人eif3h基因的用途及其相關藥物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了人EIF3H基因的用途及其相關藥物。本發(fā)明公開了人EIF3H基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進一步構建了人EIF3H基因小分子干擾RNA、人EIF3H基因干擾核酸構建體、人EIF3H基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人EIF3H基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中EIF3H基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義?！緦＠f明】人EIF3H基因的用途及其相關藥物【
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】[0001]本發(fā)明涉及生物【
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】，更具體地涉及人EIF3H基因的用途及其相關藥物?！?br>背景技術：
】[0002]真核翻譯起始因子3(eukaryotictranslationinitiationfactors3,eIF-3)是真核翻譯起始因子中最大最復雜的因子，在蛋白質(zhì)翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用，是與其他翻譯起始因子相互聯(lián)系的中心蛋白因子。eIF-3是一個多亞基復合體，最早是從兔網(wǎng)織紅血球中分離純化獲得。eIF-3分子量為550-700KDa，哺乳動物eIF_3包含至少12個亞基、有a(pl70,eIF3slO)、b(pll6,eIF3s9)、c(pllO)、d(p66,eIFs7)、e(p48,int6)、f(p44,p42,eIF3s4)、h(p40,eIF3s3)、i(p36)、j(p35,eIF3sl)、k(p28)、I(p69)等(FraserCS,LeeJY,MayeurGL,BushellM,DoudnaJA,HersheyJff.Thej-subunitofhumantranslationinitiationfactoreIF3isrequiredforthestablebindingofeIF3anditssubcomplexesto40Sribosomalsubunitsinvitr0.JBiolChem.2004;279(10):8946-56.)DeIF_3的作用是在翻譯起始形成43S起始復合物，使40S核糖體小亞基保持游離狀態(tài)、穩(wěn)定eIF-2與Met_tRNAi和GTP形成的三兀復合物(ValasekL,NielsenKH,ZhangF，etal.1nteractionsofEukaryoticTranslationInitiationFactor3(eIF3)SubunitNIPl/cwitheIFlandeIF5PromotePreinitiationComplexAssemblyandRegulateStartCodonSelection.MolCellBiol.2004;24(21):9437-9455.)。[0003]大量研究表明，eIF-3的多個亞基的表達在多種腫瘤的不同階段都有增高或降低的異?，F(xiàn)象，具有普遍性。eIF3a是eIF_3最大的亞基，大量研究顯示eIF3a在乳腺癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和肝癌中都有高表達的現(xiàn)象(ZongZZ,UUZ，CuiP，etal.RoleofeIF3ainregulatingcellcycleprogression.ExpCellRes.2009；315(11):1889-1894.ChenGP,BurgerMM.pl50overexpressioningastriccarcinolna:theassociationwithp530apoptosisandcellproliferation.1nlJCancer.2004;112(3):393-398.XInt6/eIF3e(p48)是鼠乳腺瘤病毒基因組的插入位點，病毒整合后可以使Int6/eIF3e被剪切，表達被剪切的eIF3e可以導致細胞瘤變，所以Int6/eIF3e與腫瘤的發(fā)生存在關系(MackDL.BoulangerCA,CauahanR,etal.ExpressionoftruncatedInt6/elF3einmammaryalveolarepitheliumleadstopersistenthyperplasiaandtumorigenesis.BreastCancerRes.2007；9(4):R42.)。eIF_3的其它亞基在腫瘤中的表達也多有異常，且多為升高，例如eIF3b在乳腺癌中過表達，eIF3c在睪丸癌中的轉(zhuǎn)錄水平增高(DongZZ,ZhangJT.1nitiationfactorelF3andregulationofmRNAtranslation,cellgrowth,andcancer.0ncolHematol.2006；59(3):169-180.),eIF3i在肝細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌及鎘誘導的腫瘤中表達增高(LeiYX,WeiL,WangM,etal.Malignanttrailsformationandabnormalexpressionofeukaryoficinitiationfactorinbronchialepithelialcellsinducedbycadmiumchloride.BiomedEnvironsc1.2008；21(4):332-338.X但eIF3f卻不同，它是一種蛋白合成的負調(diào)控因子，在胰腺腫瘤細胞和黑色素瘤細胞中的表達量是降低的，elf3f位于染色體的11ρ15.4，而在多種腫瘤中都有染色體11ρ15.4缺失的現(xiàn)象(DoldanA,ChandramouliA,ShanasR,elat.Lossoftheeukaryoticinitiationfactor3finpancreaticcancer.MolCarcinog.2008；47(3):235-244.X[0004]EIF3H是真核翻譯起始因子3其中的一個亞基，位于8q23染色體上，8q染色體的長臂在多種腫瘤中出現(xiàn)擴增現(xiàn)象。有研究表明，EIF3H在乳腺癌、前列腺癌、和肝癌中有基因擴增和高表達現(xiàn)象(JalavaSE,PorkkaKP,RauhalaHE,IsotaloJ,TammelaTL,etal.TCEBlpromotesinvasionofprostatecancercells.1ntJCancer.2009;124:95-102.ZhangL,Smit-McBrideZ,PanX,RheinhardtJ,HersheyJW(2008)Anoncogenicroleforthephosphorylatedh-subunitofhumantranslationinitiationfactoreIF3.JBiolChem283:24047-24060.SavinainenKJ,HeleniusMA,LehtonenHJ,VisakorpiT.0verexpressionofEIF3S3promotescancercellgrowth.Prostate.2006;66:1144-1150.)。Savinainen等通過RNA干擾的方法降低EIF3H在乳腺癌和前列腺癌中的表達量后，能明顯抑制乳腺癌和前列腺癌細胞的增殖能力和克隆形成能力(JBiolChem283:24047-24060.SavinainenKJ,HeleniusMA,LehtonenHJ,VisakorpiT.0verexpressionofEIF3S3promotescancercellgrowth.Prostate.2006;66:1144-1150.)。Alan等發(fā)現(xiàn)，在大腸癌細胞中，采用同樣的方法降低EIF3H基因的表達后，也能降低大腸癌細胞的增殖能力(PittmanAM,NaranjoS,JalavaSE,etal.Allelicvariationatthe8q23.3colorectalcancerrisklocusfunctionsasacis-actingregulatorofEIF3H.POLSgenet.2010;6(9):1-9.XEIF3H在多種腫瘤組織中高表達的研究表明，EIF3H可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性生物學行為密切相關。因此，EIF3H與腫瘤的發(fā)生具有一定的關系，有望成為腫瘤基因治療的一個新靶點。[0005]RNA干擾(RNAinterference,RNAi)即用核苷酸組成的短的雙鏈RNA(dsRNA)進行轉(zhuǎn)錄后基因沉默。它可高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達，導致其降解，從而引起生物體內(nèi)特異基因的沉默，使細胞表現(xiàn)出某種基因表型的缺失，是近年來新興的一種常用的研究基因功能、尋找疾病治療方法的實驗室技術。研究表明，長度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性的引起RNAi(TuschlT,ZamorePD,SharpPA,BartelDPRNA1:double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell2000;101:25-33.)D腫瘤患者雖經(jīng)化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對腫瘤發(fā)病和進展有關的基因進行干預，將能為腫瘤的治療開辟新途徑。近年來，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細胞周期相關基因、抗凋亡相關基因等的表達來抑制腫瘤進程(Uprichard,SusanLThetherapeuticpotentialofRNAinterference.FEBSLetters2005;579:5996-6007.)。[0006]為了深入研究EIF3H在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)功能，本發(fā)明選取乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤細胞模型，以RNAi為手段研究EIF3H在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明的目的在于公開與人EIF3H(eukaryotictranslationinitiationfactor3,subunitH)基因相關的治療方法及藥物，以RNA干擾(RNAi)為手段研究EIF3H基因在腫瘤細胞的存活和凋亡過程中的作用。[0008]本發(fā)明第一方面，以RNA干擾為手段，研究了EIF3H基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括:向腫瘤細胞施用一種能夠特異性抑制EIF3H基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制EIF3H蛋白的表達或活性的分子，以此來抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化和/或存活。[0009]所述腫瘤細胞選自其生長與EIF3H蛋白的表達或活性相關的腫瘤細胞。較優(yōu)的，所述腫瘤細胞選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤之任一。[0010]所述抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低EIF3H基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低EIF3H蛋白的表達或活性的劑量。進一步的，所述EIF3H基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。[0011]所述分子可選自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。[0012]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNACesiRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。[0013]所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有EIF3H基因的啟動子序列或EIF3H基因的信息序列。[0014]進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA(siRNA)。所述小干擾RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EIF3H基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序`列基本相同。所述小分子干擾RNA能特異性結(jié)合靶序列所編碼的mRNA片段，并特異性沉默人EIF3H基因的表達。[0015]進一步的，所述小干擾RNA的第一鏈序列與EIF3H基因中的靶序列基本相同。較優(yōu)的，所述EIF3H基因中的靶序列含有SEQIDNO:1-31中之任一序列。[0016]所述EIF3H基因中的靶序列即為所述小分子干擾RNA特異性沉默EIF3H基因表達時，與所述的小分子干擾RNA互補結(jié)合的mRNA片段所對應的EIF3H基因中的片段。[0017]較佳的，所述EIF3H基因來源于人。[0018]本發(fā)明第一方面還公開了一種分離的人EIF3H基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。[0019]進一步的，所述腫瘤選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤之任一。[0020]所述將分離的EIF3H基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容:其一，將EIF3H基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將EIF3H基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。[0021]所述將EIF3H基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于制備腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將EIF3H基因作為RNA干擾作用的靶標，來研制針對腫瘤細胞的藥物或制劑，從而能降低腫瘤細胞內(nèi)EIF3H基因的表達水平。[0022]所述將EIF3H基因作為藥物或制劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指:將EIF3H基因作為作用對象，對藥物或制劑進行篩選，以找到可以抑制或促進人EIF3H基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的EIF3H基因小分子干擾RNA(siRNA)即是以人EIF3H基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將EIF3H基因及其蛋白作為作用對象。[0023]所述將EIF3H基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將EIF3H基因表達產(chǎn)物作為一項腫瘤診斷指標應用于腫瘤診斷藥物的制備。[0024]所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制EIF3H基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制EIF3H蛋白的表達或活性的分子，從而降低腫瘤細胞中EIF3H基因的表達水平，達到抑制腫瘤細胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。[0025]所述通過分離的EIF3H基因制備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。[0026]所述核酸包括但不限于:反義寡核苷酸、雙鏈RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi)切酶III制備的小干擾RNACesiRNA)或者短發(fā)夾RNA(shRNA)。[0027]所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人EIF3H基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或者足夠降低人EIF3H蛋白的表達或活性的劑量。以使人EIF3H基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。[0028]采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人EIF3H基因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人EIF3H基因表達水平的物質(zhì)給藥于患者。[0029]本發(fā)明第二方面公開了一種降低腫瘤細胞中EIF3H基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:[0030]a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與EIF3H基因雜交的核苷酸序列；或者[0031]b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與EIF3H基因雜交的核苷酸序列。[0032]進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EIF3H基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與EIF3H基因中19-23個連續(xù)的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一鏈的序列與EIF3H基因中19、20或者21個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。[0033]更進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EIF3H基因中的靶序列基本相同。[0034]進一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與EIF3H基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經(jīng)加工后可成為小干擾RNA(siRNA)進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內(nèi)源EIF3H基因表達的作用。[0035]更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與EIF3H基因中的靶序列基本相同。[0036]所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與EIF3H基因中的靶序列基本相同，所述EIF3H基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默EIF3H基因表達時，被所述siRNA識別并沉默的mRNA片段所對應的EIF3H基因中的片段。[0037]較佳的，所述EIF3H基因中的靶序列含有SEQIDNO:1-31之任一序列。[0038]進一步的，所述EIF3H基因來源于人。[0039]所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。[0040]進一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA(siRNA)。更進一步的，所述小干擾RNA第一鏈的序列如SEQIDNO:43所示，具體為5’-GCUGUUGCAGAUAAACAUGAA-3’。[0041]SEQIDNO:43所示的siRNA為以SEQIDNO:30所示的序列為RNA干擾靶序列設計的、針對人EIF3H基因的小干擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互補，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內(nèi)源EIF3H基因表達的作用。[0042]進一步的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。[0043]更進一步的，所述shRNA的序列如SEQIDNO:44所示，具體為:5’-GCUGUUGCAGAUAAACAUGAAUUCAAGAGAUUCA腳UUAUCUGCAACAGC-3，。[0044]shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內(nèi)源性人EIF3H基因表達的作用。[0045]編碼本發(fā)明所述shRNA的基因片段的干擾慢病毒載體含有SEQIDNO:1-31中之任一序列及其互補序列。[0046]本發(fā)明第三方面，公開了一種EIF3H基因干擾核酸構建體，含有編碼本發(fā)明所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA[0047]所述的人EIF3H基因干擾核酸構建體可以是將編碼前述人EIF3H基因shRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述EIF3H基因干擾核酸構建體為EIF3H基因干擾慢病毒載體。[0048]本發(fā)明的EIF3H基因干擾慢病毒載體是將編碼前述EIF3H基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述EIF3H基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細胞，進而轉(zhuǎn)錄出本發(fā)明所述shRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用于特異性沉默EIF3H基因的表達。[0049]進一步的，所述EIF3H基因干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤細胞中可被檢測的標記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白(GFP)0[0050]進一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP,pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l_Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635,pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一。[0051]本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構建的人EIF3H基因干擾慢病毒載體,命名為pGCSIL-GFP-EIF3H-siRNA。[0052]本發(fā)明分離的核酸分子可用于制備預防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或膠質(zhì)瘤。[0053]本發(fā)明的EIF3H基因siRNA可用于抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療腫瘤的藥物或制劑。EIF3H基因干擾慢病毒載體則可用于制備所述EIF3H基因siRNA。當用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳動物。具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。[0054]本發(fā)明第四方面，公開了一種EIF3H基因干擾慢病毒，由前述EIF3H基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞并產(chǎn)生針對EIF3H基因的小分子干擾RNA，從而抑制乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或膠質(zhì)瘤腫瘤細胞的增殖。該EIF3H基因干擾慢病毒可用于制備預防或治療腫瘤的藥物。[0055]本發(fā)明第五方面，公開了一種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有前述的分離的核酸分子，EIF3H基因干擾核酸構建體，和/或EIF3H基因干擾慢病毒。[0056]進一步的，所述藥物組合物含有I~99wt%所述雙鏈RNA、shRNA、EIF3H基因干擾核酸構建體或EIF3H基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。[0057]在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括:濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。[0058]本發(fā)明還公開了所述藥物組合物在制備治療乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或膠質(zhì)瘤之任一的腫瘤治療藥物中的應用。[0059]該藥物組合物的應用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預防或治療對象體內(nèi)腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。進一步的，所述腫瘤選自乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤之任一。[0060]所述藥物組合物用于預防或治療對象體內(nèi)腫瘤時，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用于對象中。采用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移被抑制。進一步的，所述腫瘤的生長、增殖、復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。[0061]本發(fā)明第六方面，公開了一種用于降低腫瘤細胞中的EIF3H基因表達的試劑盒，所述試劑盒包括:存在于容器中的所述分離的核酸分子，EIF3H基因干擾核酸構建體，和/或所述的EIF3H基因干擾慢病毒。[0062]綜上所述，本發(fā)明設計了針對人EIF3H基因的31個RNAi靶點序列，構建相應的EIF3HRNAi載體，其中編碼序列SEQIDNO:30的RNAi載體pGCSIL-GFP-EIF3H_siRNA能夠顯著下調(diào)EIF3H基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(Ientivirus,簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-EIF3H-siRNA能夠靶向地將針對EIF3H基因的RNAi序列高效導入人乳腺癌MCF-7細胞、肺癌H1299細胞、結(jié)腸癌RKO細胞和膠質(zhì)瘤U87細胞，降低EIF3H基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的EIF3H基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術治療方式。[0063]本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人EIF3H基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中EIF3H基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義?！緦＠綀D】【附圖說明】[0064]圖1:pGCSIL_GFP質(zhì)粒DNA圖譜[0065]圖2:EIF3H-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細胞、肺癌H1299細胞、結(jié)腸癌RKO細胞和膠質(zhì)瘤U87細胞5天后，EIF3HmRNA的表達水平顯著降低[0066]圖3:EIF3H-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細胞5天后，引起細胞增殖抑制[0067]圖4:EIF3H-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞5天后，引起細胞增殖抑制[0068]圖5:EIF3H-RNAi慢病毒侵染人結(jié)腸癌RKO細胞5天后，引起細胞增殖抑制[0069]圖6:EIF3H-RNAi慢病毒侵染人膠質(zhì)瘤U87細胞5天后，引起細胞增殖抑制【具體實施方式】[0070]本發(fā)明涉及了一組針對人EIF3H基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人EIF3HmRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個堿基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構建表達上述siRNA的核`酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內(nèi)源EIF3H基因的表達。[0071]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人EIF3H基因的表達后可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，這一研究成果表明EIF3H基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發(fā)明人進一步合成和測試了多種針對EIF3H基因的siRNA，篩選出了可有效抑制EIF3H的表達進而抑制人乳腺癌MCF-7細胞、肺癌H1299細胞、結(jié)腸癌RKO細胞和膠質(zhì)瘤U87細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發(fā)明。[0072]本發(fā)明提供了一系列干擾人EIF3H基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構建了可特異性沉默EIF3H基因表達的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人EIF3H基因設計的小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)EIF3H基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明表明EIF3H基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNAi方式沉默EIF3H基因的表達，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。[0073]本發(fā)明的設計思路為:[0074]本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人EIF3H基因RNAi慢病毒:從Genbank中調(diào)取人EIF3H基因序列；預測siRNA位點；合成針對EIF3H基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNAOligo;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNAOligo連接，構建表達EIF3H基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix,Sigma-aIdrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T,產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默EIF3H基因的慢病毒。[0075]基于上述方法，本發(fā)明提供了31個干擾EIF3H基因的有效靶點(具體如SEQIDNO1-31所示)，構建了特異干擾人EIF3H基因的慢病毒。[0076]同時本發(fā)明還公開一種人EIF3H基因RNAi慢病毒(EIF3H-RNAi)及其制備與應用。[0077]本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低EIF3H基因在腫瘤細胞中的表達后，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，EIF3H基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學功能，EIF3H基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的EIF3H基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。[0078]下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京:科學出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。[0079]實施例1針對人EIF3H基因RNAi慢病毒的制備[0080]1.篩選針對人EIF3H基因的有效的siRNA靶點[0081]從Genbank調(diào)取EIF3H(NM_003756)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟件Genechem設計針對EIF3H基因的有效的siRNA靶點。在EIF3H基因的編碼序列(CDS)區(qū)域內(nèi)，每隔一個堿基起始獲得21個堿基的序列，表1列出了其中31條針對EIF3H基因的有效siRNA靶點序列。[0082]表1靶向于人EIF3H基因的siRNA靶點序列[0083]【權利要求】1.一種分離的人EIF3H基因在制備或篩選乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤之任一腫瘤治療藥物中的用途。2.一種降低腫瘤細胞中EIF3H基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與EIF3H基因雜交的核苷酸序列；或者b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與EIF3H基因雜交的核苷酸序列。3.如權利要求2所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EIF3H基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與EIF3H基因中的靶序列基本相同。4.如權利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述EIF3H基因的靶序列含有SEQIDNO:1-31中任一序列。5.如權利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA，該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQIDNO:43所示。6.如權利要求2或3所述分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:44所示。7.—種EIF3H基因干擾核酸構建體,含有編碼權利要求2-6任一權利要求所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA。8.如權利要求7所述EIF3H基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述EIF3H基因干擾核酸構建體為干擾慢病毒載體。9.如權利要求8所述EIF3H基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自:pLK0.1-pur。、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.1-puro-CMV-TagRFP,pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP,pLK0.l-puro-UbC-TagFP635>pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG-3xLac0>pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一。10.一種EIF3H基因干擾慢病毒，由權利要求8-9任一權利要求所述干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。11.一種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質(zhì)含有權利要求2-6任一權利要求所述分離的核酸分子，權利要求7-9任一權利要求所述EIF3H基因干擾核酸構建體，和/或權利要求10所述的EIF3H基因干擾慢病毒。12.權利要求11所述藥物組合物在制備治療乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或膠質(zhì)瘤的腫瘤治療藥物中的應用。13.一種用于降低腫瘤細胞中EIF3H基因表達的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:存在于容器中的，權利要求2-6任一權利要求所述的分離的核酸分子，權利要求7-9任一權利要求所述EIF3H基因干擾核酸構建體，和/或權利要求10所述的EIF3H基因干擾慢病毒?！疚臋n編號】C12N15/63GK103667424SQ201210314226【公開日】2014年3月26日申請日期:2012年8月29日優(yōu)先權日:2012年8月29日【發(fā)明者】韓海雄,孫琴,譚暢,翁仕強,金楊晟,瞿紅花,曹躍瓊申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司