專利名稱：重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2-氨基-4-甲硫基丁酸的酶法生產(chǎn)工藝，特別涉及一種在酶促合成基礎(chǔ)上發(fā)展起來的用重組工程菌的酶催化技術(shù)來生產(chǎn)2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法。
背景技術(shù)：
2-氨基-4-甲硫基丁酸(蛋氨酸)被廣泛用于醫(yī)藥、食品、飼料和化妝品等領(lǐng)域，其中飼料添加劑的用量最大。作為禽類第一限制性必需氨基酸，蛋氨酸是動物飼料里一種必不可少的添加劑，加有蛋氨酸的動物飼料可以在短時間內(nèi)幫助動物快速成長，增加瘦肉量和縮短飼養(yǎng)周期，節(jié)省大約40%的飼料。在醫(yī)藥工業(yè)中，蛋氨酸是氨基酸輸液和復(fù)合氨基酸的主要成份之一。蛋氨酸除了參與動物體內(nèi)甲基的轉(zhuǎn)移及磷的代謝和腎上腺素、膽堿和肌酸的合成外，還是合成蛋白質(zhì)和胱氨酸的原料；另外，蛋氨酸是一種很好的抗氧化劑，因為蛋氨酸分子中所含的硫原子能清除自由基，身體細胞內(nèi)的核酸膠原蛋白質(zhì)的合成都需要蛋氨酸，對服用避孕藥的婦女，服用蛋氨酸也有好處；此外蛋氨酸在食品工業(yè)、生物和化學(xué)研究、照相技術(shù)、美容和化妝品等領(lǐng)域中也有廣泛的應(yīng)用。蛋氨酸的生產(chǎn)方法分為化學(xué)法和生物法兩大類；化學(xué)法按原料分為丙烯醛法、氨基內(nèi)酯法、丙二酸酯法、酪朊水解法、固液相轉(zhuǎn)移催化法等，目前世界上主要的蛋氨酸生產(chǎn)公司均以丙烯醛法為基礎(chǔ)發(fā)展出自己蛋氨酸生產(chǎn)工藝，其余的化學(xué)方法在工藝路線、產(chǎn)品收率等方面與丙烯醛法有很大差距，現(xiàn)基本廢棄不用。近幾年來生物法在醫(yī)藥品和精細化工生產(chǎn)中發(fā)展迅速，主要有發(fā)酵法和生物催化法。發(fā)酵法生產(chǎn)蛋氨酸全部為L型，主要借助微生物具有合成各種氨基酸的能力，通過對菌株的誘變處理，選育出各種營養(yǎng)缺陷型及抗性變異株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋及阻遏，達到過量合成氨基酸的目的。蛋氨酸在蛋白質(zhì)合成中是信息核糖核酸“翻譯”成蛋白質(zhì)過程中的第一步，所以沒有蛋氨酸的存在就無法開始合成蛋白質(zhì)，就不能像其它氨基酸那樣利用相應(yīng)的遺傳缺陷型菌株經(jīng)發(fā)酵法生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)蛋氨酸收率很低，沒有工業(yè)化應(yīng)用價值。最近吉林大成集團在發(fā)酵法生產(chǎn)蛋氨酸方面有了突破性進展，該公司宣稱在未來的3年內(nèi)，大成生化集團的發(fā)酵法合成蛋氨酸生產(chǎn)工藝有望研發(fā)成功并實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。 另外一種具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的的方法為生物催化法，許多企業(yè)也對生物催化法生產(chǎn)蛋氨酸進行了大力的研究如德固賽公司報道了腈水合酶法蛋氨酸合成工藝從β_甲硫基丙醛出發(fā)，通過Strecker反應(yīng)合成2-氨基-4-甲硫基丁腈后，利用氰基耐受型腈水合酶催化水合得到2-氨基-4-甲硫基丁酰胺，最后在金屬催化劑催化下得到蛋氨酸，反應(yīng)方程式如式(I)所示
權(quán)利要求
1.一種重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法，其特征在于所述方法為以含腈水解酶的重組工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈為底物，于pH值7. (T9. O緩沖液的反應(yīng)體系中，在25 40°C、15(T200rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)O.5^2h,反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液后處理，獲得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述酶源獲得方法為構(gòu)建含SEQ ID NO :1所示腈水解酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離得到含有重組腈水解酶的濕菌體。
2.如權(quán)利要求I所述的重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始質(zhì)量終濃度為6. (T36g/L反應(yīng)體系，所述濕菌體的加入量以菌體干重計為2. 5飛.25g/L反應(yīng)體系。
3.如權(quán)利要求I所述的重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述反應(yīng)液后處理方法為反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上清液用無水乙醇攪拌萃取，置于4°C下靜置結(jié)晶，抽濾，取濾餅在真空干燥箱中干燥，即獲得2-氨基-4-甲硫基丁酸。
4.如權(quán)利要求I所述的重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述酶源的獲得方法為 (1)重組基因工程菌將來源于敏捷嗜酸菌(Acidovoraxfacilis) CCTCC NO. M209044菌株中的基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴增得到SEQ ID NO : I所示腈水解酶基因，然后構(gòu)建含腈水解酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得重組基因工程菌； (2)酶源將步驟(I)重組工程菌接種至含50μg/ml的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，獲得種子液，將種子液以體積比3%的接種量接種到新鮮的含50 μ g/ml的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600為O. 6^0. 8，再加入終濃度為O. 2mM的IPTG，37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)液，然后將誘導(dǎo)培養(yǎng)液在4°C、IOOOOrpm離心lOmin，棄去上清收集濕菌體，獲得所述酶源。
5.如權(quán)利要求4所述的重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸方法，其特征在于所述方法為以含腈水解酶的重組工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈為底物，于PH值8. OTris-HCl緩沖液的反應(yīng)體系中，在30°C、150rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)O. 5h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，棄沉淀，取上清液加入無水乙醇攪拌萃取，于4°C下靜置結(jié)晶，抽濾，取濾餅在真空干燥箱中干燥，即獲得2-氨基-4-甲硫基丁酸；所述2-氨基-4-甲硫基丁腈的初始質(zhì)量終濃度為6. Og/L應(yīng)體系，所述濕菌體的加入量以菌體干重計為2. 5g/L反應(yīng)體系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組腈水解酶制備2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法以含腈水解酶的重組工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以2-氨基-4-甲硫基丁腈為底物，于pH值7.0~9.0緩沖液的反應(yīng)體系中，在25~40℃、150~200rpm水浴搖床反應(yīng)0.5~2h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液后處理獲得2-氨基-4-甲硫基丁酸；本發(fā)明將基因工程菌用于生物催化生產(chǎn)蛋氨酸實驗，該菌可有效生物催化生產(chǎn)蛋氨酸，2h內(nèi)2-氨基-4-甲硫基丁腈轉(zhuǎn)化率達到80~100%，因此該菌在生物催化生產(chǎn)蛋氨酸的領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK102911975SQ20121033538
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月12日
發(fā)明者鄭裕國, 金利群, 柳志強, 薛亞平, 沈寅初 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)