBR Green熒光
PCR技術(shù)特異性檢測出這三個SNP位點基因型的引物對。設(shè)計這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的，并可用常規(guī)的引物合成技術(shù)進(jìn)行合成。
[0011]優(yōu)選的，檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 1-1:GAGGAGCTGACCAGTGAGGA (SEQ ID NO:1)
有義引物 1-2:GAGGAGCTGACCAGTGAGGC (SEQ ID NO:2)
反義引物 1:CITTGTGACCAITCCGGITT (SEQ ID NO:3)
優(yōu)選的，檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 2-1:AGCTGCGTGATGATGAAATAGA (SEQ ID N0:4)有義引物 2-2:AGCTGCGTGATGATGAAATAGG (SEQ ID NO:5)
反義引物 2:TATTGGCAGGTTACCCCAAA (SEQ ID NO:6)
優(yōu)選的，檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對為:
有義引物 3-1:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAT (SEQ ID NO:7)
有義引物 3-2:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAC (SEQ ID NO:8)
反義引物 3:TCACTGTTACATGCCTTGAAGTGA (SEQ ID NO:9)
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
溶液單份體積終濃度
ddH2030.2μ1
Buffer5M-1IX
MgCl24μ12mM
dNTPs4M-1200nM each
Primer (SP+AP) 1M-1+1M-1 0.4uM each
Taq0.3μ11.5U in all
SYBR Green 熒光染料 2.5μ11 X
本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
[0012]
熱循環(huán)參數(shù):
94 °C2min
94 °C45sec
60 °C45sec
72。。lmin 72 °C7min40循環(huán)
【具體實施方式】:
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
[0013]
實施例1.檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人體外周血，提取血液中的基因組DNA。
[0014]步驟2:如果要做N管，在一個1.5ml或更大體積的管子中，一次加入從ddH20到SYBR每個試劑，體積為:NX單份體積。
[0015]在冰上操作，保持試劑的活性。
[0016]因為SYBR熒光染料的緣故，要避免中強(qiáng)光照射。
[0017]在移液準(zhǔn)確的前提下，盡量縮短操作時間，減少非特異擴(kuò)增。
[0018]充分振蕩，使成分均勻。[0019]步驟3:在PCR管中加入模板DNA和步驟2已配置完成的混合溶液，振蕩，離心。
[0020]步驟4:實時定量PCR反應(yīng)
使用可檢測與葉酸代謝相關(guān)的基因的實時定量PCR檢測試劑盒，其中，包含下列引物
對:
有義引物 1-1:GAGGAGCTGACCAGTGAGGA (SEQ ID N0:1)
有義引物 1-2:GAGGAGCTGACCAGTGAGGC (SEQ ID NO:2)
反義引物 1:CTTTGTGACCATTCCGGTTT (SEQ ID NO:3)
有義引物 2-1:AGCTGCGTGATGATGAAATAGA (SEQ ID N0:4)
有義引物 2-2:AGCTGCGTGATGATGAAATAGG (SEQ ID NO:5)
反義引物 2:TATTGGCAGGTTACCCCAAA (SEQ ID NO:6)
有義引物 3-1:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAT (SEQ ID NO:7)
有義引物 3-2:CATGTACCACAGCTTGCTCAAAC (SEQ ID NO:8)
反義引物 3:TCACTGTTACATGCCTTGAAGTGA (SEQ ID NO:9)
有義引物1-1、有義引物1-2、反義引物1特異地針對檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位點多態(tài)性；`
有義引物2-1、有義引物2-2、反義引物2特異地針對檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位點多態(tài)性；
有義引物3-1、有義引物3-2、反義引物3特異地針對檢測甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點多態(tài)性；
將反應(yīng)管放入儀器上進(jìn)行熱學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)過程941:、21^11，941:、4586(3，601:、4586(3，72°C、45sec，40 循環(huán)。
[0021]62 V~92 V緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線(melting curve,或稱解離曲線，dissociation curve)。
[0022]步驟5:SNP基因型分析
熟悉實時定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識實時定量PCR儀上顯示的熒光定量曲線，根據(jù)不同序列引物和SYBR熒光染料結(jié)合的信號強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0023]
實施例2.對育齡婦女進(jìn)行葉酸代謝障礙檢測的服務(wù)步驟1:DNA提取
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師對被檢者進(jìn)行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因組DNA。
[0024]步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢者基因組DNA的0RMDL3基因上的rs7216389號SNP位點和C5基因上的rs25681號SNP位點分別進(jìn)行實時定量PCR檢測，確定這兩個SNPs位點的基因型。
[0025]步驟3:個體葉酸代謝能力的分析
通過對被檢測者SNPs基因型的分析，出具個體葉酸代謝能力的分析報告單。報告中詳細(xì)說明了被檢測者的葉酸代謝能力，并由醫(yī)師向被檢測者詳細(xì)說明和解讀個體葉酸代謝能力的分析報 告單。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測個體葉酸代謝障礙的試劑盒，其特征在于:包括同時檢測5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號SNP位點、5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801131號SNP和甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號SNP位點的特異性引物對及 SYBR Green I 熒光染料、ddH20、Buffer、MgCl2 溶液、dNTPs、Taq 酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO:1,2,3, SEQ ID NO:4、5、6，SEQ ID NO:7、8、9 所示序列的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒的組分和含量包括30.2W的ddH20、5W 的Buffer、濃度 1X4W 的MgCl2溶液、濃度200nM each 4W 的 dNTPs、濃度0.4uMeach m+m 的 Primer (SP+AP)、濃度 1.5U in all 0.3^1 的 Taq 酶、濃度 1X2.5^1 的SYBR Green I熒光染料，本試劑盒`供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667435SQ201210360042
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月25日
【發(fā)明者】楊玉華 申請人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司